Nghiên cứu tác dụng chống viêm trên thực nghiệm

Viêm là một phần của phản ứng miễn dịch của cơ thể để chống lại các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài như tia phóng xạ, các chất hóa học, vi khuẩn. Tiến triển của phản ứng viêm là một quá trình liên tục từ những giai đoạn sớm của một phản ứng viêm cấp đến những phản ứng viêm mạn tính, theo sau đó là quá trình hàn gắn và sửa chữa tổn thương

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chất liệu nghiên cứu

Chất liệu nghiên cứu là bài thuốc KNC gồm 14 vị thuốc được sắc dưới dạng cao đặc KNC thành phần gồm:

Bảng 2.1 Thành phần cao đặc KNC

Tên vị thuốc Tên khoa học [5],[6] Hàm lượng

(gam) Độc hoạt Radix Angelicae pubescentis 10g

Phòng phong Radix Saposhnikoviae divaricatae 10g

Tần giao Radix Gentianae macrophyllae 10g

Tang ký sinh Herba Loranthi gracilifolii 10g

Ngưu tất Radix Achyranthis bidentatae 10g

Bạch thược Radix Paeoniae lactiflorae 05g

Thục địa Radix Rehmanniae glutinodea praeparata 05g

Khương hoạt Rhizoma et Radix Notopterygii 05g

Tế tân Radix et Rhizoma Asari 05g Đảng sâm Radix Codonopsis 10g Đương quy Radix Angeliace sinensis 05g

Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii 05g Đỗ trọng Cortex Eucommiae 05g

Các dược liệu trong bài thuốc được dùng dưới dạng dược liệu khô và đạt tiêu chuẩn trong Dược điển Việt Nam V [8], được chế biến theo quy định của

Y học cổ truyền và cân theo tỷ lệ như trên

Cao nước chiết suất từ bài thuốc KNC có tỷ lệ 1:1 (1g dược liệu/1mL cao), được đựng trong chai nhựa nút kín Quá trình chiết xuất được thực hiện bằng máy tự động tại khoa Dược – Bệnh viện Tuệ Tĩnh

Từ cao nước KNC có tỷ lệ 1:1 tiến hành nghiên cứu chiết xuất và bào chế cao đặc KNC; xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định tiêu chuẩn cho cao đặc KNC tại Học viện Quân Y Cao đặc KNC đạt tiêu chuẩn cơ sở được sử dụng là chế phẩm nghiên cứu, được pha loãng với nước cất để tạo ra các dung dịch thuốc thử với nồng độ khác nhau

Hộp 3 vỉ x 10 Viên bao phim

- Tá dược vừa đủ 1 viên

(Lactose, Tinh bột sắn, Povidone, Microcrystalline cellulose, Magnesium stearate, Methacrylic acid copolymer, Màu sunset yellow, Màu Tartrazine, Talc, Polyethylene glycol 6000, Ethanol 96%)

Diclofenac là thuốc kháng viêm không steroid, có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ sốt mạnh Diclofenac ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxane là những chất trung gian của quá trình viêm

Diclofenac được hấp thu nhanh hơn khi uống lúc đói Khoảng 50% liều uống được chuyển hóa qua gan lần đầu, 60% liều dùng được thải qua thận dưới dạng các chất chuyển hóa, còn một phần hoạt tính và dưới 1% ở dạng thuốc nguyên vẹn, phần còn lại thải qua mật và phân.

Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu

- Mẫu máu người tình nguyện khỏe mạnh:

+ Tiền sử khỏe mạnh, hiện tại không mắc các bệnh nội ngoại khoa cấp tính hoặc mạn tính

+ Các chỉ số công thức máu (Hồng cầu, Bạch cầu, Tiểu cầu, Hemoglobin, Hematocrit), sinh hóa máu (Ure, Creatinin, Bilirubin, Glucose máu, Triglycerid, Cholesterol, Acid uric, AST(GOT), ALT(GPT)) trong giới hạn bình thường

- Trên 18 tuổi, không phân biệt giới và nghề nghiệp

- Tự nguyện tham gia và tuân thủ quy trình nghiên cứu

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu

- Trong 6 tháng gần nhất trước khi tham gia nghiên cứu có mắc bệnh lý nội khoa, ngoại khoa cấp tính được can thiệp điều trị, không điều trị

- Đối tượng có tiền sử bệnh lý nội khoa, ngoại khoa mạn tính hiện đã điều trị ổn định

- Sử dụng thuốc y học hiện đại, thuốc y học cổ truyền, chế phẩm thuốc y học cổ truyền, thực phẩm chức năng, vitamin, trước khi tham gia nghiên cứu

- Phụ nữ có thai và đang cho con bú.

Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2019 đến hết tháng 03/2020 tại Học viện Quân Y.

Hóa chất nghiên cứu

- Các kít ELISA xét nghiệm chất trung gian gây viêm PGE2 và các cytokines tiền viêm TNF-α, IL-1β, và IL-6 trong huyết thanh

- Tế bào đại thực bào RAW 264.7 (Rockville, MD, USA)

- Môi trường nuôi cấy Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

- Một số hóa chất khác.

Dụng cụ, máy móc, thiết bị kỹ thuật

- Cân phân tích Sartorius độ chính xác 0,0001g, xuất xứ Đức

Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Đánh giá tác dụng chống viêm của cao đặc KNC qua tác dụng làm bền vững màng tế bào hồng cầu người

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp của Karunakar Kota và cộng sự (2018) [80]

Bước 1: Tiến hành lấy 2mL máu từ người tình nguyện khỏe mạnh không sử dụng các thuốc chống viêm giảm đau (NSAID) trong 14 ngày trước thí nghiệm

Bước 2: Trộn mẫu máu lấy từ người tình nguyện khỏe mạnh với cùng thể tích dung dịch Alsever vô khuẩn (2% dextrose, 0,8% sodium citrate; 0,05% citric acid và 0,42% sodium chloride trong nước)

Bước 3: Ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 4: Rửa 3 lần tế bào hồng cầu thu được sau ly tâm với isosaline

Bước 5: Thể tích máu được đo và được hoàn nguyên thành dịch treo

Bước 6: Hỗn hợp thử nghiệm chứa 1mL phosphate buffer [pH 7,4; 0,15M], 2mL hyposaline [0,36%], 0,5mL dịch treo hồng cầu người

[10%v/v] với 0,5mL dung dịch thuốc thử (mẫu thử), hoặc thuốc tham chiếu diclofenac sodium với các nồng độ khác nhau (50, 100, 250, 500, 1000,

2000 μg/mL), hoặc nước cất (mẫu chứng) (nước cất thay cho hyposaline để tạo ra sự ly giải 100%)

Bước 7: Ủ hỗn hợp thử nghiệm này ở 37 0 C trong 30 phút

Bước 8: Ly tâm hỗn hợp sau ủ

Bước 9: Tính hàm lượng huyết sắc tố trong phần dịch nổi bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 560 nm

2.6.1.3 Phương pháp đánh giá kết quả

Phần trăm ly giải màng hồng cầu:

Phần trăm ổn định màng hồng cầu:

2.6.2 Đánh giá tác dụng của cao đặc KNC lên prostaglandin E 2 (PGE2), nitric oxide (NO), và các cytokines tiền viêm trên tế bào RAW 264.7

Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong môi trường

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (môi trường nuôi tế bào DMEM) bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum) và 1% penicillin-streptomycin, nuôi cấy trong tủ ấm CO2 5% độ ẩm ở 37 0 C [67],[74],[80],[81]

2.6.2.2 Đánh giá khả năng sống của tế bào Ảnh hưởng của thuốc thử trên khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng thử nghiệm so màu MTT Các tế bào được treo trong đĩa 96 giếng ở nồng độ 1 x 10 4 tế bào/giếng, với các nồng độ khác nhau của thuốc thử trong 24 giờ Các tế bào sau đó được xử lý bằng dung dịch MTT (2 mg/mL) trong 3 giờ Sau khi loại bỏ chất nổi trên bề mặt, formazan tạo ra được cho hòa tan trong DMSO và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 540 nm [67],[74],[80],[81]

Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được xử lý trước với thuốc thử ở nhiều nồng độ (50–500 𝜇g/mL) trong 1 giờ, sau đó kích thích hoặc không trong 18 giờ với LPS (1 𝜇g/mL) Lấy mỗi 100 𝜇g/mL của phần nổi cho phản ứng với cùng thể tích của thuốc thử Griess [1% sulfanilamide, 0,1% N-(1- naphthyl)- ethylenediamine dihydrochloride, 2,5% phosphoric acid] trong 10 phút và nồng độ nitrite được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm [67],[74],[80],[81]

2.6.2.4 Đánh giá nồng độ prostaglandin E 2 (PGE2) và các cytokines tiền viêm

Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được xử lý trước với thuốc thử ở nhiều nồng độ (50–500 𝜇g/mL) trong 1 giờ, sau đó kích thích trong 18 giờ với LPS (1 𝜇g/mL) Thu lấy phần nổi, xác định nồng độ các cytokines tiền viêm IL-1𝛽, TNF-𝛼, và IL-6 bằng ELISA kits Nồng độ PGE2 được đo bằng bộ kits xét nghiệm PGE2, theo hướng dẫn của nhà sản xuất [67],[74],[80],[81].

Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và xử lý ANOVA bằng Tukey test (giá trị p < 0,05 xem là có ý nghĩa thống kê).

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Đánh giá tác dụng chống viêm của cao đặc KNC qua tác dụng làm bền vững màng tế bào hồng cầu người

Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và bảng 3.2

Bảng 3.1 Hiệu quả của cao đặc KNC và Diclofenac lên phần trăm ly giải màng hồng cầu (n = 3)

Phần trăm ly giải màng hồng cầu p (2-1)

Cao đặc KNC (1) Diclofenac sodium (2)

Không có sự khác biệt nhiều về phần trăm ly giải màng hồng cầu của cao đặc KNC so với Diclofenac sodium Ở nồng độ 2000 μg/mL của KNC, phần trăm ly giải màng hồng cầu chỉ còn 6,12%

Bảng 3.2 Hiệu quả của cao đặc KNC và Diclofenac lên phần trăm ổn định màng hồng cầu (n = 3) Nồng độ mẫu thử

Phần trăm ổn định màng hồng cầu p (2-1)

Cao đặc KNC (1) Diclofenac sodium (2)

Không có sự khác biệt nhiều về phần trăm ổn định màng hồng cầu của cao đặc KNC so với Diclofenac sodium Ở nồng độ 2000 μg/mL của KNC, phần trăm ổn định màng hồng cầu là 93,88%.

Đánh giá tác dụng của cao đặc KNC lên prostaglandin E 2 (PGE2), nitric

3.2.1 Kết quả đánh giá khả năng sống của tế bào

Kết quả được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Phần trăm tế bào sống ở các giếng thử với các nồng độ thuốc khác nhau so với giếng chứng không dùng thuốc (n = 3)

Nồng độ cao đặc KNC OD ở 540nm

Tỷ lệ % tế bào sống so với chứng p so với chứng

Cao đặc KNC ở các nồng độ 50, 100, 300 và lên tới 500 μg/mL đều không gây nên tác dụng độc đối với các tế bào RAW 264.7 (tỷ lệ % tế bào sống so với nhóm chứng ở nồng độ KNC 500 μg/mL là 95,87%)

3.2.2 Ảnh hưởng của KNC lên sự sản sinh NO của tế bào RAW được kích thích bởi LPS

Kết quả được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Phần trăm NO sản sinh bởi các tế bào RAW 264.7 xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3)

Nồng độ cao đặc KNC

% NO so với chứng 1 p so với chứng 1 p so với chứng 2

Chứng 1 0 μg/ml không 0,031 ± 0,004 - - < 0,001 Chứng 2 0 μg/ml có 0,118 ± 0,009 380,32 % < 0,001 - Thử 1 50 μg/ml có 0,074 ± 0,006 238,71 % < 0,001 < 0,01 Thử 2 100 μg/ml có 0,065 ± 0,007 210,75 % < 0,01 < 0,01 Thử 3 300 μg/ml có 0,052 ± 0,006 168,82 % < 0,01 < 0,001 Thử 4 500 μg/ml có 0,042 ± 0,005 136,56 % < 0,05 < 0,001

