Khảo sát hiệu lực gây chết của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 ở các mật độ bào tử khác nhau đối với sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm.. Khảo sát hiệu lực gây chết của chủng nấ
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2019- 04/2020 tại phòng thí nghiệm Động vật học và phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp HCM, cơ sở 3 Bình Dương số 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.
VẬT LIỆU
Thu thập nguồn sâu khoang tại các vườn rau tại huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang đem về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Tp HCM, cơ sở 3 Bình Dương Việc xác định loài sâu khoang được dựa vào tài liệu của Cục Bảo vệ thực vật- Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn
Thu thập nguồn rệp sáp từ các vườn mãng cầu huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh đem về phòng thí nghiệm Động vật học, khoa công nghệ sinh hoc, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương Việc xác định loài rệp sáp hại cây ăn quả được dựa vào tài liệu Cục Bảo vệ thực vật- Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn
2.2.3 Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm
Nguồn nấm kí sinh côn trùng được phân lập từ mẫu côn trùng bị nhiễm nấm kí sinh ngoài tự nhiên gồm mẫu ve sầu bị nấm kí sinh thu tại vườn cà phê, xã Sơ Pai, K’bang, tỉnh Gia Lai
Mẫu nấm kí sinh sinh côn trùng Isaria javanica Bb-T4 sau khi phân lập và làm thuần sẽ tiến hành giữ giống tại phòng thí nghiệm Động vật học
Sau đó các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Động vật học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở, cơ sở 3 Bình Dương
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 28
THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG
Các thiết bị và dụng cụ: tủ cấy vô trùng, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, nồi hấp, nồi đun, máy lắc, máy xay, becher, cân, bình serum, thùng xốp, kính hiển vi, kính soi nổi, trắc vi thị kính, buồng đếm hồng cầu, máy vortex
- Pipet (thủy tinh và pipetman)
- Que cấy (que cấy móc, que cấy vòng)
2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm
- Môi trường: Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
- Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm Lactophenol Control blue (LPCB)
- Hóa chất: Nacl, đường Glucose, cồn 960, cồn 700, Tween 80, pepton, cao nấm men
- Nguyên liệu: cám gạo, đậu tương, trấu, bột ngô, lúa, khoai tây
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
Dựa vào mục tiêu của đề tài đưa ra, chúng tối tiến hành bố trí thí nghiệm theo sơ đồ:
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 29
2.4.2 Nhân nuôi nguồn sâu khoang
Nguồn sâu khoang sau khi được thu thập đem về trường Đại học Mở- cơ sở 3 Bình Dương sẽ được tiến hành nhân nuôi nguồn bằng cách trồng rau vào các thùng xốp đặt tại vườn trường, tiếp đó thả sâu vào các thùng rau, vây lưới lại Trong quá trình nhân nuôi, sâu sẽ trải qua các giai đoạn vòng đời và bắt đầu sinh sản , tiến hành quan sát sự phát triển của sâu qua các tuổi, chọn sâu làm thí nghiệm là sâu ở tuổi trưởng thành
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Chủng nấm Isaria javanica Bb- T4 đã phân lập & giữ chủng
Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của chủng nấm Isaria javanica Bb- T4
