Đánh giá hiệu quả li giải tế bào ung thư biểu mô buồng trứng của virus vaccine sởi in vitro

HỌC VIỆN QUÂN Y HỘI NỘI KHOA VIỆT NAMBÁO CÁO KHOA HỌC ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LI GIẢI TẾ BÀO UNG THƯ BIỂU MÔ BUỒNG TRỨNG CỦA VIRUS VACCINE SỞI IN VITRO Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2020 TS.BS

HỌC VIỆN QUÂN Y HỘI NỘI KHOA VIỆT NAM

BÁO CÁO KHOA HỌC

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LI GIẢI TẾ BÀO UNG THƯ BIỂU MÔ BUỒNG TRỨNG CỦA VIRUS VACCINE SỞI

IN VITRO

Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2020

TS.BS NGÔ THU HẰNG

GS TS Nguyễn Lĩnh Toàn PGS TS Hồ Anh Sơn

NỘI DUNG BÁO CÁO1

ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN

Tình hình Ung thư trên TG và Việt

Nam

• Globocan 2018: ~ 18,1 triệu ca K

mới; 9,6 triệu ca tử vong vì K

• Ở Việt Nam 2018 :164.671 ca ung

thư mới và 114.871 ca tử vong

• Tỷ lệ mắc ung thư mới ở Châu Á là

48,4%

Ung thư buồng trứng (UTBT)

• TG : UTBT 295.414 ca mắc mới

(1,6%); 184.799 ca tử vong (1,9%)

• Việt Nam: năm 2018 có 1.500 TH

UTBT mới mắc; 856 TH tử vong và

tỷ lệ sống trên 5 năm: 7,67%

* Nguồn: Globocan 2018

Freidman et al., 2012; Liu T-C et al (2007) Nat Clin Pract Oncol; Kirn D et al (2001) Nat Med

ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN

OLV

Cơ chế tác dụng của liệu pháp Oncolytic virus

ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN

Cơ chế tác dụng của liệu pháp Oncolytic virus

* Nguồn: Nature reviews/Drug Discovery (2015)

MeV trong liệu pháp virus

điều trị ung thư

* Nguồn: Moss, W.J and D.E Griffin, Global measles elimination Nat Rev Microbiol, 2006

Virus vaccine sởi:

- Vaccine giảm độc lực dòng MV-Edm

- MeV sử dụng 3 thụ thể chính: CD150, CD46

và nectin-4 để xâm nhập vào tế bào đích

- MeV: có tính lựa chọn các khối u cao, ổn

định về mặt di truyền và không có nguy cơ

gây bệnh cho cộng đồng

ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG

QUAN

• Chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LY GIẢI TẾ BÀO UNG THƯ BIỂU MÔ BUỒNG TRỨNG CỦA

VIRUS VACCINE SỞI IN VITRO” nhằm 2 mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng li giải tế bào ung thư biểu mô buồng

trứng của virus vaccine sởi in vitro

2 Đánh giá khả năng gây chết tế bào ung thư biểu mô

buồng trứng theo chương trình (apoptosis) của virus

vaccine sởi trên hệ thống FACS – Lyric

ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC

1 Đối tượng và chất liệu nghiên cứu

Dụng cụ, thiết bị

9

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC

Hóa chất

10

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC

2 Phương pháp nghiên cứu:

Tiến hành theo phương pháp thực nghiệm, tiến cứu, chọn thời điểm so sánh đánh giá quá trình điều trị

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC

Nuôi cấy tế bào ung thư buồng trứng người Ovac

Tăng sinh virus vaccine sởi Chuẩn độ virus (TCID50)

Mục tiêu 2: Đánh giá khả năng gây chết tế bào apoptosis (Flow cytometry)

Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng li giải

tế bào UTBT (MTT)

Kết quả

Kết luận

Kết quả

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Kỹ thuật nuôi cấy và tăng sinh tế bào Ovac, Vero

• B1: Lấy tế bào Ovac, Vero bảo quản trong nitơ lỏng -1960C

• B2: Rã đông ở 370C

• B3: Rửa TB, ly tâm loại bỏ môi trường để thu cặn tế bào

• B4: Chuyển vào chai nuôi cấy 75 cm2

• B5: Kiểm tra tế bào trên KHV

• B6: Cho chai nuôi vào tủ nuôi cấy tế bào có 5% CO2, 370C

• B7: Kiểm tra tế bào sau 24 giờ nuôi cấy

• B8: Kiểm tra và thay môi trường 2 - 3 lần/tuần

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 Xác định nồng độ virus bằng pp chuẩn độ TCID50

Giếng chứng : Giếng nhiễm virus

• Đưa tế bào Vero vào các giếng

trên phiến 96 giếng

• Nhiễm MeV với dải nồng độ từ

10-2 đến 10-7 vào các giếng của

phiến 96 giếng

• Quan sát thấy hình ảnh TB Hep2

nhiễm virus thì tiến hành nhuộm

xanh methylen 15%

• Đọc kết quả sau nhuộm xanh

methylen

• Tính TCID50

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3 Thử nghiệm MTT

• Chuyển tế bào OVac vào các

giếng của phiến 96.