- So với chứng 1, chứng 2 có % nồng độ NO cao hơn gần 4 lần (bằng 380,32% so với chứng 1), khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001

- So với chứng 2, các giếng thử với các nồng độ khác nhau của cao đặc KNC có lượng sản sinh NO giảm rõ rệt, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 và p < 0,001

3.2.3 Ảnh hưởng của KNC lên sự sản sinh prostaglandin E 2 (PGE2) và các cytokines tiền viêm của tế bào RAW được kích thích bởi LPS

Kết quả được trình bày ở bảng 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8

Bảng 3.5 Nồng độ PGE2 sản sinh bởi các tế bào RAW xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3) Giếng thử

Nồng độ cao đặc KNC

Kích thích với LPS PGE2 (pg/mL) p so với chứng 1 p so với chứng 2

Chứng 1 0 μg/ml không 186,54 ± 11,13 - < 0,001 Chứng 2 0 μg/ml có 763,12 ± 55,44 < 0,001 - Thử 1 50 μg/ml có 484,39 ± 42,06 < 0,001 < 0,01 Thử 2 100 μg/ml có 366,94 ± 29,95 < 0,001 < 0,001 Thử 3 300 μg/ml có 302,88 ± 24,50 < 0,01 < 0,001 Thử 4 500 μg/ml có 224,64 ± 22,38 > 0,05 < 0,001

- So với chứng 1, chứng 2 có nồng độ PGE2 cao hơn trên 4 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001

- So với chứng 2, các giếng thử với các nồng độ khác nhau của cao đặc KNC có lượng sản sinh PGE2 giảm rõ rệt, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 và p < 0,001

Bảng 3.6 Nồng độ IL-1𝛽 sản sinh bởi các tế bào RAW xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3) Giếng thử

Nồng độ cao đặc KNC

Kích thích với LPS IL-1𝛽 (pg/mL) p so với chứng 1 p so với chứng 2

Chứng 1 0 μg/ml không 32,52 ± 3,48 - < 0,001 Chứng 2 0 μg/ml có 386,88 ± 35,99 < 0,001 - Thử 1 50 μg/ml có 264,46 ± 21,98 < 0,001 < 0,01 Thử 2 100 μg/ml có 204,94 ± 20,70 < 0,001 < 0,01 Thử 3 300 μg/ml có 159,34 ± 15,91 < 0,001 < 0,001 Thử 4 500 μg/ml có 74,33 ± 7,70 < 0,01 < 0,001

- So với chứng 1, chứng 2 có nồng độ IL-1𝛽 cao hơn gần 12 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001

- So với chứng 2, các giếng thử với các nồng độ khác nhau của cao đặc KNC có lượng sản sinh IL-1𝛽 giảm rõ rệt, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 và p < 0,001

Bảng 3.7 Nồng độ TNF-𝛼 sản sinh bởi các tế bào RAW xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3) Giếng thử

Nồng độ cao đặc KNC

TNF-𝛼 (pg/mL) p so với chứng 1 p so với chứng 2

Chứng 1 0 μg/ml không 38,12 ± 4,11 - < 0,001 Chứng 2 0 μg/ml có 505,94 ± 34,09 < 0,001 - Thử 1 50 μg/ml có 356,28 ± 31,10 < 0,001 < 0,01 Thử 2 100 μg/ml có 283,38 ± 22,20 < 0,001 < 0,001 Thử 3 300 μg/ml có 195,38 ± 13,79 < 0,001 < 0,001 Thử 4 500 μg/ml có 112,86 ± 8,61 < 0,001 < 0,001

- So với chứng 1, chứng 2 có nồng độ TNF-𝛼 cao hơn trên 13 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001

- So với chứng 2, các giếng thử với các nồng độ khác nhau của cao đặc KNC có lượng sản sinh TNF-𝛼 giảm rõ rệt, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 và p < 0,001

Bảng 3.8 Phần trăm IL-6 sản sinh bởi các tế bào RAW xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3) Giếng thử