Khảo sát hiệu lực tiêu diệt sâu khoang của chủg nấm Isaria javanica Bb- T4 Định danh các chủng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa trên hình thái bằng kĩ thuật sinh học phân tử
Khảo sát các công thức môi trường thích hợp để tạo chế phẩm tiêu diệt côn trùng từ chủng nấm Isaria javanica Bb-T4
Khảo sát đặc điểm của chủng nấm
Isaria javanica Bb- T4 khi nuôi cấy trên ba loại môi trường lỏng lắc
Khảo sát hiệu lực tiêu diệt rệp sáp của chủng nấm Isaria javanica Bb-
Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy của chủng nấm
I.javanica Bb-T4 trên ba loại môi trường lỏng tĩnh
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 30
2.4.3 Nhân nuôi nguồn rệp sáp
Rệp sáp được thu thập từ các vườn trồng mãng cầu đem về phòng thí nghiệm Động vật học trường đại học Mở TP HCM cơ sở 3 Bình Dương sẽ được tiến hành nhân nuôi bằng cách thả cho rệp kí sinh trên trái bí đỏ bỏ vào các hộp nhựa có đục lỗ Rệp sẽ bám vào vỏ ngoài của trái bí đỏ , rệp sẽ trải qua các vòng đời và bắt đầu sinh sản, trong quá trình nhân nuôi rệp cần theo dõi vệ sinh hộp đựng và bí sạch sẽ tránh để nhiễm nấm mốc làm chết rệp Tiến hành quan sát sự phát triển của rệp sáp qua các tuổi, chụp hình rệp ở các giai đoạn
2.4.4 Phương pháp hỗ trợ định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa trên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử
2.4.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm kí sinh côn trùng Bb-T4
- Quan sát nấm trên vật chủ
- Cấu trúc sinh bào tử
- Khuẩn lạc trên môi trường PDA
DNA của nấm kí sinh côn trùng được tách chiết theo hướng dẫn của bộ KIT: GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit
- Sử dụng các đoạn mồi như sau để khuếch đại vùng ITS1- ITS4:
( http://www.fungalbarcoding.org/DefaultInfo.aspx?Page=Primers)
- Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tớch phản ứng là 25àl với cỏc thành phần: 12 àl Master mix, 2àl DNA, 1,2àl mồi xuụi, 1,2àl mồi ngược và 8,6àl nước cất Cho vào máy PCR và chỉnh thời gian, nhiệt độ theo chu kì như hình 2.2 sau:
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 31
- Phản ứng PCR diễn ra trong 33 chu kì
2.4.1.4 Điện di gel chứa sản phẩm PCR
Sản phẩm DNA của nấm kí sinh côn trùng sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng PCR sẽ tiếp tục được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1% Sau khi điện di trên gel agarose
- Chạy điện di trên gel agarose: đặt khuân gel vào bể điện di TAE buffer 1X cho ngập giếng, load vào mỗi giếng 6àl DNA đó được trộn với 1àl loading buffer Load 6àl thang chuẩn vào giếng cũn lại Bật nguồn điện cho thiết bị chạy ở 70V trong 40 phút Sau đó tắt nguồn điện, lấy khuân gel ra khỏi thiết bị điện di và chụp hình gel
- Chụp hình gel đã chạy điện di
2.4.1.5 Giải trình tự DNA và xây dựng cây phát sinh loài
Sản phẩm DNA sau khi được PCR và điện di được sử dụng giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự thông qua công ty VNDAT ( http://vndat.com.vn/vn/) Sử dụng chương trình BLAST và CLUSTAL để so sánh trình tự DNA của nấm với trình tự các đoạn DNA của bộ gen của các loài nấm có trong ngân hàng gen (NCBI) và vẽ cây phả hệ để định danh vi nấm Xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.06
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 32
2.4.5 Tiến hành giữ chủng nấm kí sinh côn trùng Isaria javanica Bb-T4 và quan sát các đặc điểm hình thái của chủng nấm
