sử dụng dữ liệu vùng gen nrlsu nrssurpb1 ứng dụng hỗ trợ định danh một số loài thuộc chi nấm kí sinh côn trùng cordyceps s l

'' BỘ GIÁO DỤCVÀ ĐÀO TẠO

-SỬDỤNG DỮLIỆUVÙNGGENnrLSU-nrSSU- RPB1 ỨNGDỤNG HỖTRỢ ĐỊNH DANH MỘTSỐ

LOÀI THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CÔNTRÙNG

BỘ GIÁO DỤCVÀ ĐÀO TẠO

LÊ THỊ TUYẾTTRINH

SỬDỤNG DỮ LIỆU VÙNGGENnrLSU-nrSSU- RPB1 ỨNGDỤNG HỖTRỢ ĐỊNH DANH MỘTSỐ

LOÀI THUỘC CHI NẤMKÝ SINH CÔNTRÙNG

Tôi tên là : Lê Thị Tuyết Trinh

Ngày sinh: 24/09/1999 Nơi sinh: Đồng Tháp Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã sinh viên: 1753010277

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CNSH

Ý KIÊN CHO PHÉP BAO VỆ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP CỦA GIÁNG VIÊN HƯỚNG DÀN

Giảngviên hưứng dẫn: L£,,.Xd l£ M\.Uj^ Ăk nỉ^ ^.£ 3.£ L^.ỀlL^ ítí3UC^

Họcviên thực hiện: JuL.3ẩ^ 3.UÀj& ^ Lóp: Ằ^knAlì.Cd

Ngàysinh: j£&.l.Q^.L)A3íàH Noisinh: d^í^.dUA&p

Tên đề tài: ;£ £^ d£C^ q£a nrLlU - ftr.£iU 7 ^

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt và giảng dạy những kiến thức cơ bản và hỗ trợ, giúp đỡ em thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến giảng viên- PGS TS Lê Huyền Ái Thúy, TS Lao Đức Thuận đã luôn kề bên, quan tâm, tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em từ lúc em vào làm việc tại phòng Thầy cô đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý báu và chỉnh sửa những thiếu sót của bản thân em trong quá trình học tập tại khoa và tạo điều kiện để em có thể học tập và nghiên cứu thuận lợi

Cảm ơn các anh chị, các bạn sinh viên tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử đã hỗ trợ, giúp đỡ mỗi khi em gặp khó khăn khi thực hiện đề tài

Con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, người thân trong gia đình luôn tin tưởng, giúp đỡ, ủng hộ và động viên con mỗi khi con gặp khó khăn Mọi người đã tạo điều kiện để con có thể học tập, vững tin trên con đường mà mình chọn, là động lực và là niềm tin để con có thể vượt qua những thử thách trong cuộc sống

Cuối cùng, em chúc quý thầy cô, các anh chị, các bạn và gia đình có nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc và cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn

Bình Dương, ngày 1 tháng 6 năm 2021 SINH VIÊN THỰC HIỆN

Lê Thị Tuyết Trinh

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Nấm Cordyceps sinensis ( đông trùng hạ thảo trong tự nhiên) 4

Hình 1 2 Vị trí của cặp mồi LR0R/LR5 trên vùng gen nrLSU 10

Hình 1 3 Vị trí của cặp mồi NS1/NS4 trên vùng gen nrSSU 11

Hình 1 4 Cấu trúc vùng gen RPB1[47] 12

Hình 1 5 Mô tả chức năng của vùng CTD của gen RPB1(Theo Heidi-2009) 12

Hình 1 6 Vị trí mồi trên vùng gen RPB1[47] 12

Hình 2 1 Các thông số của phản ứng PCR……… 24

Hình 3 1 Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 bằng Annhyb………29

Hình 3 2 Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 trên công cụ BLAST 30

Hình 3 3 Kết quả kiểm tra cặp mồi NS1/NS4 bằng Annhyb 31

Hình 3 4 Kết quả kiểm tra cặp mồi NS1/NS4 trên công cụ BLAST 32

Hình 3 5 Kết quả kiểm tra cặp mồi CRPB1/RPB1Cr bằng Annhyb 33

Hình 3 6 Kết quả kiểm tra cặp mồi CRPB1/RPB1Cr trên công cụ BLAST 34

Hình 3 7 Kết quả điện di các mẫu thực nghiệm vùng gen nrLSU 36

Hình 3 8 Kết quả điện di các mẫu thực nghiệm vùng gen nrSSU 37

Hình 3 9 Kết quả điện di các mẫu thực nghiệm vùng gen RPB1 37

Hình 3 10 Tín hiệu giải trình tự gen nrLSU mẫu DL0029 ở mạch F và R 38

Hình 3 11 Kết quả BLAST trình tự gen nrLSU mạch xuôi mẫu DL0029 đã hiệu chỉnh 39

Hình 3 12 Kết quả dot plot trình tự gen nrLSU của mẫu DL0029 với trình tự tham chiếu 39

Hình 3 13 Tín hiệu giải trình tự gen nrSSU mẫu DL0029 ở mạch F và R 40

Hình 3 14 Kết quả BLAST trình tự gen nrSSU mạch xuôi mẫu DL0029 40

Hình 3 15 Kết quả dot plot trình tự gen nrSSU của mẫu DL0029 với trình tự tham chiếu 41

Hình 3 16 Tín hiệu giải trình tự gen RPB1 mẫu DL0029 ở mạch F và R 41 Hình 3 17 Kết quả BLAST trình tự gen RPB1 mạch xuôi mẫu DL0029 42 Hình 3 18 Kết quả dot plot trình tự gen RPB1 của mẫu DL0029 với trình tự tham chiếu

43 Hình 3 19 Cây phả hệ phân tử đa gen được xây dựng lần lượt bằng các phương pháp

NJ/ML/MP trên vùng gen nrLSU-nrSSU-RPB1 ( được thiết lập với bootstrap 1000 lần)

52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Các phần mềm và trang web được sử dụng 18

Bảng 2 2 Thông tin các cặp mồi khuếch đại được sử dụng 23

Bảng 2 3 Các thành phần trong một phản ứng PCR 24

Bảng 3 1 Các thông số vật lý của cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 3 2 Kết qua đo OD của các mẫu nấm thực nghiệm 35

