Nghiên cứu tác dụng chống viêm trên thực nghiệm

Viêm là một phần của phản ứng miễn dịch của cơ thể để chống lại các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài như tia phóng xạ, các chất hóa học, vi khuẩn. Tiến triển của phản ứng viêm là một quá trình liên tục từ những giai đoạn sớm của một phản ứng viêm cấp đến những phản ứng viêm mạn tính, theo sau đó là quá trình hàn gắn và sửa chữa tổn thương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

HỌC VIỆN Y DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM

HOÀNG ANH QUí

Nghiên cứu tác dụng chống viêm của cao đặc knc QUA THử NGHIệM TRÊN HồNG CầU NGƯờI Và ĐạI THựC BàO RAW 264.7

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI – 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

HỌC VIỆN Y DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM

HOÀNG ANH QUí

Nghiên cứu tác dụng chống viêm của cao đặc knc QUA THử NGHIệM TRÊN HồNG CầU NGƯờI Và ĐạI THựC BàO RAW 264.7

LỜI CẢM ƠN

Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới:

Đảng ủy, Ban Giám đốc, Phòng đào tạo Sau Đại học, các Bộ môn, Khoa phòng Học viện Y dược học cổ truyền Việt Nam, là nơi trực tiếp đào tạo và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đậu Xuân Cảnh - người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Đốc, Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y, đã quan tâm, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong việc nghiên cứu, thu thập, hoàn thiện số liệu để hoàn thành đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy, các cô trong Hội đồng thông qua đề cương luận văn đã cho tôi nhiều ý kiến quý báu trong quá trình hoàn thiện luận văn này

Cảm ơn các bạn đồng nghiệp, bạn bè, gia đình đã động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Mặc dù đã cố gắng rất nhiều, nhưng luận văn không tránh khỏi những thiếu sót; tác giả rất mong nhận được sự thông cảm, chỉ dẫn, giúp đỡ và đóng góp ý kiến của các nhà khoa học, của quý thầy cô, các cán bộ quản lý và các

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Đậu Xuân Cảnh Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Hà Nội, ngày tháng năm

Người viết cam đoan

Hoàng Anh Quý

Colony Forming Unit

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Môi trường nuôi tế bào) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Các thành phần của chất nền ngoại bào Fetal bovine serum (Huyết thanh bò) Promyelocytic (Tế bào bạch cầu cấp tính) Leukemia (Tế bào ung thư máu)

LD50 Lethal dose 50% (Liều chết 50%)

NK Natural killer cell (Tế bào diệt tự nhiên) NO Nitric oxide

NF-kB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B

NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drug (thuốc chống viêm giảm đau) OD Optical Density (Mật độ quang)

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về viêm và các yếu tố viêm 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Nguyên nhân gây viêm 3

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của viêm và các thành phần tham gia vào phản ứng viêm 3 1.2 Thuốc chống viêm và cơ chế tác dụng của thuốc chống viêm 10

1.2.1 Định nghĩa 10

1.2.2 Cơ chế tác dụng của thuốc chống viêm 11

1.3 Một số mô hình in vitro nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc 12

1.3.1 Nghiên cứu tác dụng chống viêm trên mô hình ổn định màng hồng cầu 12

1.3.2 Mô hình ức chế giải phóng NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 13

1.3.3 Mô hình đánh giá sự ức chế biến tính của protein 15

1.3.4 Mô hình đánh giá sự ức chế enzyme cyclooxygenas và

2.1 Chất liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Cao đặc KNC 23

2.1.2 Thuốc đối chứng Diclofenac 24

2.2 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu 25

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu 25

2.3 Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu 26

2.4 Hóa chất nghiên cứu 26

2.5 Dụng cụ, máy móc, thiết bị kỹ thuật 26

2.6 Phương pháp nghiên cứu 26

2.6.1 Đánh giá tác dụng chống viêm của cao đặc KNC qua tác dụng làm bền vững màng tế bào hồng cầu người 26

2.6.2 Đánh giá tác dụng của cao đặc KNC lên prostaglandin E2 (PGE2), nitric oxide (NO), và các cytokines tiền viêm trên tế bào RAW 27

2.7 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Đánh giá tác dụng chống viêm của cao đặc KNC qua tác dụng làm bền vững màng tế bào hồng cầu người 29

3.2 Đánh giá tác dụng của cao đặc KNC lên prostaglandin E2 (PGE2), nitric oxide (NO), và các cytokines tiền viêm trên tế bào RAW 31

3.2.1 Kết quả đánh giá khả năng sống của tế bào 31

3.2.2 Ảnh hưởng của KNC lên sự sản sinh NO của tế bào RAW được kích thích bởi LPS 32

3.2.3 Ảnh hưởng của KNC lên sự sản sinh prostaglandin E2 (PGE2) và các cytokines tiền viêm của tế bào RAW được kích thích bởi LPS 33

Chương 4 BÀN LUẬN 37

4.1 Tác dụng chống viêm của cao đặc KNC qua tác dụng làm bền vững màng tế bào hồng cầu người 37 4.2 Tác dụng của cao đặc KNC lên prostaglandin E2 (PGE2), nitric oxide (NO), và các cytokines tiền viêm trên tế bào RAW 39

4.2.1 Đánh giá khả năng sống của tế bào 39 4.2.2 Tác dụng của cao đặc KNC triển khai trên mô hình giải phóng NO trên tế bào RAW 264.7 40 4.2.3 Ảnh hưởng của KNC lên sự sản sinh prostaglandin E2 (PGE2) của tế bào RAW được kích thích bởi LPS 44 4.2.4 Ảnh hưởng của KNC lên sự sản sinh các cytokines tiền viêm của tế bào RAW

Bảng 3.3 Phần trăm tế bào sống ở các giếng thử với các nồng độ thuốc khác nhau so với giếng chứng không dùng thuốc (n = 3) 31 Bảng 3.4 Phần trăm NO sản sinh bởi các tế bào RAW 264.7 xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3) 32 Bảng 3.5 Nồng độ PGE2 sản sinh bởi các tế bào RAW xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3) 33 Bảng 3.6 Nồng độ IL-1𝛽 sản sinh bởi các tế bào RAW xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3) 34 Bảng 3.7 Nồng độ TNF-𝛼 sản sinh bởi các tế bào RAW xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3) 35 Bảng 3.8 Phần trăm IL-6 sản sinh bởi các tế bào RAW xử lý với các nồng độ thuốc khác nhau so với chứng (n = 3) 36

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Cơ chế tác dụng của thuốc chống viêm 11

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm là một phần của phản ứng miễn dịch của cơ thể để chống lại các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài như tia phóng xạ, các chất hóa học, vi khuẩn [65] Tiến triển của phản ứng viêm là một quá trình liên tục từ những giai đoạn sớm của một phản ứng viêm cấp đến những phản ứng viêm mạn tính, theo sau đó là quá trình hàn gắn và sửa chữa tổn thương [21] Mặc dù có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể, phản ứng viêm cũng là nguyên nhân dẫn đến một loạt các bệnh mạn tính như viêm khớp dạng thấp, viêm ruột, hen suyễn… Viêm cũng là một trong các nguyên nhân phổ biến nhất gây tử vong trên toàn thế giới Nhờ có sự tiến bộ của y học, chúng ta đã biết sâu hơn về cơ chế gây viêm, từ đó giúp tìm ra các đích tác dụng của thuốc và hình thành những hướng đi mới trong việc phát triển thuốc