Nồng độ cao đặc KNC

Kích thích với LPS IL-6 (pg/mL) p so với chứng 1 p so với chứng 2

Chứng 1 0 μg/ml không 34,69 ± 3,55 - < 0,001 Chứng 2 0 μg/ml có 434,79 ± 38,04 < 0,001 -

Thử 1 50 μg/ml có 342,03 ± 24,17 < 0,001 < 0,05 Thử 2 100 μg/ml có 294,94 ± 27,47 < 0,001 < 0,01 Thử 3 300 μg/ml có 215,80 ± 17,93 < 0,01 < 0,001 Thử 4 500 μg/ml có 166,51 ± 15,88 > 0,05 < 0,001

- So với chứng 1, chứng 2 có nồng độ IL-6 cao hơn trên 12 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001

- So với chứng 2, các giếng thử với các nồng độ khác nhau của cao đặc KNC có lượng sản sinh IL-6 giảm rõ rệt, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (ở nồng độ 50 μg/mL), p < 0,01 (ở nồng độ 100 μg/mL) và p < 0,001 (ở nồng độ

BÀN LUẬN

Tác dụng chống viêm của cao đặc KNC qua tác dụng làm bền vững màng tế bào hồng cầu người

màng tế bào hồng cầu người

Viêm là phản ứng của các mô sống với tổn thương, nhiễm trùng hoặc kích thích Các enzyme lysosomal được giải phóng trong quá trình viêm tạo ra một loạt các rối loạn dẫn đến tổn thương mô Hoạt động ngoài tế bào của các enzyme lysosomal được cho là có liên quan đến viêm cấp tính hoặc mãn tính Ổn định màng lysosomal rất quan trọng trong việc hạn chế phản ứng viêm bằng cách ức chế sự giải phóng các thành phần lysosomal của bạch cầu trung tính hoạt hóa Màng hồng cầu có cấu trúc tương tự màng lysosomal, do đó thuốc có tác dụng làm ổn định màng hồng cầu thông qua đánh giá làm giảm sự ly giải màng hồng cầu được xem như là có tác dụng làm ổn định màng lysosomal

Khi màng lysosome ổn định sẽ ức chế giải phóng các chất trung gian hóa học, làm ngăn chặn quá trình viêm [59] Sự sống của tế bào phụ thuộc vào tính toàn vẹn của màng tế bào Sự tiếp xúc của tế bào hồng cầu với các tác nhân đặc biệt là nhiệt độ [50],[75], pH [50] hoặc dung dịch nhược trương [75] sẽ dẫn đến sự ly giải màng tế bào và kèm theo là quá trình tan máu

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp nghiên cứu của Karunakar

Kota và cộng sự với có các tác nhân gây ly giải bằng nhiệt độ hoặc dung dịch nhược trương, hóa chất lỏng được thực hiện trong một thời gian thích hợp và thuốc nghiên cứu với các nồng độ khác nhau là một trong những mô hình dễ tiến hành, đơn giản, kinh tế trong việc phát hiện được các chất có tác dụng chống viêm

Tiến hành thí nghiệm với mẫu cao đặc ở các nồng độ khác nhau:

50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1000 μg/mL và 2000 μg/mL

Khi nồng độ tăng lên từ 50 μg/mL đến 2000 μg/mL thì phần trăm ly giải màng hồng cầu giảm dần từ 41,61% xuống 6,12%; tương ứng với phần trăm ổn định màng hồng cầu tăng dần với nồng độ 2000 μg/mL của KNC, phần trăm ổn định màng hồng cầu cao nhất là 93,88%

Cao đặc KNC thể hiện tác dụng làm giảm sự ly giải màng hồng cầu và tăng sự ổn định màng hồng cầu với mức độ tác dụng tăng theo nồng độ thuốc Tác dụng này của cao đặc KNC được đánh giá tương đương với tác dụng của Diclofenac sodium Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác có ý nghĩa thống kê khi so sánh tác dụng làm giảm sự ly giải màng hồng cầu của cao đặc KNC với Diclofenac sodium (p > 0,05)