Bảng 3 3 Kết quả chiều dài các trình tự trước và sau hiệu chỉnh 43

Bảng 3 4 Bộ dữ liệu trình tự các gen nrLSU, nrSSU, RPB1 sử dụng cho xây dựng cây phát sinh loài 44

Bảng 3 5 Kết quả đồng bộ khối dữ liệu dựng cây phát sinh loài 47

Bảng 3 6 Kết quả dò tìm mô hình tiến hóa tối thích đơn gen và đa gen 48

Bảng 3 7 Kết quả dựng cây phát sinh loài đơn gen dựa trên trình tự gen nrLSU 48

Bảng 3 8 Kết quả dựng cây phát sinh loài đơn gen dựa vào trình tự gen nrSSU 50

Bảng 3 9 Kết quả dựng cây phát sinh loài đơn gen dựa vào trình tự gen RPB1 51

Bảng 3 10 Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu cây phát sinh loài đơn và đa gen 55

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

NCBI: National Center for Biotechnology Information

RPB1: largest subunit of RNA polymerase II – tiểu đơn vị lớn nhất của RNA

polymerase II

nrLSU: nuclear ribosomal large subunit- tiểu đơn vị lớn ribosome nrSSU: nuclear ribosomal small subunit- tiểu đơn vị nhỏ ribosome

CTD: C- Terminal Domain PCR: Polymerase Chain Reation

1.2Phân loại khoa học 5

1.3 Các hoạt chất trong Cordyceps và ứng dụng 5

1.3.1 Nucleoside và bazo của nó 6

1.5.2Nhóm gen giữ nhà ( house keeping gene) trong định danh phân tử các loài nấm 10

1.6Nghiên cứu phát sinh loài[17] 13

1.6.1Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài 13

1.6.2Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh loài 13

1.7Tình hình nghiên cứu trong nước 14

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

2.1 Vật liệu 17

2.1.1 Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng 17

2.1.2 Dụng cụ-thiết bị-hóa chất 17

2.1.3 Danh mục các phần mềm và trang web trực tuyến 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Khảo sát mồi khuếch đại gen nrSSU, nrLSU, RPB1 21

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả khảo sát mồi 28

3.1.1 Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 29

3.1.2 Kết quả kiểm tra cặp mồi NS1/NS4 31

3.1.3 Kết quả kiểm tra cặp mồi CRPB1/RPB1Cr 33

3.2 Kết quả thực nghiệm 35

3.2.1 Kết quả kiểm tra chất lượng DNA thu nhận 35

3.2.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR 36

3.2.3 Kết quả giải và hiệu chỉnh trình tự 38

3.3 Kết quả định danh phân tử 44

3.3.1 Xây dựng bộ dữ liệu DNA 44

3.3.2 Kết quả dựng cây phát sinh loài 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm là một nhóm sinh vật sống đa dạng trên trái đất, được nhân rộng và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, mang lại những giá trị thiết thực cho con

người Trong đó, phải kể đến Cordyceps-chi nấm ký sinh ở côn trùng, chúng được khai

thác rất nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y dược, vì chứa chất điều hòa đáp ứng miễn dịch, ức chế tế bào ung thư[32],[25]; cải thiện chức năng phổi, thận[41] Mỗi loài nấm có những đặc tính riêng biệt cũng như giá trị dinh dưỡng khác nhau, càng xác định được tên loài và những đặc điểm nổi bật của từng loài để ứng dụng nó trong y học là yếu tố cần thiết trong giai đoạn sức khỏe con người ngày càng được quan tâm như hiện nay Vì vậy, việc xác định, định danh chính xác các loài trong chi nấm này thật sự cần thiết và có tính ứng dụng cao trong thực tiễn Hiện nay việc định danh các loại nấm thuộc chi Cordyceps này đều dựa trên kỹ thuật phân tích hình thái theo Kobayasi (1982)[28] Tuy nhiên, các loài trong chi nấm này sinh sản theo cả hai hình thức: hữu tính và vô tính; ngoài ra còn bị tác động bởi môi trường gây ra những biến dị hình thái gây nên khó khăn cho các nhà khoa

học trong định danh chi nấm Cordyceps này Cùng với sự phát triển của xã hội, sự phát

triển không ngừng của mạng Internet, công cụ tin sinh học cũng được kết hợp với sinh học phân tử được các nhà nghiên cứu áp dụng để góp phần định danh các loài thuộc chi

Cordyceps với tốc độ nhanh chóng và chính xác hơn phương pháp truyền thống định

danh hình thái Sự kết hợp giữa tin sinh học và sinh học phân tử cho phép xác định loài và hệ thống phát sinh loài dựa trên nền tảng xây dựng cây phả hệ phân tử, thể hiện mối

quan hệ giữa các loài thuộc và không thuộc chi Cordyceps Theo nghiên cứu của Sung

và cộng sự, đã tập trung nghiên cứu theo hướng các gen thuộc nhóm gen giữ nhà keeping-genes) xây dựng hệ thống phát sinh loài[36] hay các gen được sử dụng để phân tích phả hệ phân tử trong dự án AFTOL (Assembling the Fungal Tree of Life)[47]

(house-Bên cạnh đó, Tang et al., (2007) đã xây dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen

dựa trên các trình tự gen của protein (RPB2, β-tubulin) và trình tự gen của ribosome (LSU, SSU) để tiến hành phân loại các chi trong họ Sordariomycetes ( một lớp nấm thuộc

ngành nấm túi Ascomycota) cho thấy vài đặc điểm cần chú ý như sau: cây phát sinh loài dựa trên vùng gen nrSSU thể hiện mức độ tin cậy cao hơn; khi kết hợp các gen thì làm

tăng số lượng nucleotide trong bộ dữ liệu, có ích trong việc phân tích phả hệ, tạo ra hướng giải quyết cho cây phát sinh loài

Dựa trên nền tảng sự phân tích đa gen, đề tài “ Sử dụng dữ liệu vùng gen nrSSU-RPB1 ứng dụng hỗ trợ định danh một số loài thuộc chi nấm kí sinh côn

nrLSU-trùng Cordyceps S.L” được tiến hành thực hiện Trong đó phải kể đến gen nrLSU