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ các bước giữ giống chủng nấm Isaria javanica Bb-T4
Nấm kí sinh côn trùng được cấy trên môi trường PDA, ủ ở nhiệt độ phòng Đọc kết quả
Quan sát khuẩn lạc từ 3- 15 ngày Tùy thuộc vào tốc độ phát triển của chủng Quan sát lại các đặc điểm của nấm như: hình dáng, kích thước (đường kính, chiều dày), dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm,…), màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới,…
Ghi nhận các đặc điểm của nấm kí sinh côn trùng như sau:
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 33
2.4.1.7 Quan sát trên kính hiển vi
Cách thực hiện: lấy một lame kính sạch, trong, đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2cm và có độ dày của cạnh khung là 0.3cm Đặt khung giấy lên giữa lam kớnh rồi bơm dịch mụi trường PDA bỏn lỏng (khoảng 10à) lờn lam kớnh vào giữa khung giấy Tiếp đến cấy nấm vào giữa môi trường đã được bơm vào (cấy đơn bào tử hay cấy đầu sợi nấm) Đậy lamen lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ấm ở đây sử dụng địa petri bên trong có chứa bông gòn ẩm bên trên có đặt thnah chữ U bằng sắt) Để trong hai ngày, sau đó lấy lam kính ra, bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát Quan sát đặc điểm vi thể: dạng bào tử, tơ nấm, cuống bào tử ở vật kính ×40 Chụp ảnh khuẩn lạc trên đĩa petri và vi thể nấm trên kính
- Cần chú ý thao tác vô trùng tránh nhiễm các vi sinh vật khác làm sai lệch kết quả
- Buồng ẩm và nước cất bơm vào tạo môi trường ẩm đã được hấp khử trùng ở
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 34
2.4.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chung nấm Isaria javanica Bb- T4
2.4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4
Sơ đồ 2.3 Sơ đồ cách khảo sát sự phát triển của nấm trên các môi trường
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm chủng nấm phân lập được và môi trường dinh dưỡng khác nhau SDAY, SDAY1, PDA Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là ba đĩa nấm
- Điều kiện: nhiệt độ phòng, tối hoàn toàn
- Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính khuẩn lạc (cm) màu sắc khuẩn lạc: Sau 6, 8, 10 và 12 ngày nuôi cấy sẽ ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc bằng cách lấy trung bình đường kính trên 2 trục của khuẩn lạc theo công thức (Trịnh Thị Xuân và Lê Tuấn Anh., 2016):
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 35
Bảng 2.1 thành phần môi trường thạch
Thành phần Đơn vị tính
2.4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 trên ba loại môi trường
Sơ đồ 2.4 Sơ đồ cách khảo sát thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng nấm
❖ Thí nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần đếm, mỗi lần đến là ba ống dịch bào tử nấm
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 36
- Mật độ bào tử nấm sau 6, 8, 10, 12 ngày sau nuôi cấy của ba môi trường SDAY, SDAY1, PDA
- Mật độ bào tử/ml: được tính ở thời điểm 6, 8, 10,12 ngày sau khi nuôi cấy theo phương pháp đếm mật số bào tử trực tiếp bằng buồng đếm Thoma:
Trong đó: a: số bào tử có trong thể tích huyền phù ứng với diện tích ô nhỏ (= 1/400 mm 2 ) x độ sâu 0,1 mm b: hệ số pha loãng
- Số ô nhỏ của buồng của buồng đếm Thoma được đếm trong mỗi lần đếm dịch bào tử nấm là 5 ô nhỏ
2.4.3 Nghiên cứu ảnh hường của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 khi nuôi cấy trong ba loại môi trường lỏng tĩnh
