Chuẩn hoá quy trình định lượng malondialdehyde nhằm đánh giá tình trạng stress oxy hoá trên mẫu mô cơ và máu

Trên cơ sở các vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: "Chuẩn hóa quy trình định lượng Malondialdehyde nhằm đánh giá tình trạng stress oxy hóa trên mẫu mô cơ và máu" với mục đích: - C

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

Nguyễn Thu Hà

CHUẨN HOÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MALONDIALDEHYDE NHẰM ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG STRESS OXY HOÁ TRÊN MẪU

MÔ CƠ VÀ MÁU

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy

Ngành Sinh học (Chương trình đào tạo chuẩn)

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Cán bộ hướng dẫn: TS Đỗ Minh Hà

L I C M N Ờ Ả ƠTôi xin được bày t lòng bi t n sâu s c nh t t i TS Đ Minh Hà, ngỏ ế ơ ắ ấ ớ ỗ ười th y đãầ

t n tình ch b o, hậ ỉ ả ướng d n tôi trong su tẫ ố quá trình h c t p, nghiên c u và th cọ ậ ứ ự

hi n khóa lu n này Tôi vô cùng trân tr ng nh ng đam mê, tính kiên trì và c n th n,ệ ậ ọ ữ ẩ ậ

phương pháp t duy, trách nhi m cùngư ệ tình yêu khoa h c mà th y mu n g i g mọ ầ ố ử ắcho th h c a chúng tôi!ế ệ ủ

Tôi xin g i l i c m n chân thành đ n PGS.TS Tr nh H ng Thái đã luôn giúp đ ,ử ờ ả ơ ế ị ồ ỡ

t o đi u ki n v v t ch t cũng nh tinh th n trong su t th i gian tôi h c t p vàạ ề ệ ề ậ ấ ư ầ ố ờ ọ ậlàm vi c t i phòng thí nghi m ệ ạ ệ

Tôi cũng xin trân tr ng c m n các th y giáo, cô giáo trong khoa Sinhọ ả ơ ầ

H c,trọ ường Đ i h c Khoa h c t nhiên, đ c bi t là các th y cô giáo trong b mônạ ọ ọ ự ặ ệ ầ ộSinh lý h c & Sinh h c ngọ ọ ười đã t n tình gi ng d y và dìu d t tôi trong su t th iậ ả ạ ắ ố ờgian h c t p t i trọ ậ ạ ường!

Trong quá trình h c t p và làm vi c t i phòng Proteomics và Sinh h c c u trúcọ ậ ệ ạ ọ ấthu c Phòng thí nghi m Tr ng đi m Công ngh Enzyme và Protein, trộ ệ ọ ể ệ ường Đ i h cạ ọKhoa h c t nhiên, tôi đã nh n đọ ự ậ ược s ch b o t n tình, chia s kinh nghi m làmự ỉ ả ậ ẻ ệ

vi c c a TS Nguy n Th Tú Linh, ThS Lê Lan Phệ ủ ễ ị ương, TS Bùi Phương Th o cùngảcác anh, các ch và các b n sinh viên cùng khóa Tôi xin chân thành c m n!ị ạ ả ơ

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học sự sống - Khoa Sinh học vàTrung tâm khoa học vật liệu - Khoa Vật Lý, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG

HN vì đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng các thiết bị nghiên cứu, giúp đỡ, hỗ trợ tôi rấtnhiều trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện khoa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin bày t ỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệEnzym và Protein, Trường Đại học Khoa học T ựnhiên đã tạo điều kiện giúp đ ỡtôitrong quá trình làm khóa luận này Cu i cùng,ố tôi vô cùng bi t n gia đình và b n bèế ơ ạ

đã khích l , đ ng viên và luôn bên tôi trong su t th i gian qua ệ ộ ố ờ

Hà N i, tháng 6 năm 2020ộ

Sinh viên

DANH M C B NG Ụ Ả

Bảng 1 Các giá trị hằng số hấp thụ phân tử [26] 18

B ng 2 Danh sách các hóa ch t dùng trong nghiên c u ả ấ ứ 20

B ng 3.Các thi t b s d ng trong nghiên c u ả ế ị ử ụ ứ 21

DANH M C HÌNH Ụ

Hình 1 Các dạng cấu hình của MDA [19] 10

Hình 3 Quá trình hình thành và chuy n hóa MDA ể 12

Hình 4 Ph n ng hình thành MDA t TMP ả ứ ừ 13

Hình 5 Ph n ng hình thành MDA t TEP ả ứ ừ 14

Hình 6 Ph n ng t o d n xu t màu TBARS c a hai phân t TBA v i MDA [19] ả ứ ạ ẫ ấ ủ ử ớ 16