(nuclear ribosomal large subunit- tiểu đơn vị lớn ribosome); nrSSU (nuclear ribosomal small subunit- tiểu đơn vị nhỏ ribosome); RPB1 (largest subunit of RNA polymerase-

tiểu đơn vị lớn nhất của RNA polymerase II), chứa một số vùng biến đổi có ý nghĩa để phân biệt các loài trong chi, cũng như các chi với nhau

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm

Hình 1 1 Nấm Cordyceps sinensis ( đông trùng hạ thảo trong tự nhiên)

Chi nấm này có sự phân bố rộng khắp thế giới và phần lớn trong số khoảng 400 loài[37] sinh sống chủ yếu tại châu Á (đáng chú ý là Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam và Thái Lan).Theo Kobayasi 1941, 1982 đã chia Cordyceps S.L thành 3 chi

phụ (subgenera) và 7 nhóm nhỏ (subsection) dựa vào đặc điểm hình thái giải phẫu[27],[28]

Cordyceps là một chi nấm ký sinh côn trùng[28],[34] Những giá trị về mặt y dược của chi nấm này ngày càng được các nhà khoa học nghiên cứu và khẳng định

Đại diện chi Cordyceps phải kể đến Cordyceps sinensis, hay còn gọi là đông trùng

hạ thảo Là một loại dược liệu được tìm thấy vào mùa hè ở vùng núi cao trên 5.000m ở cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam[1] Những lợi ích bất ngờ của đông trùng hạ thảo ở Trung Quốc đã được biết đến ít nhất 1000 năm, đây là nơi nấm được công nhận là một loại thuốc quý hiếm, một kho báu của quốc gia[18]

4.000-Đông trùng hạ thảo là một loại đông dược quý là dạng ký sinh của nấm Cordyceps

sinensis, là kết quả của sự kết hợp giữa động vật và thực vật Chu trình sống của đông

trùng hạ thảo gồm 2 giai đoạn: mùa đông, nấm ký sinh vào côn trùng, phát triển thành hệ sợi nấm ( giai đoạn vô tính), sử dụng nguồn dinh dưỡng từ côn trùng và giết chết côn trùng; mùa hạ, sợi nấm vô tính chuyển sang giai đoạn hữu tính, hình thành cây nấm là cơ quan chứa bào tử vô tính và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu Đó cũng là ý nghĩa của cái tên “ đông trùng hạ thảo”

1.2 Phân loại khoa học

Giới (regnum): Fungi

Phân giới (subregnum): Dikarya Ngành (phylum): Ascomycota

Phân ngành (subphylum): Pezizomycotina Lớp ( class): Sordariomycetes

Phân lớp ( subclass): Hypocreomycetidae Bộ (ordo): Hypocreales

Họ (familia): Clavicipitaceae Chi (genus): Cordyceps

1.3 Các hoạt chất trong Cordyceps và ứng dụng

Cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu chăm sóc sức khỏe của con người ngày càng cao thì giá trị của những cây thuốc tự nhiên ngày càng được quan tâm, để tìm ra những vị thuốc giúp chăm sóc sức khỏe, giá thành phải chăng nhưng vẫn đảm bảo chất lượng cho người sử dụng, áp lực để tìm ra một loại thuốc mới có lẽ khó khăn hơn nhiều so với việc khai thác, kế thừa tối đa những giá trị của những loài thuốc đã được lưu

truyền thời xa xưa Có thể nói ở thời đại hiện tại, chi Cordyceps cũng trở thành đối tượng

cho những nghiên cứu và ứng dụng vì những hoạt chất cực kỳ có lợi của nó Đa số những

loài trong chi Cordyceps luôn có những dược tính có lợi cho sức khỏe con người Một vài loài trong chi Cordyceps là các nguồn hóa chất sinh học với các tính chất sinh học

và dược học thú vị[21], như cordycepin; dạng sinh sản vô tính của Cordyceps subsessilis

(Tolypocladium inflatum) là nguồn của cyclosporin — một loại dược chất hữu ích trong

cấy ghép các bộ phận của cơ thể người, do nó kìm hãm hệ miễn dịch (thuốc ngăn chặn miễn dịch)[20].

Cụ thể, Cordyceps sinensis- một loài nấm có giá trị dinh dưỡng cao ở Trung Quốc

được sử dụng như một loại thực phẩm bổ dưỡng, một loại cây dược liệu[46] Cordyceps

sinensis đã được thị trường hóa dưới dạng chất bổ sung dinh dưỡng dưới sự kiểm soát

của FDA, do vậy nhu cầu thị trường đối với đông trùng hạ thảo ngày càng tăng cao ở nhiều quốc gia[14] C.sinenis có thể chống ung thư, chống lão hóa, có khả năng bồi bổ và

tăng cường sức khỏe, cải thiện đời sống tình dục, tăng cường khả năng miễn dịch, cũng có tác dụng tốt đối với trẻ em chậm lớn

C.militaris có nhiều lợi ích y trong y học như: hỗ trợ tình dục, kháng viêm, chống

oxy hóa, chống lão hóa, kháng khối u, chống ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, chống vi khuẩn, vi-rút, chống xơ hóa, hạ đường huyết, chống tiểu đường, chống sốt rét, trị mệt mỏi, bảo vệ thần kinh, bảo vệ gan, …[13] Tại Việt Nam, các chủng được nuôi cấy nhiều

nhất thuộc loài Cordyceps militaris, cấy trên cơ chất hoặc vào nhộng tằm Quả thể khô của loài này cho hàm lượng cordycepin và adenosine cao (thậm chí hơn loài C.sinensis)

Các nhóm hợp chất quan trọng cô lập bao gồm; nucleoside, sterol flavonoid, peptit mạch vòng, phenolic, bioxanthracenes, polyketide và alkaloid Các peptit mạch vòng chiếm

một tỷ lệ lớn trong các hợp chất được phân lập từ chi Cordyceps [33].