Sơ đồ 2.5 Quy trình khảo sát khảo sát thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng nấm trong các môi trường lỏng tĩnh
Chuẩn bị chủng nấm I.javanica Bb-T4 thuần được nuôi sau 7 ngày & ba môi trường PDB, SDAY, SDAY1 lỏng tĩnh
Chia đều ba môi trường vào các bình serum (50ml/ bình)
Sau 2 ngày tiến hành cấy nấm
Theo dõi sự phát triển của nấm sau 6,
8, 10, 12 ngày ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng Đếm dịch bào tử nấm sau 6, 8, 10, 12 ngày nuôi bằng buồng đếm hồng cầu ở vật kính x40 (pha loãng nếu cần thiết) Hấp khử trùng ở 121℃/atm
Ghi chép lại số liệu và tính toán
Mật độ bào tử/cm 2 = số bào tử (bào tử/ml)/ diện tích khuẩn lạc
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 37
❖ Chỉ tiêu theo dõi: kiểm tra mật độ bào tử khi nuôi ở 3 môi trường lỏng , đếm mật độ sau 6, 8, 10, 12 NSKC
2.4.3 Nghiên cứu đặc điểm của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 khi nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc
Sơ đồ 2.6 quy trình khảo sát đặc điểm của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 khi nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc
❖ Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại, mỗi lần đếm lặp lại gồm hai bình serum
- Đếm số KLC có trong 1ml dịch/ 3 loại môi trường lỏng ở hai tốc độ lắc 150 và 200 vòng/phút sau 6 ngày nuôi lắc
- Đo kích thước KLC trên ba loại môi trường lỏng ở hai tốc độ lắc khác nhau
150 và 200 vòng/ phút sau 6 ngày nuôi lắc
Chuẩn bị chủng nấm I.javanica Bb-
T4 thuần được nuôi sau 7 ngày & ba môi trường PDB, SDAY, SDAY1 lỏng
Chia đều ba môi trường vào các bình serum (50ml/ bình)
Sau 2 ngày tiến hành cấy nấm
Theo dõi sự phát triển của nấm sau 6, 8,
10, 12 ngày ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng Đếm dịch bào tử nấm sau 6, 8, 10, 12 ngày nuôi bằng buồng đếm hồng cầu ở vật kính x40 (pha loãng nếu cần thiết) Hấp khử trùng ở 121℃/atm
Ghi chép lại số liệu và tính toán Đem nuôi lắc trong 6 ngày với hai tốc độ lắc là 200& 150 vòng/ phút
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 38
2.4.4 Khảo sát hiệu lực gây chết của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 ở các mật độ bào tử khác nhau đối với sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm
Sơ đồ 2.7 Quy trình khảo sát hiệu lực tiêu diệt sâu khoang của chủng nấm
❖ Thí nghiệm được bố trí ở nhiệt độ phòng, thời gian chiếu sáng là 8 tiếng với 3 nồng độ dịch bào tử nấm, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và nghiệm thức đối chứng phun nước
- Chỉ tiêu theo dõi tỷ lệ sống chết của sâu khoang qua các ngày
- Số liệu sau khi được thu thập và được xử lý bằng công thức Abbot (1925) để đánh giá hoạt lực của các chủng nấm ký sinh
Chuẩn bị các hộp nhựa được hấp khử trùng và rau má sạch (5g/ hộp) có lót giấy thấm
Bỏ vào mỗi hộp nhựa 20 con sâu khoang
Phun dịch bào tử nấm ở 3 nồng độ 10 7 ,
10 8 , 10 9 vào các hộp sâu (2ml/ hộp)
Theo dõi số sâu chết sau 6, 8, 10, 12 ngày ở cả ba nồng độ
Chuẩn bị chủng nấm I,javanica Bb
T4 được cấy trong ống nghiệm môi trường PDA nghiêng sau 12 ngày
Ghi chép lại số liệu và tính toán
Pha loãng các ống nghiệm vói nước cất vô trùng có bổ sung TWEEN 80 với nồng độ 10 7 , 10 8 , 10 9
Tiến hành vortex trong khoảng 30s để dịch bào tử nấm trộn đều với nhau
Sâu chết lấy ra bỏ vào các hũ nhỏ có bông gòn thấm nước để theo dõi nấm kí sinh
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 39