Hiện nay, có nhiều thuốc chống viêm đang được sử dụng, đặc biệt NSAIDs và glucocorticoid là hai nhóm thuốc chống viêm kinh điển, có tác dụng tốt trên nhiều loại viêm và đang được sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, các thuốc này lại có tác dụng không mong muốn trên nhiều cơ quan (viêm loét đường tiêu hóa, ảnh hưởng đến quá trình đông máu, tương tác bất lợi với một số nhóm thuốc khác) [65] Thêm vào đó, giá thành cao của các thuốc này cũng là vấn đề cần quan tâm khi sử dụng thuốc hàng ngày và trong một thời gian dài cho bệnh nhân Điều này đặt ra nhu cầu tìm kiếm các thuốc chống viêm mới có nguồn gốc từ dược liệu, có tác dụng tương đồng, đồng thời hạn chế các tác dụng không mong muốn của các nhóm thuốc hiện có Để được đưa vào lưu hành trên thị trường và sử dụng trong lâm sàng, các thuốc cần được tiến hành thử nghiệm trên mô hình tiền lâm sàng để đánh giá hiệu quả và bất lợi của thuốc

Trong nghiên cứu tiền lâm sàng hiện nay đòi hỏi không chỉ đánh giá được tác dụng của chế phẩm mà còn yêu cầu tìm hiểu được về cơ chế tác dụng của nó Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nghiên cứu đánh giá chuyên

sâu ở mức độ tế bào, mức độ phân tử… đã hỗ trợ rất nhiều, giúp cho việc làm sáng tỏ các cơ chế tác dụng của thuốc ngày càng tốt hơn Cơ chế tác dụng chống viêm hiện nay đang được quan tâm nghiên cứu là cơ chế làm bền vững màng tế bào, ngăn cản giải phóng các yếu tố gây viêm, và cơ chế ức chế sản xuất các chất gây viêm như prostaglandin E2 (PGE2), nitric oxide (NO) và các cytokines tiền viêm (IL-3, IL-6…)

“KNC” là bài thuốc kinh nghiệm của Phó giáo sư, tiến sĩ Đậu Xuân Cảnh dựa trên nền tảng cơ sở là bài “Độc hoạt ký sinh thang” gia giảm có tác dụng tốt trong điều trị các chứng đau cơ xương khớp trên lâm sàng, được sử dụng tại Bệnh viện Tuệ Tĩnh có kết quả tốt Cao đặc KNC bào chế từ bài thuốc cũng đã được chứng minh có tác dụng chống viêm tốt trên động vật thực nghiệm Với mong muốn tìm hiểu cơ chế tác dụng chống viêm của bài thuốc dưới dạng cao đặc, làm cơ sở khoa học cho việc nâng cao giá trị khoa học và ứng dụng của

chế phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống

viêm của cao đặc KNC qua thử nghiệm trên hồng cầu người và đại thực bào RAW 264.7” với 2 mục tiêu sau:

1 Đánh giá tác dụng chống viêm của cao đặc KNC qua tác dụng làm

bền vững màng tế bào hồng cầu người

nitric oxide (NO) và các cytokines tiền viêm trên tế bào RAW

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về viêm và các yếu tố viêm 1.1.1 Định nghĩa

Viêm là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với các vị trí bị tổn thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa chữa những vị trí bị tổn thương [36]

1.1.2 Nguyên nhân gây viêm

1.1.2.1 Nguyên nhân ngoại sinh

- Do vi sinh vật: vi khuẩn, virus, một số loại nấm, các vi sinh vật đơn bào, ký sinh trùng và côn trùng

- Do các chất hóa học: do các hóa chất, do thuốc…

- Do yếu tố vật lý: chấn thương, dị vật, nhiệt (bỏng nóng, bỏng lạnh), tia phóng xạ, bức xạ… [22]

1.1.2.2 Nguyên nhân nội sinh

- Sản phẩm chuyển hóa: như ure máu tăng gây viêm màng phổi, màng tim,

acid uric tăng gây viêm khớp trong bệnh gout

- Hoại tử kín gây viêm vô trùng: như hoại tử chỏm xương đùi

- Phản ứng tự miễn: như bệnh thấp khớp, viêm cầu thận - Viêm xung quanh tổ chức ung thư [22]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của viêm và các thành phần tham gia vào phản ứng viêm

Viêm có vai trò quan trọng trong bảo vệ vật chủ khỏi các tác nhân truyền nhiễm và chấn thương, nhưng cũng góp phần vào sinh lý bệnh của nhiều bệnh mạn tính Sự tương tác của các tế bào trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh, sự đáp ứng của hệ thống miễn dịch và các chất trung gian gây viêm cùng các khía cạnh khác của viêm cấp tính và mạn tính làm nền tảng cho nhiều bệnh của các

cơ quan Khởi đầu cho quá trình viêm là sự hoạt hóa các bạch cầu như bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ái kiềm và dưỡng bào, bạch cầu ái toan, bạch cầu đơn nhân hoặc đại thực bào, lympho bào B, T và tế bào diệt tự nhiên (NK)

1.1.3.1 Bạch cầu đa nhân trung tính

Bạch cầu đa nhân trung tính có trong tủy xương, lưu thông trong máu và tụ tập nhanh chóng ở những vị trí tổn thương hay nhiễm khuẩn Chúng được hoạt hóa để đáp ứng với những kích thích đại thực bào, những cytokines, những chất trung gian hóa hướng động hoặc những phức hợp kháng nguyên kháng thể chúng sẽ gắn với những thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào Trong các mô, những bạch cầu đa nhân trung tính thực bào những vi khuẩn xâm nhập và mô đã chết [22]

1.1.3.2 Bạch cầu ái kiềm và dưỡng bào

Bạch cầu ái kiềm có liên quan chặt chẽ đến dưỡng bào Cả hai đều có ái lực cao với thụ thể của IgE và nhanh chóng giải phóng chất trung gian từ nội bào thông qua kích hoạt trung gian IgE Tuy nhiên, trái ngược với dưỡng bào, bạch cầu ái kiềm kết thúc sự trưởng thành ở trong tủy xương và có thời gian tồn tại chỉ từ 1-3 ngày Số lượng bạch cầu ái kiềm tăng lên để đáp ứng với IL-3 và di chuyển vào các mô để thúc đẩy phản ứng miễn dịch [IL-32]

1.1.3.3 Bạch cầu ái toan

Bạch cầu ái toan lưu thông trong máu và được di chuyển đến chỗ viêm theo cách tương tự như bạch cầu đa nhân trung tính Chúng được tạo ra do tác động trung gian của IgE đặc trưng, chẳng hạn như trong quá trình mẫn cảm và những phản ứng dị ứng và hen Bạch cầu ái toan chứa những leucotrien và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF), cũng như phosphatase acid và peroxidase [21]

1.1.3.4 Bạch cầu đơn nhân, đại thực bào

Chúng có nguồn gốc từ tủy xương và đi ra khỏi dòng tuần hoàn để di chuyển vào mô và trở thành đại thực bào thường trực Những đại thực bào bắt

giữ và xử lý vi khuẩn và trình diện những kháng nguyên đã gắn với phức hợp hòa hợp mô chính lớp II với những lympho bào Những đại thực bào cũng có thể biệt hóa thành những tế bào có tua, những tế bào này là những tế bào trình diện kháng nguyên hiệu quả cao [21]