1.3.1 Nucleoside và bazo của nó

Nucleoside là một trong hai nhóm thành phần hiện diện chính trong chi

Cordyceps[10].Sự hiện diện của các nucleoside đã đem đến cho các loài chi Cordyceps

những hoạt tính sinh học có giá trị cao Nucleoside quan trọng và phong phú được tìm

thấy trong chi Cordyceps chính là Cordycepin, nó cũng thể hiện phạm vi hoạt tính sinh

học rộng[12] Ngoài ra, một số nucleoside khác cũng được thu nhận từ Cordyceps như:

adenine, adenosin, uracil, uridine, guanidine, guanosine, hypoxanthine, inosine, thymine, thymidine and deoxyuridine[30] Chúng thể hiện khả năng chống ung thư, chống

vi-rút, bảo vệ thần kinh, kháng viêm, kháng u và chống oxi-hóa[31] Thường thì

nucleoside được báo cáo là phân lập từ các loài thuộc chi Cordyceps như: C sinensis,

C.militaris và C.cicadae Nucleosise là một thành phần quan trọng, nhưng không phải là

duy nhất để quyết dịnh hoạt tính sinh học của chi nấm này,, mà còn bị ảnh hưởng bới rất

nhiều thành phần khác trong Cordyceps

1.3.2 Peptide vòng

Cùng với nucleoside, peptide vòng cũng là thành phần chính hiện diện trong chi

Cordyceps Lượng polypeptide từ một số loài chi Cordyceps như C sinensis[24],

C.cicadae[40], C.heteropoda[29] và C.indigotica[45],[6] Phần lớn các polypeptit được phân lập này thể hiện khả năng gây độc tế bào và kháng tế bào ung thư

5α,8αepidioxy-24(R)-methyl-1.3.4 Alkaloids

Cordyformamide, tiền chất sinh học di truyền của xanthocillin Y2, được phân lập

từ môi trường nuôi cấy của nấm kí sinh côn trùng Cordyceps brunnearubra BCC

1395[22].Theo Yang đã tách được alkaloid β-carboline trong C sinensis cũng góp phần

tạo nên tính kháng viêm của loài nấm này[44].

1.3.5 Polysaccharide

Polysaccharides cũng là một nhóm hợp chất cũng ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính sinh học của nấm Nhiều loại polysaccharid tổng hợp từ nấm có tác dụng điều hòa hệ miễn dịch, kháng tế bào ung thư, kháng oxy-hóa, hạ đường huyết, chống xơ hóa, chống

[38], [42]

1.3.6 Những thành phần khác

Ngoài những hợp chất đã nêu ở trên ( nucleoside và bazo của nó; peptide vòng; sterol; alkaloid; polysaccharide) thì một số hợp chất khác cũng được tổng hợp từ các loài nấm của chi này Các hợp chất này là các hợp chất là dẫn xuất naphthoquinone[26], chất chuyển hóa depsidone[39], chất tương tự cytochalasin[12], dihydrobenzofurans[5], bioxanthracenes[23] và isocyanides[22] Chúng có những dược tính nổi trội như: chống lại

kí sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum), vi khuẩn lao (Mycobacterium

tuberculosis), gây độc tế bào cũng như kháng tế bào ung thư

Cordyceps còn có thể sản xuất ra những chất chuyển hóa thứ cấp mang những giá

trị ứng dụng trong y học Cụ thể như cyclosporin là một sản phẩm chuyển hóa của

Cordycepin được phân lập từ nấm Tolypocladium inflatum(Wenger.et.al., 1984) Nấm này được biết là dạng sinh sản vô tính của nấm Elaphocordyceps subsessilis(=

Cordyceps subsessilis) (Hodge.et.al.,1996; Sung.et.al.,2007) Cyclosporin A là thuốc

ngăn chặn miễn dịch với thành phần dược chất là cyclosporin, có tác dụng ức chế miễn dịch, dùng để điều trị các bệnh như viêm khớp dạng thấp, bệnh vẩy nến, hội chứng thận hư… và đặc biệt dùng trong cấy ghép nội tạng để ngăn chặn thải loại mảnh ghép

1.4 Kỹ thuật PCR và giải trình tự

1.4.1 Kỹ thuật PCR

PCR là viết tắt của Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) dùng để chỉ một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại phân tử DNA hay đoạn phân tử DNA ngoài cơ thể sống, làm tăng số lượng DNA ban đầu lên đến số lượng mong muốn (Campbell và cs, năm 2010) PCR do Kary Mullis phát minh ra vào năm 1983, đến nay đã được cải tiến qua nhiều lần nghiên cứu và ngày càng được hoàn thiện PCR là phương pháp có thể xem là phương pháp tối ưu nhất trong thời kỳ mới, tạo ra vô số những bản sao theo cấp số nhân chỉ với lượng DNA ban đầu rất nhỏ

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt với rất nhiều thành phần: DNA mẫu, mồi, enzyme polymerase, dNTP, dung dịch đệm và MgCl2

PCR là phản ứng chuỗi bao gồm nhiều chu trình nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: biến tính- kéo dài- bắt cặp

PCR đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực của cuộc sống như: phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng tội phạm, nghiên cứu bệnh nhiễm trùng[4], và đặc biệt là xét nghiệm Covid 19 cũng như giúp sản xuất vacxin chống đại dịch này

1.4.2 Giải trình tự

Giải trình tự DNA được xem là quá trình xác định trình tự nucleotide cấu tạo nên phân tử DNA Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert) và phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme (Sanger) là hai phương pháp đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của bộ môn sinh học hiện đại Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gen tự động đều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger

Nguyên tắc của phương pháp Sanger là sử dụng các dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) để dừng phản ứng kéo dài mạch của DNA polymerase vì ddNTP không chứa nhóm 3’-OH dùng để tạo liên kết với nucleotide kế tiếp[2]

keeping gene) để định danh một số loài Định danh phân tử sẽ cho kết quả là một cây phả hệ phân tử, dựa vào nó, người ta có thể phân tích được: giá trị bootstap, sự phân nhóm của các loài để phân tích được mối quan hệ giữa các loài Định danh phân tử kết hợp với định danh hình thái, giải phẫu học sẽ giúp định danh chính xác đối tượng Định danh phân tử sẽ bổ sung, giải quyết những khó khăn của phương pháp định danh hình thái với tốc độ nhanh chóng và chính xác Với những loài gây khó khăn cho định danh hình thái thì định danh phân tử sẽ là một lựa chọn khá tối ưu