Hình 7 Ph ươ ng pháp chung 22

Hình 8 Đồ thị dải phổ hấp thụ của MDA được tạo từ chất chuẩn TMP 26

Hình 9 Đồ thị dải phổ hấp thụ của chất chuẩn TMP 26

Hình 10 Giá trị OD của TBARS tại các pH và nhiệt độ ủ khác nhau với thời gian ủ là 30 phút 27

Hình 11 Giá trị OD của TBARS tại các pH và nhiệt độ ủ khác nhau với thời gian ủ là 60 phút 28

Hình 12 Biểu đồ so sánh giá trị độ hấp thụ trung bình tại các điểm pH, nhiệt độ khác nhau 29

Hình 13 Giá trị độ hấp thụ trung bình của TBARS khi có mặt của Hemoglobin 30

Hình 14 Giá trị OD trung bình của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của MSU 31

Hình 15 Giá trị trung bình độ hấp thụ của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của Sucrose 32

Hình 16 Giá trị OD trung bình của TBARS với MDA tạo ra từ TMP khi có mặt của Glucose 33

Hình 17 Giá trị trung bình của độ hấp thụ khi ủ các mẫu máu vào các dung dịch PBS, MSU 200 mM, MSU 800mM, Glucose 75 mg/L, Glucose 150 mg/L 34

Hình 18 Giá trị độ hấp thụ khi cho các mẫu gan chuột vào trong môi trường PBS, MSU, Glucose 36

Hình 19 Giá trị độ hấp thụ khi ủ các mẫu cơ đùi trong môi trường PBS, MSU,Glucose 37

MỞ ĐẦU

Stress oxy hóa được ghi nhận là một đặc điểm nổi bật của nhiều bệnh lý cấp và

mãn tính cũng như các bệnh gây ra do quá trình lão hóa ở người như bệnh tim mạch, ung

thư, rối loạn thần kinh, đái tháo đường Trạng thái stress oxy hóa của cơ thể có thể đượcđánh giá thông qua việc định lượng các biomarker chính của quá trình Peroxit hóa lipidnhư: MDA, HNE, Acrolein, F2-IsoProstane, Pentane, Ethane Trong đó, MDA là mộttrong số các biomarker được nghiên cứu nhiều nhất trong các trạng thái sinh lý và bệnh lý

cả trên mô hình động vật và trên người

Có rất nhiều phương pháp định lượng MDA khác nhau, trong đó phương pháp phảnứng TBAR là một trong những phương pháp đơn giản, và thông dụng nhất Ưu điểm củaphương pháp phản ứng TBARS là dễ thực hiện, năng suất cao, không đòi hỏi các trangthiết bị hiện đại và có thể định lượng bằng phương pháp quang phổ Tuy nhiên, kết quảphản ứng TBARS chịu nhiều ảnh hưởng bởi các hóa chất, quy trình cũng như các sảnphẩm phụ gây nhiễu đến kết quả Để khắc phục một phần các nhược điểm của phươngpháp phản ứng TBARS truyền thống, các thiết bị phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệunăng cao (HPLC), Sắc ký khí (GC), Khối phổ (MS) đã được áp dụng để cải tiến phản ứngTBARS Nhưng trên thực tế, không phải phòng thí nghiệm nào cũng được trang bị cácthiết bị phân tích hiện đại này

Trên cơ sở các vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: "Chuẩn hóa quy trình định

lượng Malondialdehyde nhằm đánh giá tình trạng stress oxy hóa trên mẫu mô cơ và máu" với mục đích:

- Chuẩn hóa và kiểm soát quy trình phản ứng TBARS để có một phương pháp địnhlượng sơ bộ Malondialdehyde tốt nhất

- Phân tích ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa tới quy trình tạo MDA và địnhlượng MDA từ chất chuẩn và trong mô cơ và máu bằng phản ứng TBARS

Đề tài được tiến hành tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thínghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên,Đại học Quốc gia Hà Nội

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Stress oxy hóa

Stress oxy hóa là một thuật ngữ chỉ trạng thái mất cân bằng giữa sự sản xuất, hoạt động của các "gốc tự do có nguồn gốc oxy" hay còn được gọi là các "hình thái oxy hóa hoạt động" (Reactive oxygen species - ROS) và khả năng của cơ thể sống trong việc khử các hợp chất trung gian hoạt tính cao, cũng như sửa chữa hư hại do những chất này gây nên Ngày nay, stress oxy hóa được ghi nhận là một đặc điểm nổi bật của nhiều bệnh lý cấp và mãn tính, cũng như các bệnh gây ra do quá trình lão hóa như bệnh tim mạch, ung thư, rối loạn thần kinh, đái tháo đường [17, 41]

Gốc tự do có thể được định nghĩa là các phân tử hoặc mảnh vỡ phân tử có chứa mộthoặc nhiều electron độc thân trong orbital nguyên tử hoặc phân tử Các gốc tự do ROS làmột trong các “gốc hình thái hoạt động” quan trọng nhất trong cơ thể sống [41] ROS cóthể được tạo thành từ nguồn gốc ngoại sinh hoặc nội sinh Nguồn gốc ngoại sinh như tia