1.1.3.5 Lympho bào B, T và tế bào diệt tự nhiên (NK)

Tế bào B và T có thể xuyên mạch tại các tiểu tĩnh mạch chuyên để vào mô lympho [2] Tế bào B và T thực hiện những chức năng quan trọng ở cả những phản ứng miễn dịch và phản ứng do trung gian tế bào Khi kháng nguyên vào cơ thể sẽ gắn với tế bào B có kháng thể bề mặt tương ứng rồi kích thích biệt hóa tế bào B thành tương bào có khả năng sản xuất kháng thể (IgE, IgG, IgA, IgD, IgM) [9] Những lympho bào T có chức năng điều hòa việc hoạt hóa và chiêu mộ đại thực bào qua việc giải phóng những chất trung gian hóa học (lymphokine), điều hòa việc sản xuất kháng thể và độc tế bào do trung gian tế bào và duy trì trí nhớ miễn dịch [21]

Tế bào NK là những lympho bào không biệt hóa thành lympho B hay lympho T, chúng tham gia vào đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào do gây độc tế bào [19]

Ngoài sự tham gia của các bạch cầu còn có sự tham gia của tiểu cầu Ngoài vai trò cầm máu, tiểu cầu còn có thể tham gia vào mọi giai đoạn của quá trình viêm Các thành phần của chất nền ngoại bào (ECM), chemokine kích hoạt tiểu cầu khi gắn lên các thụ thể tiểu cầu trên tế bào viêm [14] Chúng là nguồn gốc của những chất trung gian gây viêm, bao gồm những chất hoạt mạch và những yếu tố phát triển điều hòa sự tăng sinh của tế bào trung mô Các chất trung gian có nguồn gốc từ tiểu cầu cung cấp các tín hiệu kích hoạt đến các tế bào đích bao gồm chất nền ngoại bào, tế bào myelomonocytic dẫn đến sự khuếch đại của viêm Tiểu cầu được đưa đến các vị trí viêm thông qua rò rỉ mạch máu, gắn với bạch cầu hoặc thông qua đáp ứng với các tín hiệu hóa học

Sự tiến triển của các tế bào tham gia trong phản ứng viêm này liên quan đến hàng loạt các chất trung gian quan trọng gây viêm Cơ chế của con đường viêm dẫn đến hình thành những tín hiệu trung gian có thể chia thành con đường phụ thuộc arachidonic acid (AA) và con đường không phụ thuộc AA [21] Con đường phụ thuộc arachidonic acid (AA) bao gồm các chất trung gian: cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LOX) và phospholipase A2 (PLA2) Mặt khác, cơ chế thứ hai của viêm là con đường không phụ thuộc AA liên quan đến iNOS, NF-kB, thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator-γ (Peroxisome proliferator-activated receptor (PPARγ)) và NSAID activated gen-1 (NAG-1) Cơ chế đầu tiên dẫn đến viêm phụ thuộc AA, khi AA và acid béo được giải phóng bởi phospholipase từ lớp phospholipid ở màng sinh chất, được chuyển hóa qua con đường COX để tổng hợp thromboxane A2 (TXA2) và prostaglandin (PG) hoặc thông qua cơ chế LOX để sản sinh ra hydroperoxyeicosatetraenoic acid (HPETE) và leucotrien (LT) [8] Các sản phẩm đến từ hai con đường đều là những trung gian quan trọng trong quá trình kiểm soát viêm

1.1.3.6 Các chất trung gian hóa học tham gia vào quá trình viêm

Prostaglandin:

Hầu hết các tế bào trong cơ thể khi bị hoạt hóa bởi các chấn thương cơ học, cytokines đặc hiệu, yếu tố phát triển, kích thích noron, hormone dạ dày-ruột hay các kích thích khác (collagen, histamin, bradykinin, thrombin ở nội bào) đều có khả năng sinh tổng hợp prostaglandin [35] Khi tế bào bị tổn thương, màng phospholipid của tế bào sẽ bị hoạt hóa bởi phospholipase A2

(PLA2) tạo thành acid arachidonic Prostaglandin (PG) và thromboxane (TXA) là các sản phẩm chuyển hóa theo con đường COX Có hai loại enzyme COX với đồng phân là COX-1 và COX-2 COX-1 về cơ bản được bộc lộ bởi tất cả các tế bào và là enzyme quan trọng trong tổng hợp những prostaglandin sinh lý

tham gia vào một số chức năng như: bảo vệ lớp phủ niêm mạc dạ dày, điều hòa sự cân bằng của nước và điện giải, kích thích sự kết dính tiểu cầu để duy trì việc cầm máu bình thường, duy trì sự đề kháng trên bề mặt tế bào nội mô của mạch [6],[10] COX-2 được bộc lộ ít hơn nên khó có thể phát hiện được ở các tế bào nhưng tăng lên rõ rệt khi có kích thích, chúng sinh ra những chất chuyển hóa quan trọng trong việc gây đau, viêm [21]

Một số loại prostaglandin [9],[38]

- PGE1: có receptor trên tế bào nội mô, tế bào cơ trơn thành mạch, tế bào trung tâm điều nhiệt vùng dưới đồi, nó gây tăng tính thấm thành mạch, gây sốt - PGE2: có receptor trên các tế bào cơ trơn, nó liên quan đến quá trình viêm dẫn đến các dấu hiệu đặc trưng của viêm là sưng, đỏ và đau

- PGI2: có receptor trên tế bào nội mô mạch, tế bào cơ trơn Nó có liên quan đến quá trình viêm gây giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch dẫn đến các biểu hiện là sưng, đau, đỏ và sốt

- TXA2: được giải phóng sau khi tiểu cầu kết dính với nội mạch bị tổn thương, TXA2 kích thích sự kết tập tiểu cầu và có tác dụng co mạch

- Trong viêm cấp, các mô và mạch máu tại chỗ sản xuất ra PGE2 và PGI2 Trong viêm mạn, bạch cầu đơn nhân và đại thực bào giải phóng PGE2 và TX2

Leucotrien:

Ngoài con đường COX, acid arachidomic có thể được oxy hóa bởi lypoxygennase để tạo thành các leucotrien Ngược lại với prostaglandin, leucotrien được tổng hợp chủ yếu bởi các tế bào viêm là bạch cầu đa nhân, đại thực bào, tế bào mast dưới xúc tác của lipoxygenase [35] Enzyme 5-lipoxygenase (5-LOX) chịu trách nhiệm tổng hợp 5-hydroperoxyeicosatetraenoic (5-HPETE) LTA4 có vai trò như một tiền tố để chuyển hóa thành những phân tử leucotrien khác Trong bạch cầu đa nhân trung

tính và trong quần thể đại thực bào, LTA4 được chuyển hóa thành LTB4 Trong dưỡng bào, bạch cầu ưa kiềm và đại thực bào LTA4 được chuyển hóa thành LTC4 và sau đó là LTD4 và LTE4 Những leucotrien này kích thích co cơ trơn, làm tăng tính thấm thành mạch máu và làm phát sinh nhiều triệu chứng lâm sàng kết hợp với những phản ứng dị ứng Những leucotrien tác động qua những thụ thể đặc hiệu ái lực cao, chúng có thể trở thành những đích quan trọng trong điều trị bằng thuốc [22]

Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF)

Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu là một chất trung gian có nguồn gốc từ phospholipid màng Chúng được tổng hợp bởi hầu hết tất cả các tế bào viêm đã được hoạt hóa, những tế bào nội mô và những tế bào bị tổn thương [27] PAF có tác động kích thích trên những tiểu cầu, bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu đơn nhân hoặc đại thực bào, những tế bào nội mô và những tế bào cơ trơn thành mạch PAF gây nên sự kết dính và mất hạt của tiểu cầu ở những vị trí tổn thương mô, kích thích việc giải phóng serotonin, vì vậy gây nên những thay đổi trong tính thấm thành mạch [22]