1.5.2 Nhóm gen giữ nhà ( house keeping gene) trong định danh phân tử các loài nấm

House keeping gene là gen được biểu hiện thường xuyên ở mức tương đối ổn định, trong điều kiện sinh lý bình thường, mã hóa cho những protein mang chức năng cơ bản của tế bào, cần thiết cho quá trình nuôi dưỡng và duy trì sự sống tế bào Nhờ những vùng gen mang trình tự bảo tồn cao này đã giúp cho quá trình định danh phân tử dựa vào house keeping gene đã được sử dụng nhiều hơn Đối với chi nấm Cordyceps nói riêng, gen nrSSU, nrLSU đã được sử dụng để nghiên cứu phát sinh loài (Smit et al., 1999;

Borneman & Hartin, 2000; Schabereiter-Gurtner.et.al.,2001)

1.5.2.1 Vùng gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit)

Hình 1 2 Vị trí của cặp mồi LR0R/LR5 trên vùng gen nrLSU

Gen nrLSU là gen mã hóa cho RNA 25S-28S của ribosome ( 25S-28S chính là tiểu

phần lớn của ribosome) chứa nhiều thông tin di truyền mang tính bảo tồn cao, được sử dụng phổ biến do có khả năng thiết kế các cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại và giải trình

tự vùng gen nrLSU của nhiều loài nấm Các trình tự mã hóa cho rRNA có tính bảo tồn

cao nên thích hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ hay xa hơn Cặp mồi LR0R/LR5 được

sử dụng trong nghiên cứu này để khuếch đại vùng gen nrLSU, cặp mồi này khuếch đại

đoạn DNA khoảng 800-1300 bp (Sonnenberg và cộng sự, 2007)

1.5.2.2 Vùng gen nrSSU (nuclear ribosomal small subunit)

Hình 1 3 Vị trí của cặp mồi NS1/NS4 trên vùng gen nrSSU

Gen nrSSU là gen mã hóa cho RNA 18S của ribosome (18S là tiểu phần nhỏ của

ribosome), đây là vùng gen có tính bảo tồn cao, nhưng tiến hóa tương đối chậm, thường được ứng dụng để nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền Vùng này có thể được khuếch đại bằng một cặp mồi phổ quát (universal primer) Cặp mồi được sử

dụng là NS1/NS4 mang tính phổ quát khuếch đại vùng gen nrSSU ở nhiều mẫu nấm ký

sinh côn trùng

1.5.2.3 Vùng gen RPB1 (largest subunit of RNA polymerase II)

RPB1 (largest subunit of RNA polymerase II – tiểu đơn vị lớn nhất của RNA

polymerase II) là vùng gen mã hóa cho tiểu phần lớn nhất của protein RNA polymerase

II Đây là enzyme xúc tác quá trình sao mã RNA từ DNA ở Eukaryote RPB1 có

C-terminal domain (CTD) bao gồm khoảng 25 lần lặp lại chuỗi trình tự hetapeptide Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7[35], có chức năng quan trọng trong sự hoạt động của enzyme RNA polymerase Năm trong các amino acid có thể bị phosphory hóa, và có hai proline có thể tồn tại ở dạng cis hoặc trans[11],[15] Trong đó Ser ở vị trí thứ 5 phosphoryl hóa bởi hoạt động kinase của TFII, kích hoạt enzyme RNA polymerase II chuyển dịch qua promotor và phiên mã Trong quá trình phiên mã, sự phosphoryl hóa CTD động đóng vai trò là dấu hiệu đánh dấu quá trình của RNA Pol II dọc theo gen, với sự phosphoryl hóa cụ thể tạo ra các vị trí liên kết tại giai đoạn đặc hiệu của phiên mã[8],[9]

Tyr1-Hình 1 4 Cấu trúc vùng gen RPB1[47]

Hình 1 5 Mô tả chức năng của vùng CTD của gen RPB1(Theo Heidi-2009)

Hình 1 6 Vị trí mồi trên vùng gen RPB1[47]

RPB1 đã được sử dụng để phân tích phả hệ của các loài động-thực vật, nấm,

tảo…Một số công trình nghiên cứu vùng gen này:

Mối quan hệ giữa các loài nấm Leishmania được nghiên cứu dựa trên vùng gen

RPB1 bởi Croan và cs, đã so sánh trình tự gen giữa DNA và RNA polymerase Hirt.et

al.,(1999) đã dùng trình tự gen RPB1 để chứng minh Microsporidia (sinh vật hoại sinh

hoặc ký sinh) có quan hệ với giới nấm Thêm nữa, Matheny P B (2002, 2004) sử dụng

trình tự gen RPB1 kết hợp với RPB2 so sánh trình tự gen nrLSU để cải thiện và mở rộng cây phát sinh loài ở nấm rơm Vào năm 2005, RPB1 được chứng minh hỗ trợ việc phân tích phả hệ chi Cortinarius[16]

1.6 Nghiên cứu phát sinh loài[17]

1.6.1 Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài

Đối với một nhà nghiên cứu sinh học phân tử, cây phả hệ phân tử là đại diện cho mối quan hệ của trình tự gen hoặc trình tự protein với trình tự bậc trên ( tổ tiên của chúng), cây phả hệ phân tử bao gồm những giao điểm kết nối bởi các nhánh Kết quả của quá trình phân tích phân tử được thể hiện qua một cây phả hệ Xây dựng một cây phả hệ phân tử gồm 5 bước cơ bản như sau: xác định được những trình tự tương đồng với trình tự đích  quyết định bộ dữ liệu gồm những trình tự đem phân tích  tải xuống những trình tự đã được chọn  sắp gióng cột trình tự  sử dụng kết quả sắp gióng cột để xây dựng một cây phả hệ phân tử

1.6.2 Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh loài 1.6.2.1 Xác định những trình tự tương đồng với trình tự đích