UV, tia X, tia γ hoặc do các chất ô nhiễm trong khí quyển Nguồn gốc nội sinh như: làsản phẩm phụ của chuỗi truyền điện tử trong ty thể; hay được sản xuất bởi bạch cầu trungtính, đại thực bào trong viêm; hoặc là sản phẩm của các phản ứng được xúc tác bởi kimloại hay các enzymeví dụ NADPH oxidases (NOXs), xanthine oxidase (XO) [42]

1.2 Peroxit hóa lipid

M t trong các tác đ ng phá h y c a ROS lên các đ i phân t sinh h c đ c bi tộ ộ ủ ủ ạ ử ọ ặ ệ

ph i chú ý đ n là s peroxit hóa lipid (Lipid peroxidation – LPO) S peroxit hóaả ế ự ựlipid màng gây thay đ i các đ c tính sinh h c c a màng, làm b t ho t các th thổ ặ ọ ủ ấ ạ ụ ểliên k t màng hay các enzyme d n đ n làm gi m ch c năng c a các t bào bìnhế ẫ ế ả ứ ủ ế

thường và tăng tính th m c a màng H n n a, s peroxit hóa lipid còn có th gây raấ ủ ơ ữ ự ể

và “khu ch đ i” các t n thế ạ ổ ương t bào do t o ra các s n ph m oxi hóa th c p ế ạ ả ẩ ứ ấ [43].Khác v i các g c t do có th i gian t n t i ng n, các s n ph m th c p c a quáớ ố ự ờ ồ ạ ắ ả ẩ ứ ấ ủtrình peroxit hóa lipid có th i gian bán h y dài h n và có kh năng khu ch tán quaờ ủ ơ ả ếmàng t bào, t n công t i các đích xa n i chúng đế ấ ớ ở ơ ược hình thành Các s n ph mả ẩ

th c p c a quá trình peroxit hóa lipid là các aldehyde nh malonaldehyde (MDA),ứ ấ ủ ưhexanal, 4-hydroxynonenal (HNE) hay acrolein đã được ch ng minh có th ph nứ ể ả

ng v i các đ i phân t sinh h c nh ADN, Protein và Phospholipid

Hi n nay, peroxit hóa lipid đ ệ ượ c xem là nguyên nhân chính liên quan đ n ế

vi c oxy hóa, phá v c u trúc màng và t o ra các ch t đ c có th làm t n h i ệ ỡ ấ ạ ấ ộ ể ổ ạ hay gây ch t t bào ế ế Peroxit hóa lipid là m t quá trình ph c t p x y ra c th cộ ứ ạ ả ở ả ự

v t và đ ng v t Nó liên quan đ n s hình thành và phát tán các ậ ộ ậ ế ự g c lipid d th a ố ư ừ

đi n t ệ ử, s s p x p l i các liên k t đôi trong ch t béo không bão hòa (PUFA) d nự ắ ế ạ ế ấ ẫ

đ n phá h y màng lipid, cũng nh s n xu t m t lo t các s n ph m ph gây đ c,ế ủ ư ả ấ ộ ạ ả ẩ ụ ộtrong có các g c rố ượu, xeton, andehyde và ete [13]

S peroxit hóa các lipid ch a g c acid béo có th d n đ n m t chu i các “ph nự ứ ố ể ẫ ế ộ ỗ ả

ng dây chuy n phân nhánh” t o ra thêm g c t do m i S dĩ nh v y b i vì t

m t g c t do kích thích ban đ u (R°) có th d n đ n s hình thành c a r t nhi uộ ố ự ầ ể ẫ ế ự ủ ấ ềcác g c t do bên c nh lipid hydroperoxyde (LOOH) nh là: LO°, °OH và LOO° ố ự ạ ư [18].Các g c LOO° & LO° đố ược g i là các “s n ph m s c p” c a quá trình peroxit hóaọ ả ẩ ơ ấ ủlipid, chúng có th phân h y theo nhi u c ch khác nhau t o ra vô s các s nể ủ ề ơ ế ạ ố ả

ph m th c p n đ nh h n và gây đ c cho t bào S peroxit hóa c a các PUFAs làẩ ứ ấ ổ ị ơ ộ ế ự ủ

r t ph c t p vì có r t nhi u các lo i axit béo có m t trong c th c a đ ng v t cóấ ứ ạ ấ ề ạ ặ ơ ể ủ ộ ậ

vú Ngoài ra s ph c t p này còn do v trí c a các g c peroxyl ự ứ ạ ị ủ ố Esterbauer ướctình r ng có kho ng 120-150 s n ph m có th t o ra t quá trình peroxit hóa lipid,ằ ả ả ẩ ể ạ ừ

ch ng h n nh các g c lipid alkoxyl (LO°) ti p theo có th phân c t beta t o ra cácẳ ạ ư ố ế ể ắ ạ

s n ph m ng n h n (t C2 đ n C12 v i m t d i các nhóm ch c khác nhau) ho c bả ẩ ắ ơ ừ ế ớ ộ ả ứ ặ ị

bi n đ i ph n carboxylic c a nó (phân c t t o HNE); các g c lipid peroxyl (LOO°)ế ổ ầ ủ ắ ạ ố

có th t o s n ph m trung gian bicyclic endoperoxide r i t đó t o ra MDA ể ạ ả ẩ ồ ừ ạ [23,42]