Các acid amin hoạt mạch

Histamin

Histamin trong cơ thể có nguồn gốc chủ yếu từ dưỡng bào, ngoài ra còn có trong bạch cầu ái kiềm và bạch cầu ái toan Nó được giải phóng trong quá trình mất hạt của các tế bào khi các tế bào đáp ứng với các kích thích [9],[14]

Histamin tạo ra nhiều tác động của viêm và mẫn cảm, bao gồm giãn mạch, phù nề, tăng tính thấm thành mạch và co thắt cơ trơn [56]

Serotonin

Serotonin có nguồn gốc từ tế bào mast, đại thực bào hay tiểu cầu [86] Sự kết dính tiểu cầu sẽ giải phóng ra serotonin [14]

Các thành phần của lysosome

Các hạt lysosome có chứa trong các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đơn nhân Enzyme từ các hạt này là lysozyme có khả năng phân hủy những vách tế bào vi khuẩn, hoặc mô vật chủ [21]

Cơ chế thứ hai dẫn đến viêm là con đường không phụ thuộc AA Trong con đường này, iNOS tham gia xúc tác tổng hợp NO thông qua oxy hóa vị trí nitơ cuối cùng trên guanidine của acid amino L-arginin [57] Việc sản sinh NO cũng làm tăng nồng độ COX-2 thông qua MAP kinases và superoxide [89] Đánh giá việc sản sinh NO là một trong những đích cho sự nghiên cứu và phát triển của thuốc chống viêm Các yếu tố phiên mã như NF-kB và AP-1 quy định sự biểu hiện của COX-2 thường đồng thời quy định biểu hiện của iNOS, qua đó cũng là những yếu tố quan trọng trong quá trình viêm [66] Các yếu tố NF-kB và PPAR gây kích thích biểu hiện các gen gây viêm qua đó góp phần vào quá trình phản ứng viêm

Một số yếu tố tham gia trong con đường này như các cytokines, NO, gốc oxy tự do

Các cytokines

Cytokines bản chất là những glycoprotein, có trọng lượng phân tử thấp, do nhiều loại tế bào sản xuất nhưng chủ yếu từ lympho bào và đại thực bào đã bị hoạt hóa [92] Cytokines là chất quan trọng của viêm, tham gia vào quá trình viêm cấp tính và mạn tính thông qua một loạt các tương tác phức tạp Có thể phân loại các cytokines dựa trên bản chất của phản ứng miễn dịch hoặc dựa vào vai trò cụ thể của nó trên vị trí tế bào Các cytokines tiền viêm chủ yếu bao gồm interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử khối u (TNF-α)

Từ các vị trí được giải phóng, các cytokines có thể tác động lên tế bào đích theo 3 cách [12],[14]

- Tác động trên chính tế bào đã tiết ra chúng (hiệu quả tự tiết)

- Tác động trên tế bào lân cận với tế bào đã tiết ra chúng (hiệu quả cận tiếp) - Tác động trên tế bào đích ở xa tế bào tiết ra chúng do sự vận chuyển của các cytokines qua vòng tuần hoàn máu (hiệu quả nội tiết)

Các IL-1, IL-6 và TNF-α hiệp đồng hoạt động và gây ra nhiều biến đổi tại chỗ tổn thương cũng như toàn thân [12],[14]

Các gốc oxy tự do

Các bạch cầu có thể giải phóng các gốc dẫn xuất oxy tự do sau khi tiếp xúc với tác nhân hóa ứng động, các phức hợp miễn dịch hoặc sau các hoạt động thực bào phức tạp Khi các gốc tự do tràn ra ngoài sẽ tạo điều kiện cho quá trình peroxyd hóa lipid màng tế bào gây tăng tính thấm thành mạch và thuận lợi cho việc giải phóng acid arachidonic từ phospholipid màng tế bào để tổng hợp các chất trung gian hóa học [13]

Ngoài ra còn có các thành phần có nguồn gốc từ huyết tương tham gia vào quá trình viêm như hệ thống bổ thể, hệ thống brandykinin, hệ thống đông máu, hệ thống tiêu tơ huyết, globulin miễn dịch

1.2 Thuốc chống viêm và cơ chế tác dụng của thuốc chống viêm 1.2.1 Định nghĩa

Thuốc chống viêm là những thuốc tác động ức chế lên phản ứng viêm, làm giảm các triệu chứng viêm và phục hồi chức năng vùng bị ảnh hưởng [26],[65]

Có hai nhóm thuốc chống viêm thường gặp là nhóm thuốc kháng viêm non-steroid (NSAID) và nhóm thuốc chống viêm corticosteroid

1.2.2 Cơ chế tác dụng của thuốc chống viêm

Sơ đồ 1.1 Cơ chế tác dụng của thuốc chống viêm [26]

1.2.2.1 Cơ chế tác dụng nhóm thuốc kháng viêm non-steroid (NSAID)

Nhóm thuốc NSAID ức chế sự hoạt động của các enzym cyclooxygenase (COX) tham gia vào quá trình sản xuất prostaglandin (PG) PG là hoạt chất trung gian gây viêm, đau, sốt và có vai trò bảo vệ niêm mạc dạ dày và ruột

Enzym COX được chia làm 2 loại: COX-1 và COX-2

COX-1: có trong các mô của cơ thể Nếu COX-1 bị ức chế, sẽ gây ra các tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa (viêm loét dạ dày - tá tràng, xuất huyết tiêu hóa) COX-2: không có trong các mô của cơ thể, chỉ được tạo ra khi có sự kích thích của các hoạt chất trung gian gây viêm như cytokines Nếu COX-2 bị ức chế, sẽ kiểm soát được quá trình viêm mà không gây ra các tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa [26],[65]

1.2.2.2 Cơ chế tác dụng nhóm thuốc kháng viêm corticosteroid

Trong quá trình viêm, các bạch cầu thoát ra khỏi mạch máu để xâm nhập các mô bị viêm chống lại các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus…Các thuốc kháng viêm corticosteroid ngăn chặn quá trình này do làm giảm số lượng của tế bào lympho, bạch cầu ưa eosin, bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại biên, làm giảm sự di chuyển của chúng đến các mô bị viêm và ức chế sự hoạt động của các tế bào lympho và các đại thực bào

Ngoài ra, các thuốc kháng viêm corticosteroid còn ức chế enzym COX và PLA2 là những enzym tham gia quá trình tổng hợp prostaglandin [26],[65]

1.3 Một số mô hình in vitro nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc

Trong giai đoạn sàng lọc các dược liệu có tiềm năng chống viêm, việc sử dụng mô hình in vitro sẽ giúp tiết kiệm thời gian và chi phí hơn Trong các mô hình in vitro, việc đánh giá tác dụng của thuốc trên các dòng tế bào đặc trưng như đại thực bào, tế bào mast, bạch cầu trung tính thường được sử dụng Ngoài ra, các mô hình cũng thường được tiến hành trên các tế bào hồng cầu hay protein có nguồn gốc từ albumin trứng hoặc từ huyết thanh bò Việc sử dụng các dòng tế bào này giúp dự đoán được cơ chế chống viêm của thuốc cũng như ảnh hưởng lên quá trình sản sinh các protein tham gia vào quá trình viêm

1.3.1 Nghiên cứu tác dụng chống viêm trên mô hình ổn định màng hồng cầu

Phương pháp này có ưu điểm là thuận tiện, nhanh trong việc đánh giá sơ bộ tác dụng chống viêm của các dược liệu nên thường được sử dụng Mô hình này có thể tiến hành phù hợp với điều kiện thí nghiệm tại Việt Nam