Trong một số công trình nghiên cứu cả trên in vivo và in vitro đã chứng minh rằng acid phenolic trong Độc hoạt, Phòng phong và flavonoid có trong Cam thảo, Tang ký sinh thể hiện khả năng ổn định màng lysosome, ngoài ra saponin và tannin có trong thành phần hóa học của một số dược liệu có khả năng liên kết các cation và các phân tử sinh học khác và có khả năng ổn định màng hồng cầu [60],[40] Ổn định màng hồng cầu hay màng lysosome là quá trình toàn vẹn màng khi có tác nhân gây viêm Các thuốc chống viêm có tác dụng này do chúng có tác dụng bảo vệ protein trong màng khỏi biến tính nhiệt Trong quá trình viêm, các enzyme được giải phóng từ lysosome vào cytosol gây tổn thương các mô xung quanh, do đó gây ra viêm Hầu hết các loại thuốc chống viêm ổn định màng lysosome và ức chế quá trình viêm bằng cách hạn chế giải phóng các enzyme từ lysosome

Có một số giả thiết rằng thành phần acid phenolic và flavonoid với tác dụng chống oxy hóa cũng thể hiện khả năng ổn định màng hồng cầu Màng tế bào hồng cầu chứa lipid giàu acid béo không bão hòa, chúng thường xuyên tiếp xúc với oxy hơn các mô cơ khác và dễ bị tổn thương oxy hóa hơn Sự xâm lấn màng hồng cầu bởi các tác nhân oxy hóa có thể dẫn đến tan máu Sự gắn kết của các acid phenolic với màng hồng cầu có tác dụng ức chế peroxide hóa lipid đồng thời tăng cường tính toàn vẹn của màng trong quá trình ly giải

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao đặc KNC có tác dụng tốt, làm giảm sự ly giải màng hồng cầu, thể hiện tác dụng làm bền vững màng hồng cầu, đồng nghĩa với việc có tác dụng làm bền vững màng lysosomal, đây là cơ chế chống viêm quan trọng.

Tác dụng của cao đặc KNC lên prostaglandin E 2 (PGE2), nitric oxide (NO), và các cytokines tiền viêm trên tế bào RAW

(NO), và các cytokines tiền viêm trên tế bào RAW

4.2.1 Đánh giá khả năng sống của tế bào

Trước khi thử nghiệm các hoạt tính chống viêm in vitro của cao đặc KNC trên tế bào đại thực bào RAW, cần đánh giá khả năng sống của tế bào RAW khi được xử lý với thuốc thử là cao đặc KNC ở các nồng độ khác nhau Chỉ những nồng độ của thuốc thử KNC không gây độc cho tế bào RAW mới được dùng cho các thử nghiệm tiếp theo

Khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng thử nghiệm so màu MTT Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [88] Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào

Các tế bào được treo trong đĩa 96 giếng ở nồng độ 1 x 10 4 tế bào/giếng, với các nồng độ khác nhau của cao đặc KNC (50, 100, 300, 500 μg/mL) trong

24 giờ Giếng chứng không có cao đặc KNC Các kết quả đánh giá khả năng sống của tế bào ở các nồng độ thuốc thử được tính theo phần trăm so với chứng không có thuốc thử (KNC)

Kết quả cho thấy cao đặc KNC ở các nồng độ 50, 100, 300 và lên tới

500 μg/mL đều không gây nên tác dụng độc đối với các tế bào RAW 264.7 (tỷ lệ % tế bào sống so với chứng ở nồng độ KNC 500 μg/mL là 95,87%)

4.2.2 Tác dụng của cao đặc KNC triển khai trên mô hình giải phóng NO trên tế bào RAW 264.7 Để đánh giá khả năng kháng viêm in vitro, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế đại thực bào RAW 264,7 tiết NO khi bị kích thích bằng LPS

NO là sản phẩm của quá trình viêm, có ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch và chức năng của nhiều loại tế bào Khi hoạt hóa đại thực bào làm giải phóng nhiều chất trung gian gây viêm như cytokines và NO Đã có rất nhiều nghiên cứu từ lâu đã chỉ ra rằng NO là một trong những đích quan trọng trong nghiên cứu phát triển thuốc chống viêm [62] Như vậy, ức chế giải phóng NO là một trong những cơ chế để khẳng định thêm khả năng chống viêm của thuốc chống viêm có nguồn gốc từ dược liệu hay hóa dược