Các “s n ph m th c p” c a quá trình peroxit hóa lipid có th là aldehyde,ả ẩ ứ ấ ủ ểalkane, isoprostane, alkene, ketone, alcohol và furane dưới các đi u ki n ph n ngề ệ ả ứkhác nhau Các s n ph m aldehyde đ c bi t đả ẩ ặ ệ ược chú ý b i chúng là các s n ph mở ả ẩ

ho t đ ng và có đ c tính v i t bào Trong các aldehyde thì MDA đạ ộ ộ ớ ế ược xem nh chư ỉ

th sinh h c c a s peroxit hóa các axit béo omega-3, omega-6 và đị ọ ủ ự ược s d ngử ụnhi u nh t đ đánh giá m c đ peroxit hóa lipid ề ấ ể ứ ộ [18, 23]

1.3 Malondialdehyde

1.3.1 Đ c đi m, tính ch t c a MDA ặ ể ấ ủ

Malondialdehyde (MDA) là một trong những sản phẩm cuối của quá trình peroxit hóa

lipid đang được quan tâm hàng đầu hiện nay MDA là chỉ thị của mức độ tổn thương

oxy hóa ở các tế bào và mô MDA cũng được sử dụng như một chỉ thị của tổn thương màng tế bào MDA có thể được tìm thấy trong hầu hết các mẫu sinh học bao

gồm huyết tương, huyết thanh, mô và nước tiểu

MDA có bản chất hóa học một hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử thấp (M=72,04g/mol), có công thức cấu tạo là C3H4O2, với hai nhóm aldehyde ở vị trí C1 và C3 và cótính axit yếu, pKa=4,46

MDA là một chất dễ bay hơi, ổn định dưới điều kiện trung tính Trong dung dịch vàpha khí, MDA bị enol hóa hoàn toàn và nhanh chóng giữa các dạng liên kết Hidro nội

phân tử không đối xứng (Hình 1.b và d) với một hàng rào thấp để biến đổi lẫn nhau

thông qua cấu trúc cộng hưởng liên kết Hidro đối xứng (Hình 1.c)

H椃

Trong các dung môi hữu cơ, MDA tồn tại ở dạng cấu hình cis (Hình 1.b và d) Tuy

nhiên trong nước, MDA tồn tại ở dạng cấu hình trans, dưới dạng bazo liên hợp (Hình 1.a

và e) MDA hấp thụ bước sóng ở vùng tử ngoại với dung môi là nước có tính axit, chúnghấp thụ cực đại ở bước sóng 245 nm với hằng số hấp thụ điện tử ε = 13.103(cm-1 M-1)

(Hình 2)[27]

MDA được xem là sản phẩm có khả năng đột biến cao [3] MDA có độ ổn định hóahọc cao và khả năng thấm qua màng tốt hơn các gốc tự do chứa oxy (ROS) khác, đồngthời MDA cũng không độc như 4-HNE và methyl glyoxal (MG) [20] Một số nghiên cứu

cũng đã ghi nhận MDA có thể hoạt động như một phân tử tín hiệu và điều hòa biểu hiệngen:

(i) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra MDA hoạt động như một phân tử tín hiệu và điềuhòa hoạt động tiết insulin khi có kích thích của glucose (GSIS) thông qua conđường Wnt, đây là tập hợp các con đường dẫn truyền tín hiệu tế bào khởi đầubằng loại protein Wnt và sẽ kết thúc khi protein Wnt này được tiếp nhận bởithụ thể bề mặt tế bào Ở nồng độ cao (5-10µM), MDA làm thay đổi tỉ lệATP/ADP và lượng Ca2+ nội bào, và ảnh hưởng tới biểu hiện gen, gây ra cácthay đổi trong hoạt động của GSIS [43]

(ii) Ở các tế bào sao ở gan, MDA kích thích biểu hiện gen collagen thông qua

tăng cường hoạt động của gen Sp1 (specificity protein-1), khiến lượng proteinSp3 và Sp1 tăng cao [22] Cả Sp1 và Sp3 có thể tương tác với các proteintrong hệ thống kiểm soát phiên mã của gene, các enzyme kiểm soát histone vàcác phức hệ cấu trúc nhiễm sắc thể, các ảnh hưởng này minh chứng cho việcSp1 và Sp3 là các yếu tố phiên mã quan trọng, tham gia tái cấu trúc lại nhiễmsắc thể và điều hòa biểu hiện gen [28]