• Sau 24 giờ, thay môi trường mới,

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

44 PP flow cytometry đánh giá tỉ lệ tế bào chết

theo chương trình

Nguyên lý

- Để kiểm tra tỉ lệ tế bào chết theo

chương trình và tế bào hoại tử NC sử

dụng anti-annexin V gắn chất phát

huỳnh quang là FITC và chất nhuộm

nhân tế bào phát huỳnh quang là

7-Amino Actinomycin D (7AAD).

- Annexin V có khả năng tương tác với

phosphatidyl serine nhờ chất xúc tác là ion

Ca2+.

- 7-Amino Actinomycin D có khả năng liên kết

rất mạnh với ADN của nhân tế bào.

7-Amino Actinomycin D

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PP flow cytometry đánh giá tỉ lệ tế bào chết

theo chương trình

• Chuẩn bị tế bào Ovac nhiễm virus in vitro

- Chuyển tế bào Ovac vào các giếng của đĩa 6

giếng

- Sau 24 giờ, thay môi trường mới có bổ sung

MeV chia 4 nhóm

- Thu các mẫu tế bào Ovac trên ở ngày 24; 48;

96 giờ sau điều trị

• Quy trình chạy flow cytometry theo hướng

dẫn của bộ kit Annexin V Apoptosis

Detection (BD)

Xử lý số liệu:

- Các thuật toán được sử dụng trong nghiên cứu:

- Phân phối chuẩn: so sánh trung bình 2 nhóm độc lập bằng T-test, so sánh trung bình 3 nhóm bằng ANOVA.

- Phân phối không chuẩn: so sánh trung vị 2 nhóm độc lập bằng kiểm định Mann-Whitney.

- Phần mềm SPSS 20.0 và GraphPad Prism 6.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nuôi cấy tế bào Ovac

KẾT QUẢ

Hình ảnh TB UT buồng trứng người Ovac

(a): 4 giờ; (b): 24 giờ (c): TB phát triển cụm (d): TB bám dính gần kín diện tích đĩa nuôi cấy

Tăng sinh virus vaccine sởi (MeV)

Hình ảnh tế bào Vero nhiễm virus (A): ngày 1; (B, C): ngày 2,3; (D, E): ngày 4,5 (F,G,H): ngày 6; (I): ngày 7

KẾT QUẢ

Tế bào Ovac nhiễm virus tạo hợp bào in vitro

Hình ảnh tế bào Ovac nhiễm virus tạo hợp bào

KẾT QUẢ

Ong H.T (2006) Oncolytic measles virus targets high CD46 expression on multiple myeloma cells

Chuẩn độ virus bằng thử nghiệm TCID50

Nồng độ pha loãng có CPE trên 50% gần nhất là 10-5 Nồng độ pha loãng có CPE dưới 50% gần nhất là 10-6

CCID50 của MeV= 105+0,5/0,2 mL = 5x105,5/mL

KẾT QUẢ

Liều ức chế 50% (IC50) của MeV trên tế bào ung thư OVac

KẾT QUẢ

Khả năng li giải tế bào Ovac của MeV và bằng thử nghiệm MTT

Khả năng li giải tế bào Ovac của MeV của MeV

bằng thử nghiệm MTT theo thời gian

KẾT QUẢ

So sánh kết quả MTT ở 3 thời điểm ngày 2, 3, 4.

p<0,00001

Tỷ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng

phương pháp flow cytometry

KẾT QUẢ

Tỉ lệ tế bào chết ở các nhóm nghiên cứu

p<0,01 p<0,01

p<0,0001

Tỷ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng

phương pháp flow cytometry

KẾT QUẢ

Tỉ lệ tế bào apoptosis ở các nhóm nghiên cứu

Kết quả chạy flow cytometry tế bào OVac

ở thời điểm 24, 48 và 96 giờ sau điều trị bằng MeV

MeV (1/4 MOI) MeV (1/2 MOI) MeV (1 MOI) CONTROL

Tỷ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng

phương pháp flow cytometry

KẾT QUẢ

Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở các nhóm nghiên cứu

p<0,001

KẾT LUẬN

Virus vaccine sởi (MeV) có tác dụng LI GIẢI TẾ

• MeV li giải tế bào Ovac trực tiếp tạo hợp bào từ ngày thứ 2, hiệu quả nhất ở ngày thứ 3 và 4

• Tỉ lệ tế bào sống ở các nhóm điều trị thấp hơn nhóm chứng

• MeV ly giải tế bào Ovac thông qua kích thích apoptosis Tỉ lệ tế bào chết apoptosis, apoptosis sớm ở các nhóm điều trị cao hơn nhóm chứng

30