Trình tự đích có thể là protein hoặc acid nucleic cụ thể (DNA, RNA), cần xác định những trình tự khác có độ tương đồng cao với trình tự đích, những trình tự này có chung một nguồn gốc Chương trình cho phép tìm kiếm và tải xuống là BLAST của NCBI

1.6.2.2 Quyết định bộ dữ liệu đem đi dựng cây phả hệ

Căn cứ vào kết quả BLAST của NCBI, tiến hành xem xét kết quả của những thông số hiển thị để xem xét đưa một trình tự nào đó vào bộ dữ liệu dựng cây, chẳng hạn như: “Max score” và “Total score” càng cao thì độ tương đồng giữa trình tự đó với trình tự mục tiêu càng cao; hoặc là khi “Max score” khác biệt với “Total score” thì có nghĩa là một phần trình tự đó có ý nghĩa với trình tự đích

1.6.2.3 Tải xuống bộ dữ liệu gồm những trình tự được chọn

Những trình tự được chọn sẽ được tải xuống từ ngân hàng genbank để tiến hành sắp gióng cột

1.6.2.4 Sắp gióng cột trình tự

Sắp gióng cột là quá trình được thiết kế để đưa các khoảng trống vào trình tự để dịch chuyển bazo trở lại vị trí tương đồng tương ứng của chúng, đồng thời giúp cho dữ liệu đồng hóa về mặt độ dài và trình tự

1.6.2.5 Dựng cây phả hệ phân tử

Có 2 cách tiếp cận chính để dựng cây: theo thuật toán và tìm kiếm cây Phương pháp thuật toán sử dụng một thuật toán để ước tính một cây từ dữ liệu Phương pháp tìm kiếm cây ước tính nhiều cây, sau đó sử dụng một số tiêu chí để quyết định cây tốt nhất hoặc bộ cây tốt nhất ( Tree- Searching Methods, pp 72-73) Phương pháp thuật toán có 2 lợi ích: nhanh và đưa ra một cây bất kỳ

1.7 Tình hình nghiên cứu trong nước

Cordyceps là một đối tượng nghiên cứu cũng gọi là khá mới tại Việt Nam, nhưng

trong tương lai hứa hẹn sẽ khai thác được nhiều tiềm năng của chi nấm này Vì là một

chi nấm có nguồn gốc từ Trung Quốc, thế nên việc nghiên cứu chi nấm này tại Việt Nam chỉ là mang tính chất điều tra, thu thập dữ liệu cũng như những đặc điểm cụ thể về chi nấm này để tiến hành nhân bản và ứng dụng nó cho phù hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng tại Việt Nam

Năm 2005, Phạm Thị Vượng (Viện Bảo vệ Thực vật) và Lương Văn Hà (Vườn quốc gia Cúc Phương) cùng với các nhà nghiên cứu nấm thuộc trường đại học Quốc gia Kangwon, Hàn Quốc tiến hành có những nghiên cứu nhóm nấm ký sinh côn trùng tại vườn quốc gia Cúc Phương-Việt Nam Họ sử dụng phương pháp so sánh hình thái giải phẫu để xác định và phân loại loài Kết quả thu nhận được gồm các loài như sau:

Cordyceps sp., C nutans, C pruinosa, C specocephala và Beauveria bassiana, Beauveria sp., Gibellalus sp., Paecilomyces sp[19]

Cũng là nhóm nấm này, nhưng ở vườn quốc gia Cát Tiên, vào năm 2006, các nhà nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng của BIOTEC- Thái Lan, họ thu về 259 mẫu nấm Kết quả sơ bộ bằng định danh hình thái dựa trên hệ thống phân loại mới nhận thấy có tổng

41 loài thuộc 17 chi (Cordyceps, Gibellula, Hirsutella, Hymenostilbe, Hypocrella,

Isaria, Metarhizium, Moelleriella, Nomuraea, Ophiocordyceps, Paecilomyces, Torrubiella và Verticillium, Akanthomyces, Aschersonia, Beauveria, Conoideocrell)

Nhưng chỉ ghi nhận được 1 loài thuộc chi Cordyceps và 2 loài thuộc chi

Ophiocordyceps[3].

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng

Các mẫu nấm ký sinh côn trùng được thu nhận từ vùng núi Langbian- Lâm Đồng, đồng thời cũng được định danh hình thái bởi thầy Trương Bình Nguyên- thuộc trường Đại học Đà Lạt

2.1.2 Dụng cụ-thiết bị-hóa chất 2.1.2.1 Dụng cụ

Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử Các dụng cụ chính được sử dụng như: đèn cồn, kẹp lấy mẫu, eppendorf, pipetteman, đầu tip, ống đong, erlen, kéo, khay đựng ống nghiệm, khay đựng eppendorf…

2.1.2.2 Thiết bị

Cân phân tích 4 số Sartorius- Đức Bể điều nhiệt Bioer, N3-8 Trung Quốc Máy ly tâm điện tử- Hettich- Đức

Máy PCR 96 giếng, Benchmark, TC 9639- Mỹ Quang phổ kế

Bàn soi UV (Major Scientific, MUV 21-254/365- Đài Loan) Hệ thống điện di (Mupid@- One- Nhật)

Tủ lạnh LG

Tủ lạnh ẩm độ Sanyo Lò vi sóng Sharp Tủ hút khí độc

Máy vortex ( Vortex ZX3, Velp Ý)

2.1.2.3 Hóa chất

• Lysis buffer Tris-HCl (pH=8) 1M EDTA 0.5M

SDS 10%

NaCl 0.5M (Đã hấp) β-mercaptoethanol 99,9% Dd H2O (đã hấp)

CTAB 10%

Proteinase K 1mg/ml

• PCI Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1 v/v/v) • TE buffer

• Ethanol 70% • Isopropanol 100% • Gel agarose 1,5 % • TBE 1X

• Gelred • Ladder

2.1.3 Danh mục các phần mềm và trang web trực tuyến

Bảng 2 1 Các phần mềm và trang web được sử dụng

NCBI

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

Ngân hàng cơ sở dữ liệu để khai thác và thu

thập thông tin BLAST

quang sau khi giải trình tự, giúp hiệu chỉnh trình tự

Clustalw2 Phần mềm miễn phí (giao diện window) dùng cho việc so sánh sự tương đồng của hai hay nhiều trình

tự sinh học

Integrated DNA technologies ( IDT) Phần mềm cho phép khảo sát những thông số

của mồi

MEGA: phiên bản 6.0 (Kumar, 1993) Phần mềm miễn phí dùng để xây dựng

cây phát sinh loài theo các phương pháp Maximum Likelihood bootstrap (ML-BP), neighbor-joining (NJ), maximum parsimony