Trong đó: E: Hoạt lực tiêu diệt
C: Số sâu sống ở lô đối chứng
T: Số sâu sống ở lô thí nghiệm
Hình 2.2 Hình ảnh bố trí thí nghiệm phun dịch bào tử nấm lên sâu khoang
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 40
2.4.5 Khảo sát hiệu lực gây chết của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 ở các mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp trong điều kiện phòng thí nghiệm
Sơ đồ 2.8 Quy trình khảo sát hiệu lực tiêu diệt rệp sáp của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm ký sinh côn trùng Isaria javanica Bb- T4
Hình 3.1 Hình thái của nấm Isaria javanica ( a,b: hình cơ thể vật vật chủ bị nấm kí sinh; c, d, e: thể bình của chủng nấm; f: bào tử của nấm)
Khi nấm Isaria javanica Bb-T4 xâm nhiễm, cơ thể vật chủ bị bao phủ một lớp nấm màu trắng sau chuyển sang xám nhạt hoặc xám tro Theo nghiên cứu của Samson và Humber thể bỡnh dài chiều dài trung bỡnh 5,2 ± 1,1 àm và đường kớnh 1,8 ± 0,3 àm ở nơi phỡnh to Đường kớnh thể bỡnh từ đỉnh đến cổ trung bỡnh 0,4 ± 0,1 àm dạng bào tử hỡnh trụ hoặc hỡnh thoi Bào tử trưởng thành dài trung 4,3 ± 0,5 àm và đường kớnh 2,2 ± 0,2 àm Thành sợi nấm dinh dưỡng dày, trơn nhẵn trong suốt đường kớnh 1,5 ± 0,3 àm Cựng với nhau, cỏc đặc điểm hỡnh thỏi này phự hợp với cỏc loại nấm côn trùng trong chi Isaria (Paecilomyces) (Samson., 1974; Humber., 1998)
Hình 3.2 Bào tử đính trên sợi nấm (A) ,kích thước bào tử bề dọc (B), bề ngang (C) của chủng Bb- T4 trên môi trường PDA sau 30 ngày nuôi cấy
(Hình được chụp bằng kính hiển vi quang học ở vật kính x100 )
Hình 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4
Kết quả hỗ trợ định danh chủng nấm ký sinh côn trùng Bb-T4 bằng phương pháp sinh học phân tử
Phản ứng PCR của chủng nấm ký sinh côn trùng Bb-T4 với cặp mồi chuyên biệt ITS1 và ITS4 Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình 3.4 cho thấy băng Bb-T4 có khối lượng phân tử khoảng 600bp.
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 46
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 47
Hình 3.4 Phổ điện di DNA của chủng nấm ký sinh côn trùng Bb-T4
Từ kết quả thực hiện phản ứng PCR và điện di trên agarose 1%, các sản phẩm PCR sẽ được tiến hành giải trình tự để nhận diện dòng nấm ký sinh côn trùng Bb-T4 Trình tự gen này sẽ được hiệu chỉnh loại bỏ những biên dộ không ổn định sau đó được so sánh với trình tự tương đồng trong ngân hàng gen của NCBI
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 48
Hình 3.5 Cây phả hệ trình bày mối liên hệ di truyền của Bb-T4 và các chủng nấm ký sinh côn trùng với nhau bằng phần mềm MEGA 6.06 (Cây phả hệ Maximum Likehood - giá trị bootstrap với 1000 lần lặp lại)
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự với ngân hàng gen NCBI bằng công cụ Blast, Chủng Bb-T4 có tỉ lệ đồng hình lên tới 99% với Isaria javanica từ ngân hàng gen NCBI
(16) Isaria_fumosorosea_GU194181.1 (18) Cordyceps_bassiana_EU086423.1 (19) Isaria_farinosa_EU553339.1 (20) Isaria_farinosa_HQ608087.1 (15) Paecilomyces_sp_HM595502.1 (32) Isaria fumosorosea isolate NLUC-FJ765015.1 (28) Isaria fumosorosea strain CNRCB1-HM209049.1 (36) Isaria fumosorosea isolate CNZH 18S-FJ765008.1 (14) Paecilomyces_sp_AF368800.1
(31) Isaria fumosorosea isolate SKCH-1-FJ765017.1
(4) Isaria_fumosorosea_FJ765017 (21) Isaria_javanica_EF990131.1
(30) Isaria fumosorosea isolate FAFU-1-MG837716.1 (1) BbV3