Khi triển khai mô hình giải phóng NO, đề tài lựa chọn tế bào đại thực bào RAW 264.7 là tế bào được sử dụng phổ biến trong sàng lọc hoạt tính chống viêm ban đầu của các thuốc chống viêm [31] Dòng tế bào RAW 264.7 được phân lập từ một khối u gây ra bởi virus bạch cầu Abelson murine Phản ứng trên dòng tế bào RAW 264.7 được coi là phản ứng tiềm năng trên cơ thể con người và được sử dụng để đánh giá hiệu quả hoạt tính sinh học của sản phẩm Khi xây dựng mô hình khảo sát hoạt tính kháng viêm của các thuốc chống viêm trên tế bào RAW 264.7, đại thực bào RAW 264.7 được kích thích viêm bằng LPS

LPS là thành phần màng ngoài của vi khuẩn Gram âm, đồng thời cũng là một chất kích hoạt mạnh tế bào đơn nhân và đại thực bào [50] Chúng kích hoạt sự sản sinh của nhiều cytokines gồm IL-6, IL-1, TNF-α và NO Nồng độ của LPS là một trong những yếu tố quan trọng để đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc nghiên cứu

Xét trên phương diện kinh tế, nồng độ LPS được chọn trên mô hình nghiên cứu trong đề tài của chúng tôi là 1 𝜇g/mL, đây là nồng độ nhỏ nhất gây giải phóng NO cao nhất có ý nghĩa thống kê so với mẫu trắng mà không gây độc tế bào cho các thí nghiệm tiếp theo Nồng độ này cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trên thế giới [33],[53],[71],[90],[92]

Trong một số nghiên cứu khác, nồng độ LPS tương ứng được sử dụng là 0,1 𝜇g/mL [37],[65]; nồng độ 0,5 𝜇g/mL [46]; nồng độ 5 𝜇g/mL [28] Ngoài ra, nghiên cứu của Marta [61] đã chỉ ra rằng tia nồng độ 1 𝜇g/mL LPS kích thích tế bào RAW 246.7 sản sinh ra một lượng đáng kể nhất chất trung gian hóa học TNF-α Ngoài yếu tố nồng độ, yếu tố thời gian cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới lượng NO tiết ra [24] Trong nghiên cứu của Marta cho thấy: ở các thời điểm 2h, 4h và 6h thì lượng NO giải phóng ra không đáng kể so với mẫu trắng Bắt đầu ở thời điểm 24h thì phần trăm NO sản sinh ra là 127,558% Khi tăng thời gian lên 48h và 72h thì phần trăm NO sản sinh lần lượt tăng lên là 209,076% và 198,515% Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn thời điểm kích thích LPS là 24h là thời điểm sớm nhất gây giải phóng NO đáng kể nhất so với mẫu trắng và được áp dụng hầu hết trên các mô hình của các nghiên cứu [33],[37],[46],[63],[65],[71],[90],[92]

Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao đặc KNC ở các nồng độ khác nhau

50 μg/mL, 100 μg/mL, 300 μg/mL, 500 μg/mL có tác dụng ức chế sản sinh NO của các tế bào RAW 246.7, nồng độ cao đặc KNC càng tăng thì nồng độ NO càng giảm Trên các giếng thử với các nồng độ khác nhau của cao đặc KNC có lượng sản sinh NO giảm rõ rệt so với lô chứng 2, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 và p < 0,001

Trong thành phần cao đặc KNC có các vị thuốc Phòng phong, Tang ký sinh, Cam thảo, Ngưu tất cũng đã được chứng minh trên thực nghiệm có tác dụng chống viêm rõ rệt:

Nghiên cứu của Joseph Tai và Susan Cheung [78] về “Hoạt động chống tăng sinh và chống oxy hóa của Saposhnikovia divaricata (Phòng phong - SD)” với các hoạt động chống tăng sinh, chống oxy hóa và chống viêm trong chiết xuất Phòng phong (1g/10mL ethanol 70%) IC50 (ức chế 50%) được ước tính ở độ pha loãng 1/300, 1/1400, 1/250 và 1/600, tương ứng cho các dòng tế bào K562, HL60, MCF7 và MDA-MB-468 Sự kết hợp giữa nồng độ SD không gây độc tế bào với các loại thuốc hóa trị liệu như camptothecin hoặc paclitaxel cho thấy tác dụng chống tăng sinh phụ gia trên các tế bào K562, HL60 và MCF7 và tác dụng đối kháng trên các tế bào MDA-MB-468 Ở độ pha loãng 1/2000, Phòng phong gây ra sự biệt hóa 17,5 ± 2,5% trong các tế bào HL60 dọc theo dòng bạch cầu hạt so với 2,8 ± 0,8% trong các đối chứng không được điều trị, nhưng không dọc theo dòng đơn bào,đại thực bào Ở độ pha loãng không gây độc tế bào 1/10000, 1/5000 và 1/2000, chiết xuất Phòng phong không ảnh hưởng đến sản xuất nitric oxide (NO) bởi các tế bào RAW 264.7 không kích thích, nhưng phụ thuộc vào liều lượng và giảm đáng kể sản xuất NO bởi lipopolysaccharide (LPS) đã kích hoạt đại thực bào RAW 264.7; Người ta kết luận rằng chiết xuất ethanol của Phòng phong có đặc tính chống tăng sinh mạnh mẽ chống lại một số dòng tế bào khối u ở người, một đặc tính biệt hóa bạch cầu hạt nhẹ trên các tế bào HL60, và các đặc tính chống oxy hóa, chống viêm và bảo vệ mạnh mẽ trên các tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS

Tang ký sinh vị đắng tính bình quy kinh Can, Thận, với nhiều thành phần hóa học như avicularin, quercetin có tác dụng chữa đau xương khớp Võ Vân Anh và cộng sự năm 2012 nghiên cứu tác dụng của avicularin có trong dược liệu Tang ký sinh trên mô hình in vitro cho thấy avicularin thể hiện hoạt tính chống viêm bằng cách ức chế sản xuất NO, PGE2 và ức chế giải phóng các cytokines [85] Ngoài ra, tác dụng chống viêm của Tang ký sinh cũng được chứng minh qua nghiên cứu Taguchi và cộng sự [79] về tác dụng chống viêm của quercetin trên nhiều mô hình thử nghiệm khác nhau trên chuột lang, chuột cống và chuột nhắt Kết quả cho thấy quercetin khi dùng đường uống với các mức liều 50, 100 và 200 mg/kg có tác dụng giảm phù ở chân chuột gây ra do các tác nhân khác nhau như carrageenan, dextran, histamine, serotonin và bradykinin Ở liều 200 mg/kg, chất này còn ức chế phù do nước nóng (54℃)

Flavonoid được tìm thấy trong cây Cam thảo cũng cho tác dụng chống oxy hóa và ức chế giải phóng NO Flavonoid có tác dụng ức chế enzyme quan trọng trong quá trình tổng hợp NO, qua đó làm ức chế giải phóng NO từ đại thực bào trong quá trình viêm [41] Ngoài ra, trong nghiên cứu của Eun Myoung Shin, Hong Yu Zhou và cộng sự [72] về “Tác dụng chống viêm của Glycyrol phân lập từ Glycyrrhiza uralensis (Cam thảo) trong các đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS” cho kết quả là Glycyrol ức chế sản xuất nitric oxide (NO) Khi hiệu chỉnh liều lượng của Glycyrol tăng dần thì nồng độ NO giảm dần thông qua sự giảm Inducible nitric oxide synthase (iNOS) và cyclooxygenase-2 (COX-2) của tế bào RAW được kích thích bởi LPS

Nghiên cứu Tang và cộng sự [77] đã đánh giá hoạt tính chống viêm của saponin trong cây Ngưu tất chống lại sự sản sinh NO do lipopolysacarit trong RAW 264.7 (dòng tế bào đại thực bào bạch cầu đơn nhân của chuột) và các hợp chất này ức chế đáng kể việc sản xuất NO, ức chế tác dụng làm giãn mạch, giảm tính thấm thành mạch, giảm sản xuất các PG, ức chế phản ứng viêm