1.3.1.1 Nguyên tắc của phương pháp

Trong quá trình viêm, việc ly giải màng lysosome sẽ làm giải phóng ra các enzyme tạo ra nhiều rối loạn trong cơ thể Do đó, sự ổn định màng của lysosome rất quan trọng để kiểm soát phản ứng viêm vì giúp ngăn chặn giải

phóng các chất trung gian hóa học từ lysosome Tuy nhiên, việc đánh giá cơ chế chống viêm thông qua màng lysosome là khó khăn

Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy được sự tương đồng giữa màng hồng cầu với màng lysosome Do vậy, đánh giá sự ổn định màng hồng cầu cũng tương đồng với màng lysosome Quá trình ly giải của màng hồng cầu xảy ra khi hồng cầu được tiếp xúc với các tác nhân gây ly giải như dung dịch nhược trương, nhiệt độ hoặc hóa chất methyl salicilat và phenyl hydrazine [31]

Do vậy, để đánh giá tác dụng chống viêm của các thuốc, các nghiên cứu tiến hành cho tế bào hồng cầu có nguồn gốc từ người hoặc động vật (chuột) tiếp xúc với các tác nhân gây ly giải là nhiệt độ hoặc dung dịch nhược trương, hóa chất lỏng một thời gian thích hợp và thuốc nghiên cứu với các nồng độ khác nhau Thuốc được coi là có tác dụng chống viêm khi làm giảm tỷ lệ ly giải màng hồng cầu một cách có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05)

1.3.1.2 Đối tượng áp dụng

Mô hình thường được sử dụng trong giai đoạn đầu sàng lọc các thuốc chống viêm có nguồn gốc từ dược liệu hoặc hóa dược

1.3.2 Mô hình ức chế giải phóng NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7

Phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao và đặc hiệu, giúp tìm hiểu được cơ chế chống viêm của dược liệu [53]

Trong các tế bào miễn dịch trên, đại thực bào là các tế bào tiền viêm chính, trong quá trình viêm chúng giải phóng ra các chất trung gian gây viêm như nitric oxide (NO) và các cytokines gây viêm Dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7 được sử dụng phổ biến để sàng lọc ban đầu các hoạt tính sinh học của sản phẩm tự nhiên và dự đoán hiệu quả tiềm năng của chúng trên cơ thể hoặc trên tế bào chính [48] Các tế bào đại thực bào có nguồn gốc khác nhau như nguồn gốc từ chuột nhắt BALB/c RAW 264.7 được tách ra và nuôi cấy trong môi trường RPMI 1604 (đã bổ sung 2mmol L-glutamin; 0,1mmol acid

amin không thiết yếu, 100U/mL penicillin, streptomycin và 10% huyết thanh bò – FBS) Sau đó, tế bào có thể được sử dụng để đánh giá khả năng bài tiết chất trung gian hóa học gây ra phản ứng viêm

1.3.2.1 Nguyên tắc của phương pháp

NO là một chất trung gian hóa học được tạo ra bởi nhiều loại tế bào bao gồm đại thực bào, bạch cầu trung tính, tiểu cầu, nguyên bào sợi, nội mô, tế bào thần kinh và các tế bào cơ trơn Nó được tổng hợp bởi nitric oxide synthase từ L-arginin sử dụng NADPH và oxy phân tử [47] iNOS tham gia xúc tác tổng hợp NO là chất trung gian hóa học cho một loạt các hoạt động sinh học khác nhau nên khi có viêm và viêm nhiễm trùng, sẽ dẫn đến tăng một loạt các enzyme và protein tín hiệu trong các mô và tế bào bị ảnh hưởng NO là cơ chế bệnh sinh chính của các bệnh viêm nhiễm; lượng NO này có thể phản ánh mức độ viêm và cung cấp một số chỉ số đánh giá quá trình viêm [89] Do đó, giảm sản xuất NO là mục tiêu tiềm năng để đánh giá tác dụng chống viêm của các dược liệu tiềm năng

Các tế bào RAW 264.7 được tiến hành kích thích phản ứng viêm bằng LPS với nồng độ và thời gian thích hợp Việc kích thích LPS sẽ khiến tế bào đại thực bào RAW 264.7 giải phóng ra nhiều chất trung gian hóa học trong đó có NO Lượng NO giải phóng vào môi trường nuôi cấy được định lượng bằng thuốc thử Griess Thuốc được coi là có tác dụng chống viêm khi làm giảm lượng NO có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với mẫu chứng

1.3.2.2 Đối tượng áp dụng

Mô hình thường được sử dụng trong giai đoạn đầu sàng lọc các thuốc chống viêm có nguồn gốc từ dược liệu hoặc hóa dược

1.3.3 Mô hình đánh giá sự ức chế biến tính của protein

Mô hình dễ, đơn giản và nhanh trong việc sàng lọc ban đầu các hoạt tính chống viêm Tuy nhiên, tính đặc hiệu của mô hình không cao nên thường được tiến hành để củng cố thêm cơ chế chống viêm của các dược liệu

1.3.3.1 Nguyên tắc

Kết quả của biến tính protein là mất đi tính chất sinh học của các phân tử protein Sự biến tính protein có liên quan đến sự hình thành các rối loạn viêm như viêm khớp dạng thấp, đái tháo đường, ung thư Do đó, khả năng ngăn chặn sự biến tính protein cũng có thể giúp ngăn ngừa các rối loạn viêm [69]

Trong mô hình này, protein có nguồn gốc từ albumin trứng hoặc albumin huyết thanh bò được tiếp xúc với dược liệu ở các nồng độ khác nhau Các hỗn hợp phản ứng này được ủ ở 370C trong 15 phút và sau đó để ở 700C trong 5 phút Dược liệu có tác dụng chống viêm khi làm giảm sự biến tính của protein có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng

1.3.3.2 Đối tượng áp dụng

Thường được áp dụng để củng cố cơ chế chống viêm của các dược liệu

1.3.4 Mô hình đánh giá sự ức chế enzyme cyclooxygenas và 5-lipooxygenase (5-LOX)

COX và LOX là hai enzyme chính trong quá trình viêm phụ thuộc con đường AA Chúng tạo ra rất nhiều các yếu tố gây viêm Mô hình được sử dụng trong tìm hiểu cơ chế chống viêm của thuốc, có tính đặc hiệu cao nên không phù hợp trong việc sàng lọc ban đầu do chi phí tốn kém

1.3.4.1 Nguyên tắc

Acid arachidonic được chuyển hóa trong cơ thể thông qua hai con đường với enzyme cyclooxygenase (COX) và 5-lipooxygenase (5-LOX) Theo con đường COX sản sinh ra prostaglandin và thromboxane trong khi đó con đường 5-LOX sản sinh ra eicosanoid và leucotrien Ức chế hai con đường sản sinh ra

prostasglandin và leucotrien sẽ đem lại khả năng chống viêm tối ưu Có hai mô hình cơ bản thông qua ức chế COX hoặc LOX

Mô hình ức chế cyclooxygenase (COX)

Khả năng ức chế enzyme COX được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm sàng lọc chất ức chế COX (Cayman Chemical, Ann Arbor, USA) bằng xét nghiệm miễn dịch enzyme theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các mẫu dược liệu được ủ với enzyme trong 10 phút, sau đó thêm cơ chất acid arachidonic Phản ứng được tiến hành trong 2 phút ở 370C, sau đó dừng phản ứng và đem đi đo quang [39]

Dược liệu có tác dụng chống viêm khi làm ức chế enzyme COX có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng (p < 0,05)

Đối tượng áp dụng: Áp dụng để tìm hiểu sâu cơ chế của các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu hoặc hóa dược