Vì MDA là một aldehyde ưa điện tử, độ hoạt động của MDA phụ thuộc nhiều vào

pH Ở pH sinh lí, MDA tồn tại ở dạng ion enolate và có hoạt độ thấp Khi pH giảm,MDA tồn tại ở dạng beta-hydroxyacrolein và hoạt độ của nó tăng lên Hoạt độ của MDAcao chủ yếu dựa vào tính điện, dẫn đến MDA có xu hướng phản ứng mạnh mẽ với cácnucleophile [3] MDA có thể hoạt động như một nucleophile hoặc electrophile và tạothành các sản phẩm đa sắc [11, 31]

Aldehyde nói chung có khả năng phản ứng hình thành các sản phẩm cộng và phứchợp trong hệ thống sinh học và MDA cũng không ngoại lệ, mặc dù, ở pH sinh lý MDA

có độ hoạt động thấp Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh MDA đóng vai trò quan trọngtrong nhiều phản ứng sinh học Các thống kê gần đây cho thấy có tới 33 protein bị biếnđổi bởi MDA, trong đó có cả các enzyme, protein vận chuyển, protein khung xương tếbào, các protein của ty thể và protein chống oxy hóa [20] Những thay đổi DNA do MDAgây ra có thể là nguyên nhân đáng kể cho bệnh ung thư và các bệnh lý liên quan đến ditruyền khác [3]

1.3.2 Ngu n g c phát sinh MDA ồ ố

1.3.2.1 Ngu n g c n i sinh ồ ố ộ

MDA là sản phẩm cuối của quá trình peroxit hóa arachidonic và các phân tử PUFA

lớn [20] thông qua các con đường có enzyme hoặc không có enzyme (Hình 2).

(Chú thích: MDA được tạo ra theo con đường có enzyme (màu xanh nước biển), MDA

được tạo ra theo con đường không có enzyme (màu cam Các enzyme chính liên quan đến

sự hình thành MDA: cyclooxygenase (1), prostacyclin hydroperoxidase (2), thromboxanesynthase (3)).

i) Sản xuất MDA theo con đường có enzyme

Trong điều kiện in vivo, MDA có thể được sinh ra theo con đường có enzyme

trong quá trình tổng hợp thromboxane A2 (TXA2) [25, 36, 39] TXA2 là mộtchất chuyển hóa có hoạt tính sinh học của axit arachidonic (AA) được hìnhthành từ prostaglandin endoperoxide hoặc prostaglandin H2 (PGH2) dưới sự

xúc tác của thromboxane A2 synthase [5, 19], trong đó PGH2 được hìnhthành từ AA khi có xúc tác của cyclooxygenase [5, 7]

ii) Sản xuất MDA theo con đường không có enzyme

Lipid hydroperoxide được hình thành trong quá trình peroxit hóa lipid Gốcperoxyl của hydroperoxide có một liên kết đôi có thể kết hợp với một gốcnữa, tại vị trí liên kết đôi để tạo ra một gốc tự do mới Các gốc tự do trunggian được hình thành sau khi đóng vòng, có thể tiếp tục đóng vòng nữa để tạothành endoperoxide bi-cycle, có cấu trúc tương tự như prostaglandin, và tạo raMDA Ở con đường không có enzyme, quá trình hình thành MDA sẽ phụthuộc gốc tự do oxy gen AA là tiền chất quan trọng của endoperoxidebicycle, từ chất này, theo nhiều phản ứng không có enzyme nữa sẽ tạo ra

MDA (Hình 2) [20] Tuy nhiên, eicosanoid cũng được tạo ra theo con đường

này và có thể là tiền chất của endoperoxide bicycle và MDA [21, 44] Cácnghiên cứu gần đây cũng ghi nhận, trong một số điều kiện cụ thể, MDA cũngđược hình thành theo con đường không có enzyme [32]

1.3.2.2 Ngu n g c ngo i sinhồ ố ạ

Ảnh hưởng của bức xạ ion hóa hoặc không ion hóa, ô nhiễm không khí và khí độc tựnhiên như ozone, hóa chất và các chất độc hại như các chất khử trùng hóa học, sẽ trựctiếp hoặc gián tiếp gây ra stress oxy hóa Chế độ ăn không đủ chất dinh dưỡng cũng giántiếp dẫn đến stress oxy hóa bằng cách làm suy yếu cơ chế bảo vệ tế bào Các đại phân tử

tế bào, đặc biệt là lipid, protein và DNA là mục tiêu tự nhiên của quá trình oxy hóa Chấtoxy hóa có khả năng bắt đầu quá trình oxy hóa lipid bằng cách lấy một proton allylic từmột PUFA Quá trình này qua nhiều giai đoạn dẫn đến sự hình thành lipid hydroperoxide

từ đó dẫn đến tạo ra MDA [29]