(MP)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Mẫu nấm

Tách chiết DNA nấm theo phương pháp Phenol/Chloroform

Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gen nrLSU, nrSSU, RPB1 với cặp mồi tương ứng

Giải trình tự sản phẩm PCR và hiệu chỉnh trình tự

Kiểm tra độ tương đồng của mẫu đã hiệu chỉnh bằng BLAST

Xây dựng bộ dữ liệu đơn và đa gen

Dò tìm mô hình tiến hóa tối thích

Xây dựng cây phát sinh loài (NJ, ML, MP)

Phân tích cây phát sinh loài và so sánh với nghiên cứu trước đó (Sung et al., 2007)

Kết luận tên loài cho mẫu nấm đã thực hiện

2.2.1 Khảo sát mồi khuếch đại gen nrSSU, nrLSU, RPB1

Mồi sử dụng cho phản ứng PCR phải đạt được những nguyên tắc sau: đảm bảo tính đặc hiệu ( đảm bảo vị trí bắt cặp duy nhất trên trình tự); chiều dài dao động từ 17-28 nucleotide; tổng (G+C) có thể dao động khoảng 40-60%, tránh trình tự A+T dài; nhiệt độ nóng chảy (Tm) giới hạn từ 50oC đến 65oC, Tm chênh lệch giữa hai mồi ( ▲Tm) <5oC; nhiệt độ bắt cặp (Ta) < Tm; càng ít hoặc không có hình thành cấu trúc bậc hai của mồi

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng công cụ trực tuyến BLAST để kiểm tra đoạn mồi có khả năng khuếch đại phổ quát không và khả năng khuếch đại được loài nào trên ngân hàng dữ liệu NCBI

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng Annhyb, kiểm tra kích thước sản phẩm khuếch đại, khả năng khuếch đại của mồi trên trình tự khảo sát, kiểm chứng so với những nghiên cứu đã thực hiện trước đó

2.2.2 Tiến hành thực nghiệm

Các mẫu nấm chi Cordyceps S.L được thu nhận từ vùng núi Langbian- Lâm Đồng

2.2.2.1 Tách chiết DNA của hệ sợi nấm

• Nguyên tắc

Tách chiết DNA bằng phương pháp phenol/chloroform bổ sung β-mercaptoethanol Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh SDS (Sodium dodecyl sulfate) Protein bị biến tính bởi phenol/chloroform và bị loại bỏ, DNA sẽ được tủa với ethanol lạnh

• Các bước tiến hành Bước 1: Ly giải tế bào

- Dùng que cấy vòng ( vô trùng) tiến hành lấy một phần hệ sợi nấm ( khoảng 1,5 g) hòa tan trong ống eppendorf chứa sẵn 630 µl dung dịch lysis buffer, đảo ống đều - Bổ sung thêm 70 µl proteinase K 1mg/ml, đảo ống đều

- Ủ qua đêm ở 65 oC ( có thể lắc đều ống thường xuyên , đảo nhẹ do SDS dễ tạo bọt)

Bước 2: Tách chiết DNA bộ gene bằng phương pháp Chloroform/Phenol - Tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút

- Loại phần cặn, thu dịch nổi, bổ sung 700 µl dung dịch PCI (Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol với tỷ lệ 25:24:1), lắc đều ống và ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút

- Thu dịch nổi, bổ sung 1V Chloroform, lắc đều Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút

- Thu dịch nổi, tiến hành bổ sung 1/10V dung dịch NaOAc 3M, lắc đều Bổ sung 1V isopropanol, lắc đều và ủ ở 4oC trong 2 giờ

- Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi, thu tủa - Bổ sung 1 ml ethanol 70o

- Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4 oC, loại dịch nổi - Loại bỏ ethanol và làm khô cặn tại 50 oC

- Bổ sung 50µl TE 1X để lưu mẫu

2.2.2.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận

• Nguyên tắc

Dựa vào sự hấp thụ cực đại ánh sáng tử ngoại của DNA ở bước sóng 260 nm, giá trị OD260 cho phép xác định nồng độ DNA ở trong dung dịch Ngoài ra, còn đo thêm OD280, đây là bước sóng hấp thụ cực đại của protein Đánh giá độ tinh sạch DNA qua tỷ lệ A260/ A280

+ DNA tinh sạch khi 1,8 < A260 / A280 < 2 + DNA nhiễm RNA khi A260 / A280 >2 + DNA nhiễm protein khi A260 / A280 <1,8

• Các bước tiến hành

DNA sau khi tách chiết tiến hành đo mẫu ở bước sóng 260 nm và 280 nm Tính toán giá trị A260 / A280 để xác định độ tinh sạch của DNA đã tách chiết

2.2.2.3 Phản ứng PCR( Polymerase Chain Reaction)

• Nguyên tắc

Sau khi xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo quang phổ, xác định 1,8 < A260/ A280 < 2, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen nrLSU,

nrSSU, RPB1

Bảng 2 2 Thông tin các cặp mồi khuếch đại được sử dụng

Gen Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tài liệu tham khảo

Chiều dài RPB1 CRPB1

CCNGCDATNTCRTTRTCCATRTA Castlebury et

al (2004)

23

nrLSU LR0R (F)

GTACCCGCTGAACTTAAGC Vilgalys and Sun, 1994

Phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 30 µl với cặp mồi đặc hiệu gen nrLSU (LR0R/LR5), nrSSU (NS1/NS4), RPB1 (CRPB1/RPB1Cr) với thành phần và chu trình

nhiệt được thể hiện như sau:

Dựa vào sự di chuyển của nucleic acid trong gel dưới tác động của điện trường Sự di chuyển phụ thuộc vào khối lượng phân tử, kiểu cấu trúc và nồng độ của chất cấu thành gel