Mô hình ức chế enzyme 5-lipooxygenase (5-LOX)

Hoạt tính ức chế LOX được nghiên cứu khi sử dụng acid lioneic làm cơ chất và lipoxidase làm enzyme [52] Ngoài ra enzyme lipoxygenase tái tổ hợp ở người cũng có thể làm enzyme [55]

Trong mô hình này, dịch chiết dược liệu ở các nồng độ khác nhau được ủ với lipoxidase ở đậu nành ở 250C trong 10 phút Sau đó, thêm cơ chất acid linoleic để phản ứng được diễn ra [39]

Dược liệu có tác dụng chống viêm khi ức chế enzyme LOX có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng (p < 0,05)

Đối tượng áp dụng: áp dụng để tìm hiểu sâu cơ chế của các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu hoặc hóa dược

1.4 Tổng quan về bài thuốc KNC 1.4.1 Thành phần

Thành phần bài thuốc “KNC” gồm các vị thuốc

(gam)

Phòng phong Radix Saposhnikoviae divaricatae 10g

Tang ký sinh Herba Loranthi gracilifolii 10g

Thục địa Radix Rehmanniae glutinodea praeparata 05g Khương hoạt Rhizoma et Radix Notopterygii 05g

Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii 05g

Các vị thuốc được sử dụng trong nghiên cứu được bào chế theo đúng tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V [8] và tiêu chuẩn cơ sở

1.4.2 Phân tích bài thuốc

1.4.2.1 Theo dược lý học hiện đại

Độc hoạt có tác dụng giảm đau, an thần và kháng viêm rõ rệt Thuốc có thành phần chống loét dạ dày Đối với hồi tràng thỏ, thuốc có tác dụng co thắt cơ hồi tràng [18]

Phòng phong có tác dụng điều hòa nhiệt độ, giảm đau, kháng khuẩn, hạ nhiệt, dùng vacxin thương hàn tiêm tĩnh mạch thỏ để gây sốt rồi so sánh tác dụng giảm sốt của 1 số vị thuốc đông y, thấy Phòng phong (Silever divaricata Schischk) chế thành thuốc sắc 20% và thuốc ngâm với liều 10mg/kg đổ vào dạ dày thì sau 30 phút sau khi cho thuốc, tác dụng giảm sốt xuất hiện rõ Đối với thuốc sắc, tác dụng này duy trì trên 2 giờ 30 phút, nhưng đối với thuốc ngâm thì sau 2 giờ nhiệt độ lại tăng lên cao với lô đối chứng [18]

Tần giao có tác dụng kháng viêm rõ rệt, do thành phần Gentianine A tác động lên hệ thần kinh làm hưng phấn chức năng tuyến yên - vỏ thượng thận Thuốc còn có tác dụng an thần, giảm đau, giải nhiệt, kháng histamin, chống choáng do dị ứng [2]

Tang ký sinh dưới dạng cao lỏng cho chó uống có tác dụng gây hạ huyết áp trên chó gây mê với liều 2g/kg thể trọng, gây giãn mạch ngoại biên trong thí nghiệm in vitro, làm giảm nhu động và trương lực cơ trơn ruột thỏ cô lập, an thần kéo dài thời gian giấc ngủ gây bởi hexobarbital Có khả năng ức chế sự ngưng kết tiểu cầu thỏ bởi lectin, có thể ức chế sự tổng hợp protein trong một dịch phân giải hồng cầu lưới thỏ [3]

Ngưu tất có tác dụng thúc đẩy quá trình tổng hợp protein Ức chế trung khu thần kinh nên có tác dụng an thần, giảm đau, ức chế cơ trơn của tử cung và dạ dày, ruột, ức chế tiết vị toan phòng được loét ở chuột cống thực nghiệm, chống viêm và hạ nhiệt, có tác dụng bảo vệ gan, làm hạ men Transaminaza [17]

Bạch thược Glucozit có tác dụng ức chế trung khu thần kinh do đó có tác dụng an thần, giảm đau, chống viêm, hạ nhiệt, chống sự hình thành huyết khối do tiểu cầu tăng, tăng lưu lượng máu dinh dưỡng cơ tim, tác dụng bảo vệ gan, làm hạ men Transaminaza, ức chế cơ trơn của tử cung và dạ dày, ruột, ức chế

sự tiết vị toan, phòng được loét ở chuột cống thực nghiệm Bạch thược có tác dụng giãn mạch ngoại vi, hạ áp nhẹ, lợi tiểu [17].

Thục địa có tác dụng kháng viêm Đối với chuột cống, thực nghiệm gây sưng tấy bằng Formalin vùng chân đùi, thuốc làm giảm sưng rõ; không ảnh hưởng đến đường huyết bình thường của thỏ, cường tim, hạ áp, cầm máu, bảo vệ gan, lợi tiểu, chống chất phóng xạ, chống nấm Thuốc có tác dụng ức chế miễn dịch kiểu corticoid nhưng không làm ức chế hoặc teo vỏ thượng thận [8] Khương hoạt có tác dụng kháng khuẩn: dùng rượu chiết xuất Khương hoạt nồng độ 1/50000 có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn lao [1]

Tế tân có tác dụng giảm đau: gây tê tại chỗ [17]

Thực nghiệm trên súc vật cũng chứng minh Đảng sâm có tác dụng trên cả hai mặt hưng phấn và ức chế của vỏ não đồng thời làm tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, hạ áp trong thời gian ngắn do giãn mạch ngoại vi và ức chế adrenalin, tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, giảm bạch cầu, tăng đường huyết, kháng khuẩn, kháng viêm, hóa đàm, tăng trương lực cổ tử cung [23]

Đương quy có tác dụng làm giãn huyết quản ngoại vi, làm dịu co thắt cơ trơn của huyết quản ngoại vi, tăng lưu lượng máu; vì thế mà Đương quy có tác dụng giảm đau [18]

Xuyên khung có tác dụng trấn tĩnh hệ thần kinh trung ương, co mạch máu ngoại vi tăng lưu lượng máu mạch vành và não, liều cao có thể làm huyết áp hạ xuống, giảm sức cản huyết áp ngoại vi, ức chế ngưng tập tiểu cầu và hình thành máu cục, kháng khuẩn, an thần, có tác dụng kháng sinh đối với nhiều loại vi khuẩn [18]

Đỗ trọng có tác dụng chống viêm, tăng cường chức năng vỏ tuyến thượng thận, tác dụng hưng phấn hệ thống tuyến yên, vỏ tuyến thượng thận, an thần giảm đau (trấn kinh, trấn thống), tăng tính miễn dịch của cơ thể [8]

Cam thảo có tác dụng giải độc, kích thích xuất tiết của hầu họng và khí quản làm cho loãng đờm, giữ muối NaCl và nước trong cơ thể, bài thải Kali gây phù, tăng huyết áp, chống loét và ức chế tiết acid dịch vị, chống co thắt cơ trơn đường tiêu hóa, kháng khuẩn, có tác dụng như nội tiết tố dục tính [8]

1.4.2.2 Theo phối ngũ lập phương y học cổ truyền

Độc hoạt, Khương hoạt, Tang ký sinh khu phong trừ thấp, dưỡng huyết hòa vinh, hoạt lạc thông tý làm chủ dược; Ngưu tất, Đỗ trọng, Thục địa bổ ích can, thận, cường cân tráng cốt; Xuyên khung, Đương quy, Bạch thược bổ huyết, hoạt huyết; Đảng sâm, Cam thảo ích khí kiện tỳ, đều có tác dụng trợ lực trừ phong thấp; Tần giao, Tế tân, Phòng phong phát tán phong hàn thấp Các vị thuốc hợp lại thành một bài thuốc có tác dụng vừa trị tiêu bản, vừa phù chính khu tà [16]