1.3.2.3 Phương pháp hóa h c t ng h p MDAọ ổ ợ

Có thể tạo ra MDA theo phương pháp hóa học bằng cách thủy phân tetraethoxypropane (TEP) hoặc 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMP) trong môi trườngaxit

1,1,3,3-Downloaded by Quang Tr?n (tranquang141994@gmail.com)

H椃ả ứ ừ

Do MDA không ổn định và không thể lưu trữ ở dạng tinh khiết nên dung dịch củaMDA thường được sử dụng ngay khi làm phản ứng thủy phân axit TEP hay TMP Đã cónhiều báo cáo công bố cho rằng sự thủy phân các hợp chất này đi kèm với việc tạo ra cácsản phẩm phụ được cho là polyme của MDA Do đó, để tránh được sự hình thành của cácpolyme này, người ta đã sử dụng dung dịch TEP hay TMP rất loãng để thực hiện phảnứng thủy phân [4]

1.4 Các phương pháp đ nh lị ượng MDA

MDA được xem như một chỉ số chính để đánh giá mức độ peroxit hóa lipid Để địnhlượng MDA có thể sử dụng các phương pháp định lượng trực tiếp hoặc định lượng giántiếp thông qua các dẫn xuất của MDA với các chất khác

1.4.1 Đ nh l ị ượ ng tr c ti p ự ế

Các phương pháp phân tích định lượng MDA trực tiếp đều dựa trên nguyên lí kết hợpHPLC với đo quang phổ tử ngoại, ngoài ra có thể sử dụng thêm các phương pháp làmsạch mẫu trước khi chạy sắc ký như: lọc gel, siêu lọc và chưng cất

 Ưu điểm của phương pháp

Phương pháp định lượng trực tiếp cho độ đặc hiệu cao.

 Nhược điểm của phương pháp

Phương pháp đòi hỏi các thiết bị HPLC với detector có độ nhạy cao, thời gian chạysắc ký để thôi MDA cùng các thành phần khác của mẫu lớn, tùy thuộc vào mỗi loại mẫu,thời gian có thể rất khác nhau Thêm vào đó, MDA cũng có thể liên kết với các thànhphần của mẫu, khi đó cần phải thủy phân các liên kết này trước khi chạy HPLC đồng thờiphải phân tích xem lượng MDA liên kết là bao nhiêu để có thể định lượng đúng giữaMDA tổng số và MDA tự do [46]

1.4.2 Đ nh l ị ượ ng gián ti p thông qua d n xu t ế ẫ ấ

Các phương pháp định lượng MDA gián tiếp thông qua dẫn xuất cho phép định lượnggián tiếp MDA bằng cách định lượng các dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang các dẫnxuất màu, các dẫn xuất hấp thụ tia tử ngoại hay các sản phẩm khí

a Ưu điểm

Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện, năng suất lớn, có thể xử lí đồng thờiđược nhiều mẫu với tốc độ nhanh chóng, có thể định lượng bằng phương pháp quangphổ

b Nhược điểm

Các phản ứng tạo dẫn xuất của MDA đòi hỏi phải thực hiện trong các điều kiện

“khắc nghiệt” (môi trường axit, nhiệt độ cao, có các dung môi hữu cơ), điều này

khiến cho mẫu có thể tiếp tục bị oxy hóa hay phân hủy tạo ra các dẫn xuất phụ hoặc cácsản phẩm không mong muốn gây nhiễu đến việc định lượng So với phương pháp địnhlượng trực tiếp, các phương pháp định lượng thông qua dẫn xuất có thể dẫn đến các đánhgiá sai lệch về chỉ số peroxit hóa lipid nhiều hơn

Để giảm thiểu các ảnh hưởng của các dẫn xuất phụ đến kết quả, HPLC thường đượckết hợp để phân tách các hỗn hợp dẫn xuất Ngoài ra, việc tiến hành phản ứng trong điềukiện kị khí kết hợp với bổ sung các chất chống oxy hóa để giảm thiểu quá trình tự oxyhóa hay phân hủy của mẫu trong quá trình tạo dẫn xuất Tuy nhiên có rất ít các nghiêncứu trực tiếp chứng minh sự hiệu quả của biện pháp phòng ngừa trên [27]

1.5 Ph n ng TBARSả ứ

Năm 1944, Kohn và Liversedge đã quan sát thấy rằng các mô động vật được ủ trongđiều kiện hiếu khí tạo ra phản ứng có màu sắc với 2-thiobarbituric (TBA) [8] Bernheim

và cộng sự nhận thấy màu đỏ hồng này là kết quả của một phức hợp được hình thành từ

Downloaded by Quang Tr?n (tranquang141994@gmail.com)

các sản phẩm oxy hóa của axit béo không bão hòa và TBA Phản ứng TBARS sau đó đãđược phát triển trở thành một test nghiệm thực nghiệm về tự oxy hóa lipid và đã được sửdụng rộng rãi với các vật liệu sinh học như mô và thực phẩm [6]