• Các bước tiến hành điện di trên gel agarose Bước 1: Đổ dung dịch gel đã đun tan, để nguội vào giá có lắp sẵn lược Bước 2: Rút lược ra khi gel đã đông đặc

Bước 3: Đặt gel vào buồng điện di chứa TBE 1X Bước 4: Nạp mẫu vào giếng điện di

Bước 5: Đặt hiệu điện thế, thời gian điện di ( tránh để thời gian quá lâu, mẫu sẽ di chuyển khỏi bảng gel)

Bước 6: Đọc kết quả điện di

2.2.2.5 Hiệu chỉnh và phân tích kết quả giải trình tự

Sau khi có được lane điện di sản phẩm PCR sáng, thể hiện đúng kích thước sản phẩm, tiến hành giải trình tự 2 chiều mồi ngược và mồi xuôi Kết quả giải trình tự được hiệu chỉnh qua phần mềm Chromas 2.6.6, việc kiểm tra base trình tự ở cả 2 mạch khi tín hiệu mạch không rõ ràng là điều cần thiết Cần lưu ý, mồi ngược cần được đổi lại (reverse- complement) trước khi tiến hành so sánh Hai trình tự cần được sắp gióng cột qua Clustal W hoặc phần mềm tương tự để thể hiện điểm tương đồng, những điểm không tương đồng sẽ kiểm tra tín hiệu huỳnh quang ở 2 mạch F-R

Kết quả hiệu chỉnh trình tự được kiểm tra mức độ tương đồng với trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI (xem loài có độ tương đồng cao nhất) bằng công cụ blast và dot plot Dựa vào các thông số: Query Cover (độ bao phủ); Per Ident (độ tương đồng) càng cao thì khả năng loài khảo sát được xác định càng cao; giá trị mong đợi E-value càng thấp thì có ý nghĩa

2.2.3 Xây dựng bộ dữ liệu đơn gen và đa gen

Thu thập trình tự vùng gen nrLSU, nrSSU, RPB1 các loài nấm thuộc chi nấm

Cordyceps S.L và một số loài không thuộc chi Cordyceps để làm nhóm ngoại Các trình từ được sử dụng tham khảo từ bài báo của Sung và cộng sự, năm 2007, được xuất từ ngân hàng dữ liệu NCBI ( National Center for Biotechnology Information)

2.2.4 Đồng bộ hóa bộ dữ liệu

Sau khi bộ dữ liệu đơn gen và đa gen được tổng hợp, thực hiện sắp gióng cột, loại bỏ một số trình tự có sai khác đối với những trình tự còn lại, đảm bảo sự đồng nhất về chiều dài, tăng mức độ tương đồng và giá trị bootstrap cho cây phát sinh loài

2.2.5 Dò tìm mô hình tiến hóa

Để dựng cây Maximum Likelihood cần xác định mô hình tiến hóa phù hợp nhất thông qua chức năng Find Best DNA/Protein Models (ML) trong MEGA X Mô hình đạt điểm số BIC score thấp nhất là mô hình tốt nhất để thiết lập cây phả hệ ML.Các cây Neighbor-Joining và cây Maximum Parsimony thì sử dụng mô hình đã được mặc định của chương trình MEGA X

2.2.6 Dựng cây phả hệ phân tử

Bằng phương pháp Neighbor Joining: cây tiến hóa theo thuật toán Neighbor Joining Bằng phương pháp Maximum Parsimony: cây tiến hóa được thiết lập chạy với giá trị bootstrap 1000 lần

Bằng phương pháp Maximum Likelihood: cây tiến hóa sử dụng các thông số mô hình tiến hóa từ chức năng Test Models

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả khảo sát mồi

Bảng 3 1 Các thông số vật lý của cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu

Gen Tên mồi Trình tự (5’-3’) L %GC

Tm (oC)

▲G (kcal.mole-1) (1) (2) (3)

47,8-2,37 -9,69 -6,62

RPB1Cr (R)

RTTRTCCATRTA

23 42,8 61,4

46,8-3,47 12,91

-Chú thích: Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi, (1) là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hairpin loop, (2) là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc homodimer, và (3) là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc heterodimer)

Dựa vào các thông số được cung cấp bởi IDT, có thể phân tích được những thông số quan trọng và cần thiết trong việc đánh giá mồi có thích hợp để sử dụng cho phản ứng khuếch đại đạt được hiệu quả hay không, bao gồm những thông số như: chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp: hairpin loop, homodimer và heterodimer

Chiều dài nằm trong khoảng 18-24 bp, %GC nằm trong khoảng 45-55%; hạn chế lặp lại các base G hoặc C liên tiếp hơn 3 base để tránh giảm độ đặc hiệu của mồi; tại những vị trí đầu 3’ của mồi rất quan trọng, kiểm soát sự bắt cặp chính xác của mồi với bản mẫu, sự hiện diện của nucleotide G hoặc C sẽ an toàn bởi hình thành được 3 liên kết hydro.Tm giữa hai mồi xuôi và ngược không được cách biệt nhau quá 5oC, duy trì Tm khoảng 55-72oC

Theo hãng IDT, trị tuyệt đối của ▲G liên kết thứ cấp càng nhỏ hơn 9 kcal/mole thì liên kết sẽ càng yếu và không ảnh hưởng nhiều đến phản ứng PCR Các cấu trúc thứ cấp bao gồm cấu trúc kẹp tóc (tự bắt cặp giữa các base trong cùng một mồi), homodimer (hai base giống nhau tự bắ cặp với nhau), hetero dimer (mồi xuôi và mồi ngược tự bắt cặp với nhau) Nếu các cấu trúc này càng bền vững sẽ làm hiệu quả của PCR càng giảm Vì vậy cần kiểm tra các cấu trúc thứ cấp thông qua ▲G

3.1.1 Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5

Hình 3 1 Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 bằng Annhyb

Sử dụng phần mềm Annhyb để kiểm tra vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm của

cặp mồi này, lấy đại diện là C militaris với mã số truy cập GQ249989 cho kết quả mồi

xuôi LR0R bắt cặp tại vị trí 4-22 với độ bắt cặp 33,68% và mồi ngược LR5 bắt cặp tại