1.4.2.3 Theo tính vị quy kinh

Độc hoạt vị cay, đắng, ôn, quy kinh Can, Thận, Bàng quang có tác dụng trừ phong thấp chỉ thống, giải biểu Chủ trị chứng phong thấp tý thống, thiếu âm đầu thống, phong hàn biểu chứng kiêm thấp [1]

Phòng phong vị cay ngọt, tính ấm, quy kinh Bàng Quang, Can, có tác dụng tán hàn giải biểu, trừ phong thấp, giải kinh phong [18]

Tần giao vị đắng cay, hơi hàn, quy kinh Vị, Can, Đởm, có tác dụng trừ phong thấp, thư cân hoạt lạc, thanh hư nhiệt, trị các chứng phong thấp tý thống, cốt chưng triều nhiệt [2]

Tang ký sinh vị đắng tính bình quy kinh Can, Thận, có tác dụng chữa đau xương khớp, đau dây thần kinh ngoại biên, đau lưng ở người già [3]

Ngưu tất đắng, chua, bình, quy kinh Can, Thận, có tác dụng hoạt huyết khứ ứ, bổ Can, Thận, dưỡng gân cốt, lợi niệu thông lâm, làm sứ dược dẫn huyết và hỏa xuống phần dưới cơ thể, chủ trị các chứng lưng gối nhức mỏi [15]

Bạch thược vị đắng, chua, hơi hàn, quy kinh Can, Tỳ, có tác dụng dưỡng huyết, liễm âm, hòa can chỉ thống, chủ trị các chứng can huyết hư, cơ thể hư nhược, nhiều mồ hôi, các chứng âm huyết hư, can dương thịnh, can phong động, các chứng đau do bệnh của can [17]

Thục địa ngọt hơi ôn, quy kinh Can, thận, có tác dụng dưỡng huyết tư âm, bổ tinh ích tủy, chủ trị các can thận âm hư, tinh huyết hư [8]

Khương hoạt vị cay, đắng tính ôn, quy kinh Can, Thận, Bàng Quang, có tác dụng phát hãn, giải biểu, trừ phong thắng thấp, chủ trị phong thấp đau nhức, cảm mạo phong hàn [1]

Tế tân vị cay tính ấm, quy kinh Tâm, Phế, Thận, có tác dụng phát hãn, tán hàn, trấn thống, khu đàm, chỉ khái [17]

Đảng sâm vị ngọt bình, quy kinh Tỳ, Phế, có tác dụng bổ trung ích khí, sinh tân, dưỡng huyết, chủ trị chứng trung khí bất túc, phế khí hư nhược, huyết hư hoặc khí huyết lưỡng hư [23]

Đương quy vị ngọt cay ôn, quy kinh Can, Tâm, Tỳ, có tác dụng bổ huyết, hoạt huyết, chỉ huyết Chủ trị chứng tâm can huyết hư, kinh nguyệt không đều, đau kinh, tắt kinh, các bệnh thai tiền sản hậu, tổn thương do té ngã, đau tê chân tay (tý thống ma mộc), nhọt lở loét (ung thư sang thương), chứng huyết hư trường táo kiêm trị khái suyễn [18]

Xuyên khung vị cay tính ôn, quy kinh Can, Đởm, Tâm bào, có tác dụng hoạt huyết hành khí, khu phong chỉ thống Chủ trị các chứng chân tay tê dại, chứng phong thấp tý [18]

Đỗ trọng ngọt, ôn, quy kinh Can, thận, có tác dụng bổ Can, Thận, cường gân cốt, chủ trị chứng thận hư, đau lưng, liệt dương (dương nuy), thai động, thai lậu, trụy thai [18]

Cam thảo vị ngọt, tính bình, quy kinh Tỳ, Vị, Phế, Tâm, có tác dụng bổ trung ích khí, nhuận phế chỉ khát, hoãn cấp chỉ thống, thanh nhiệt giải độc, chủ trị các chứng tỳ vị hư nhược [20]

1.4.3 Các nghiên cứu về KNC

1.4.3.1 Nghiên cứu độc tính cấp của bài thuốc KNC trên động vật thực

nghiệm

Chưa tìm thấy LD50 của cao đặc KNC theo đường uống trên chuột nhắt trắng với mức liều cao nhất có thể cho chuột uống trong vòng 24 giờ là 42,0 gam cao đặc/kg thể trọng (phụ lục 1)

1.4.3.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của bài thuốc KNC trên động

vật thực nghiệm

Trên các lô chuột dùng cao đặc KNC liều 1,7g cao đặc/kg/ngày và liều 8,5g cao đặc/kg/ngày trong 90 ngày liên tục không phát hiện các bất thường trên chuột thực nghiệm (chuột khỏe mạnh, tăng trọng đều, không làm thay đổi các chỉ số huyết học, sinh hóa, không gây tổn thương mô bệnh học gan, lách, thận (phụ lục 1)

1.4.3.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm giảm đau của bài thuốc KNC trên

động vật thực nghiệm

Cao đặc KNC ở cả 2 mức liều dùng (1,7g/kg/ngày và 3,4g/kg/ngày) có tác dụng chống viêm tốt trên các mô hình thực nghiệm:

- Mô hình viêm khớp gây bởi tá chất Freund trên chuột cống trắng - Mô hình gây phù chân chuột cống trắng bằng carrageenin

- Mô hình giảm đau bởi phiến nóng

- Mô hình đau quặn gây bằng acid acetic (phụ lục 2)

Chương 2

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Chất liệu nghiên cứu

Phòng phong Radix Saposhnikoviae divaricatae 10g

Tang ký sinh Herba Loranthi gracilifolii 10g

Thục địa Radix Rehmanniae glutinodea praeparata 05g Khương hoạt Rhizoma et Radix Notopterygii 05g

Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii 05g

Các dược liệu trong bài thuốc được dùng dưới dạng dược liệu khô và đạt tiêu chuẩn trong Dược điển Việt Nam V [8], được chế biến theo quy định của Y học cổ truyền và cân theo tỷ lệ như trên

Cao nước chiết suất từ bài thuốc KNC có tỷ lệ 1:1 (1g dược liệu/1mL cao), được đựng trong chai nhựa nút kín Quá trình chiết xuất được thực hiện bằng máy tự động tại khoa Dược – Bệnh viện Tuệ Tĩnh

Từ cao nước KNC có tỷ lệ 1:1 tiến hành nghiên cứu chiết xuất và bào chế cao đặc KNC; xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định tiêu chuẩn cho cao đặc KNC tại Học viện Quân Y Cao đặc KNC đạt tiêu chuẩn cơ sở được sử dụng là chế phẩm nghiên cứu, được pha loãng với nước cất để tạo ra các dung dịch thuốc thử với nồng độ khác nhau

2.1.2 Thuốc đối chứng Diclofenac

2.1.2.1 Đóng gói

Hộp 3 vỉ x 10 Viên bao phim

2.1.2.2 Thành phần

- Diclofenac sodium 50mg - Tá dược vừa đủ 1 viên

(Lactose, Tinh bột sắn, Povidone, Microcrystalline cellulose, Magnesium stearate, Methacrylic acid copolymer, Màu sunset yellow, Màu Tartrazine, Talc, Polyethylene glycol 6000, Ethanol 96%)

2.1.2.3 Dược lực học

Diclofenac là thuốc kháng viêm không steroid, có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ sốt mạnh Diclofenac ức chế mạnh hoạt tính của

cyclooxygenase, làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxane là những chất trung gian của quá trình viêm