Ph n ng TBARS x y ra d a trên s ph n ng c a phân t MDA và hai phân tả ứ ả ự ở ả ứ ủ ử ửMDA (nhóm monoenolic c a MDA t n công vào nhóm methylene c a hai phân tủ ấ ủ ửTBA) t o ra m t d n xu t màu TBARS (ạ ộ ẫ ấ H椃

peroxit hóa lipid [40] Tuy nhiên, phương pháp này còn có một số nhược điểm như khôngđặc hiệu, kết quả đo có thể bị nhiễu bởi 4 lí do chính:

(i) Các aldehyde khác ngoài MDA có thể tham gia phản ứng với TBA tạo dẫnxuất phụ có phổ hấp thụ gần giống với dải phổ hấp thụ ánh sáng của TBARS

từ MDA

(ii) Quá trình phân hủy của các lipid peroxide có thể tiếp tục xảy ra trong quátrình thực hiện phản ứng TBARS làm sai lệch kết quả MDA thực tế lúc banđầu có trong mẫu

(iii) Các ion kim loại chuyển tiếp có ảnh hưởng đến quá trình peroxit hóa lipid gây

ra bởi gốc tự do, sự có mặt của các ion kim loại gây ảnh hưởng nhiều đến độtin cậy của kết quả

(iv) Khi tiến hành phản ứng TBARS đối với các mẫu ở người và động vật, MDAtrong mẫu có thể hình thành từ các nguồn khác (như glycoprotein, sắc tố mật)

mà không phải do quá trình peroxit hóa lipid, dẫn đến kết quả không chínhxác [17, 24]

Để khắc phục các nhược điểm của phản ứng TBARS, ngày nay các nghiên cứuthường kết hợp phản ứng TBARS với HPLC để phân tách sản phẩm TBARS từ hỗn hợpcác dẫn xuất nhằm tăng độ đặc hiệu [17] Bên cạnh đó, việc bảo quản mẫu trong nitơ lỏng

và thêm vào các chất chống oxi hóa cũng được chú ý trong nhiều nghiên cứu Ngoài ra,

có các tác giả cho rằng, độ hấp thụ ở bước sóng 532 - 535 nm của các dẫn xuất phụ khác

so với dẫn xuất của MDA nhỏ hơn khoảng 1000 lần [26] Vì vậy chúng tôi chọn bướcsóng 535 nm để đo độ hấp thụ của sản phẩm phản ứng TBARS

Ngày nay có bốn quy trình Phản ứng TBA chính, bao gồm:

 Phản ứng TBARS với mẫu nguyên vẹn

 Phản ứng TBARS với dịch chiết nước hoặc axit của mẫu

 Phản ứng TBARS với dịch sản phẩm trưng cất của mẫu

 Phản ứng TBARS với lipid chiết từ mẫu

Trong bốn quy trình phản ứng TBARS này thì quy trình Phản ứng TBA vớimẫu nguyên vẹn là dễ thực hiện nhất Trong quy trình này, mẫu nguyên vẹnđược nghiền đồng thể và cho phản ứng với dung dịch TBA dưới điều kiện pH

Downloaded by Quang Tr?n (tranquang141994@gmail.com)

thấp (pH từ 2-3), nhiệt độ cao (95-100ºC), dẫn xuất màu tạo thành sau dó đượcchiết bằng n-butanol và đo độ hấp thụ bước song cực đại ở 530-535 nm Từ kếtquả độ hấp thụ, thông qua hằng số hấp thụ phân tử tính được lượng MDA trongmẫu, lượng MDA trong mẫu thường được tính theo lượng mg MDA/ kg mẫu.Bảng 1 liệt kê các giá trị hằng số hấp thụ phân tử của các tác giả khác nhau[26, 34]

Kim & LaBella (1987);

1.6 Tình hình nghiên c u trên th gi i và t i Vi t Namứ ế ớ ạ ệ

1.6.1 Tình hình nghiên c u trên th gi i ứ ế ớ

Phản ứng TBARS là một chủ đề nghiên cứu được rất nhiều quan tâm trên thế giới Dođây là một phản ứng được thực hiện nhằm định lượng MDA có trong mẫu, từ đó đánh giáđược mức độ stress oxy hóa

Phản ứng TBARS lần đầu được đề xuất bở Kohn và Liversedge vào năm 1944, dựatrên cơ sở phản ứng của phân tử MDA với hai phân tử TBA tạo ra dẫn xuất màu hấp thụcực đại ở vùng ánh sáng khả kiến (530-535 nm) và đỉnh hấp thụ thứ hai ở vùng bướcsóng tử ngoại (245-305 nm) [27]

Yu và Sinnhuber (1964) đã công bố rằng sự phân hủy của hydroperoxit hoặc các dẫnxuất và tiền chất của MDA bằng TBA có thể làm tăng MDA tự do [45]