(12) Paecilomyces_javanicus_AB263744.1 (29) Isaria fumosorosea culture-collection ARSEF:3302-HM209050.1 (35) Isaria fumosorosea isolate CNXN-FJ765011.1
(39) Isaria javanica strain RCEF4687-JN204422.1 (27) Isaria fumosorosea isolate IfTS02-KX057373.1 (3) Isaria_farinosa_AY624181
(5) Isaria_fumosorosea_AY624184 (40) Isaria fumosorosea strain CBS 107.10-AY624184.1 (13) Isaria_tenuipes_AY624196.1
(41) Isaria fumosorosea strain ARSEF 2679-KP737857.1 (42) Isaria fumosorosea strain PF01-N4-KR184828.1 (11) Metarhizium_robertsii_KC355183.1
(37) Paecilomyces javanicus-AB099944.1 (43) Hirsutella thompsonii- AF293844.1
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 49
KẾT QUẢ GIỮ CHỦNG NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG Isaria javanica Bb-
Isaria javanica Bb-T4 TRONG PTN
Nấm sau khi được cấy vào các bình serum sau khoảng thời gian khoảng 2 tháng, quan sát thấy nấm phát triển và phủ đều bề mặt giá thể lúa và có phát sinh bào tử
Hình 3.6 Chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 được giữ giống trong giá thể
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Isaria javanica Bb-T4
3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 khi nuôi cấy ở ba môi trường khác nhau Bảng 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4 Môi trường Đường kính khuẩn lạc qua các ngày nuôi cấy (cm)
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 50 Đối với từng hàng, trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự không khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05(P< 0,05) qua phép thử Duncan Kết quả được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
Kết quả ở bảng 3.1 thể hiện đường kính khuẩn lạc của chủng nấm Isaria sp Bb- T4 phát triển trên ba loại môi trường dinh dưỡng PDA; SDAY; SDAY1 tại các thời điểm 6, 8, 10, 12 ngày sau khi cấy (NSKC) cho thấy:
- Ở thời điểm 6 NSKC cho thấy sự biến động từ 2,10 - 3,03cm Trong đó, đường kính khuẩn lạc phát triển mạnh nhất ở môi trường PDA đạt 3,03cm và có sự khác biệt có ý nghĩa (P< 0,05) so với hai môi trường còn lại Hai môi trường SDAY và SDAY1 có tốc độ phát triển của khuẩn lạc gần bằng nhau lần lượt là SDAY (2,43cm) và SDAY1 (2,10cm)
- Đến 8 ngày thì tốc độ phát triển khuẩn lạc của nấm Isaria sp Bb- T4 tăng, trong đó môi trường PDA và SDAY có đường kính khuẩn lạc gần bằng nhau Thấp nhất là môi trường SDAY1 lần lượt qua phân tích thống kê đạt 3,83; 3,03; 2,7cm Tuy nhiên không có sự khác biệt có ý nghĩa về đường kính khuẩn lạc của nấm khi nuôi trên 3 môi trường PDA, SDAY và SDAY1
- Khi xét ở thời điểm 10 NSKC thì đường kính phát triển của khuẩn lạc nấm
Isaria sp Bb- T4 biến động từ 3,4cm - 4,23cm Môi trường PDA (4,23cm) cho tốc độ phát triển khuẩn lạc nhanh nhất có sự khác biệt có ý nghĩa với hai môi trường SDAY ( 3,53cm) và SDAY1 là 3,4cm
- Đến 12 ngày nuôi cấy, môi trường PDA và SDAY1 cho tốc độ phát triển đường kính đạt tối ưu nhất (5,13) có sự khác biệt ý nghĩa với hai môi trường còn lại SDAY1; SDAY (3,90 và 4,23cm lần lượt)
Hình 3.7 Đặc điểm khuẩn lạc của Isaria sp Bb-T4 trên 3 loại môi trường thạch sau 10 ngày nuôi cấy
SVTH: Phạm Thị Thùy Dương Trang 51
3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển bào tử của chủng nấm Isaria javanica Bb-T4
Bảng 3.2 Mật số bào tử (bt/ml) trên 3 loại môi trường thạch ở thời điểm 6,
Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 (P