2.1.2.4 Dược động học

Diclofenac được hấp thu nhanh hơn khi uống lúc đói Khoảng 50% liều uống được chuyển hóa qua gan lần đầu, 60% liều dùng được thải qua thận dưới dạng các chất chuyển hóa, còn một phần hoạt tính và dưới 1% ở dạng thuốc nguyên vẹn, phần còn lại thải qua mật và phân

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu

- Mẫu máu người tình nguyện khỏe mạnh:

+ Tiền sử khỏe mạnh, hiện tại không mắc các bệnh nội ngoại khoa cấp tính hoặc mạn tính

+ Các chỉ số công thức máu (Hồng cầu, Bạch cầu, Tiểu cầu, Hemoglobin, Hematocrit), sinh hóa máu (Ure, Creatinin, Bilirubin, Glucose máu, Triglycerid, Cholesterol, Acid uric, AST(GOT), ALT(GPT)) trong giới hạn bình thường

- Trên 18 tuổi, không phân biệt giới và nghề nghiệp - Tự nguyện tham gia và tuân thủ quy trình nghiên cứu

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu

- Trong 6 tháng gần nhất trước khi tham gia nghiên cứu có mắc bệnh lý nội khoa, ngoại khoa cấp tính được can thiệp điều trị, không điều trị

- Đối tượng có tiền sử bệnh lý nội khoa, ngoại khoa mạn tính hiện đã điều trị ổn định

- Sử dụng thuốc y học hiện đại, thuốc y học cổ truyền, chế phẩm thuốc y học cổ truyền, thực phẩm chức năng, vitamin, trước khi tham gia nghiên cứu 14 ngày

- Phụ nữ có thai và đang cho con bú

2.3 Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2019 đến hết tháng 03/2020 tại Học viện Quân Y

2.4 Hóa chất nghiên cứu

- Các kít ELISA xét nghiệm chất trung gian gây viêm PGE2 và các cytokines tiền viêm TNF-α, IL-1β, và IL-6 trong huyết thanh

- Tế bào đại thực bào RAW 264.7 (Rockville, MD, USA) - Môi trường nuôi cấy Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - Dung dịch FBS

- Một số hóa chất khác

2.5 Dụng cụ, máy móc, thiết bị kỹ thuật

- Cân phân tích Sartorius độ chính xác 0,0001g, xuất xứ Đức - Hệ thống ELISA

- Máy đo quang phổ

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Đánh giá tác dụng chống viêm của cao đặc KNC qua tác dụng làm bền vững màng tế bào hồng cầu người

2.6.1.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp của Karunakar Kota và cộng sự (2018) [80]

2.6.1.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Tiến hành lấy 2mL máu từ người tình nguyện khỏe mạnh không

sử dụng các thuốc chống viêm giảm đau (NSAID) trong 14 ngày trước thí nghiệm

Bước 2: Trộn mẫu máu lấy từ người tình nguyện khỏe mạnh với cùng

thể tích dung dịch Alsever vô khuẩn (2% dextrose, 0,8% sodium citrate; 0,05% citric acid và 0,42% sodium chloride trong nước)

Bước 3: Ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 4: Rửa 3 lần tế bào hồng cầu thu được sau ly tâm với isosaline

(0,85%, pH 7,2)

Bước 5: Thể tích máu được đo và được hoàn nguyên thành dịch treo

10% v/v với isosaline

Bước 6: Hỗn hợp thử nghiệm chứa 1mL phosphate buffer

[pH 7,4; 0,15M], 2mL hyposaline [0,36%], 0,5mL dịch treo hồng cầu người [10%v/v] với 0,5mL dung dịch thuốc thử (mẫu thử), hoặc thuốc tham chiếu diclofenac sodium với các nồng độ khác nhau (50, 100, 250, 500, 1000, 2000 μg/mL), hoặc nước cất (mẫu chứng) (nước cất thay cho hyposaline để tạo ra sự ly giải 100%)

Bước 8: Ly tâm hỗn hợp sau ủ

Bước 9: Tính hàm lượng huyết sắc tố trong phần dịch nổi bằng máy đo

quang phổ ở bước sóng 560 nm

2.6.1.3 Phương pháp đánh giá kết quả

Phần trăm ly giải màng hồng cầu:

2.6.2 Đánh giá tác dụng của cao đặc KNC lên prostaglandin E2 (PGE2), nitric oxide (NO), và các cytokines tiền viêm trên tế bào RAW 264.7

2.6.2.1 Nuôi cấy tế bào

Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (môi trường nuôi tế bào DMEM) bổ

sung 10% FBS (Fetal bovine serum) và 1% penicillin-streptomycin, nuôi cấy trong tủ ấm CO2 5% độ ẩm ở 370C [67],[74],[80],[81]

2.6.2.2 Đánh giá khả năng sống của tế bào

Ảnh hưởng của thuốc thử trên khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng thử nghiệm so màu MTT Các tế bào được treo trong đĩa 96 giếng ở nồng độ 1 x 104 tế bào/giếng, với các nồng độ khác nhau của thuốc thử trong 24 giờ Các tế bào sau đó được xử lý bằng dung dịch MTT (2 mg/mL) trong 3 giờ Sau khi loại bỏ chất nổi trên bề mặt, formazan tạo ra được cho hòa tan trong DMSO và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 540 nm [67],[74],[80],[81]

2.6.2.3 Xét nghiệm Nitrite

Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được xử lý trước với thuốc thử ở nhiều nồng độ (50–500 𝜇g/mL) trong 1 giờ, sau đó kích thích hoặc không trong 18 giờ với LPS (1 𝜇g/mL) Lấy mỗi 100 𝜇g/mL của phần nổi cho phản ứng với cùng thể tích của thuốc thử Griess [1% sulfanilamide, 0,1% N-(1- naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride, 2,5% phosphoric acid] trong 10 phút và nồng độ nitrite được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm [67],[74],[80],[81]

2.6.2.4 Đánh giá nồng độ prostaglandin E2 (PGE2) và các cytokines tiền viêm

Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được xử lý trước với thuốc thử ở nhiều nồng độ (50–500 𝜇g/mL) trong 1 giờ, sau đó kích thích trong 18 giờ với LPS (1 𝜇g/mL) Thu lấy phần nổi, xác định nồng độ các cytokines tiền viêm IL-1𝛽, TNF-𝛼, và IL-6 bằng ELISA kits Nồng độ PGE2 được đo bằng bộ kits xét nghiệm PGE2, theo hướng dẫn của nhà sản xuất [67],[74],[80],[81]

2.7 Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và xử lý ANOVA bằng Tukey test (giá trị p < 0,05 xem là có ý nghĩa thống kê)

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Đánh giá tác dụng chống viêm của cao đặc KNC qua tác dụng làm bền vững màng tế bào hồng cầu người

Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và bảng 3.2

Bảng 3.1 Hiệu quả của cao đặc KNC và Diclofenac lên phần trăm ly giải

Không có sự khác biệt nhiều về phần trăm ly giải màng hồng cầu của cao đặc KNC so với Diclofenac sodium Ở nồng độ 2000 μg/mL của KNC, phần trăm ly giải màng hồng cầu chỉ còn 6,12%

Bảng 3.2 Hiệu quả của cao đặc KNC và Diclofenac lên phần trăm ổn định

Không có sự khác biệt nhiều về phần trăm ổn định màng hồng cầu của cao đặc KNC so với Diclofenac sodium Ở nồng độ 2000 μg/mL của KNC, phần trăm ổn định màng hồng cầu là 93,88%