Nghiên cứu của Manoharan và cs [52] trên huyết tương và hồng cầu bệnh nhân ungthư tế bào biểu mô miệng cho thấy mức TBARS màng hồng cầu tăng lên dần qua các giaiđoạn ung thư (giai đoạn khỏe mạnh, II, III, IV).Trong nghiên cứu về mức độ MDA vàchất chống oxi hóa được tìm thấy là có liên quan với các giai đoạn khối u của bệnh nhân[30]

Turner và cs (1954) [40] và Baumgartner và cs (1975) [12] đã chứng minh Sucrosetạo thành phức màu vàng khi phản ứng với TBA, gây nhiễu cho phản ứng TBARS dođỉnh ở (450-460 nm) và có chân phổ hấp thụ chồng lên một phần đỉnh hấp thụ củaTBARS ở bước sóng vùng màu hồng (530-537 nm)

Đã có nhiều nghiên cứu công bố nhiều chất gây nhiễu đến phản ứng TBARS nhưprotein của Chio và Tappel (1969) [15], Buttkus và Bose (1972) [14], diệp lục củaShamberger và cs (1977) [35] và forrmaldehyde của Almandos và cs (1988) [9]

1.6.2 Tình hình nghiên c u t i Vi t Nam ứ ạ ệ

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có các nghiên cứu sâu về cơ chế của phản ứng TBARScũng như các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng này Nhưng có một số bài báo và nghiêncứu có đề cập đến việc dung phản ứng TBARS nhằm bán định lượng quá trình stress oxihoá ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng như luận án TS của tác giả Phạm Mạnh Cường "Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng Malondialdehyde ở bệnh nhân ung thư đại trực tràngtrước và sau phẫu thuật triệt căn" [1], hay công trình khoa học "Mức độ peroxit hóa lipidtrên một số nhóm người có mắc độ vận động khác nhau" của Lê Thị Mai và cs (2016)trên tạp chí Sinh lí học Việt Nam [2] Và cũng đã có một số nghiên cứu đánh giá ảnh

Downloaded by Quang Tr?n (tranquang141994@gmail.com)

hưởng của điều kiện pH, nhiệt độ ủ mẫu, thời gian ủ mẫu đến phản ứng TBA Tuy nhiên,chưa có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của một số nhân tố như MSU, Glucose, Sucrosehay Hemoglobin đến phản ứng TBARS để kiểm tra liệu chúng có ảnh hưởng đến kết quảnghiên cứu hay không

2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

B ng 愃ऀ 2 Danh sách các hóa ch t dùng trong nghiên c uấ ứ

8 Thiobarbituric acid (TBA) Alfa Aesar (Mỹ), Merk (Đức)

9 Trichloroacetic acid (TCA) Gaoshen (Trung Quốc)

2.1.3 Thi t b ế ị

Quá trình thực hiện nghiên cứu sử dụng các dụng cụ và trang thiết bị của phòngProteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệEnzyme và Protein, và Trung Tâm Khoa học Vật liệu - Khoa Vật Lý cũng như Trung tâmKhoa học Sự sống - Khoa Sinh học Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu này

được liệt kê ở B愃ऀng 5.

B ng 愃ऀ 3.Các thi t b s d ng trong nghiên c uế ị ử ụ ứ

8 Máy đo quang phổ toàn dải UV - VIS

độ phân giải cao

Shimadzu (Nhật Bản)

30 và 60 phút Sau thời gian ủ, làm mát về 25°C rồi bổ sung đến thể tích 1,2ml bằngnước Để không làm thay đổi giá trị hấp thụ của dung dịch chuẩn, dung dịch được bảoquản tối, ở 2 - 4°C trong tối đa một tuần

2.2.2 nh h Ả ưở ng c a MSU, Glucose, Sucrose và Hemoglobin đ n ph n ng TBARS ủ ế ả ứ

2.2.2.1 Thí nghi m xét các tác đ ng c a MSU, Glucose, Sucrose, Hemoglobin đ n ệ ộ ủ ế

Ph n ng TBARS c a quy trình đ i v i màng t bào h ng c u t máuả ứ ủ ố ớ ế ồ ầ ừ

Cho 50 µl mẫu bao gồm MDA được tạo ra từ TMP và một trong bốn yếu tố đang xét(MSU, Glucose, Sucrose hoặc Hemoglobin) theo tỉ lệ 1:1 vào hỗn hợp dung dịch phảnứng gồm: 200 µl đệm Phosphate (pH 7,4) và 500 µl TBA 0,375% (pha trong HCl 0,3 N

và TCA 3%) Ủ hỗn hợp trong bể ổn nhiệt ở 98°C trong 30 phút Làm mát hỗn hợp saukhi ủ rồi mang đi ly tâm 1000 xg trong 10 phút Thu dịch nổi và tiến hành đo độ hấp thụ

Downloaded by Quang Tr?n (tranquang141994@gmail.com)