Rong biển đỏ là loài sinh vật quang tự dưỡng, sống ở biển, thuộc ngành Rhodophyta – được cho là đại diện nhóm rong biển lớn nhất. Hiện tại rong biển đỏ được ứng dụng để sản xuất agar thương mại và carrageenan trong công nghiệp. Tuy nhiên, ngày càng có nhiều nghiên cứu về lợi ích sức khỏe tiềm tàng điển hình như các hợp chất polyphenol, làm thúc đẩy quá trình chứng minh vai trò của thành phần rong biển.
Trang 1BÀI TỔNG QUAN
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA RONG BIỂN ĐỎ Nguồn: {Yang, 2020 #2}Yang, Y (2020) "ANTI-INFLAMMATORY EFFECT OF
RED SEAWEED EXTRACTS"
DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ELB Extractable Lipophilic Bioactives
BLB Bound Lipophilic Bioactives
TPC Total Phenolic Content (hàm lượng phenolic tổng số)
TFC Total Flavonoid Content (hàm lượng flavonoid tổng số)
TTC Total Tannin Content (hàm lượng tannin tổng số)
ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity (Khả năng hấp thụ gốc oxy)
NEP Non-extractable Polyphenol
HPLC High-performance Liquid Chromatography
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)
Trang 2DANH MỤC BẢNG
Bảng 1 Thành phần sắc tố đặc trưng của ngành rong biển
Bảng 2 Hiệu suất chiết xuất HQL và ZGC (mg/100g bột)
Bảng 3 Hàm lượng phenolic tổng số của dịch chiết EP và NEP của rong biển HQL và ZGC (mg GAE/100g bột)
Bảng 4: Hàm lượng Flavonoid tổng số trong chiết xuất ELB và BLB của rong biển HQL
và ZGC (mg CE/100g bột)
Bảng 5 Khả năng hấp thụ gốc oxy (μmol TE/g bột).mol TE/g bột)
Trang 3DANH MỤC HÌNH
Hình 1 Rong biển đỏ
Hình 2 Hàm lượng tổng số Phenolic của chiết xuất ELB và BLB của rong biển HQL và ZGC
Hình 3 Hàm lượng Flavonoid tổng số của chiết xuất ELB VÀ BLB của rong biển HQL
và ZGC
Hình 4 Khả năng hấp thụ gốc oxy (μmol TE/g bột).mol TE/g bột)
Trang 41 Rong biển đỏ là loài sinh vật quang tự dưỡng, sống ở biển, thuộc ngành Rhodophyta –
được cho là đại diện nhóm rong biển lớn nhất Hiện tại rong biển đỏ được ứng dụng để sản xuất agar thương mại và carrageenan trong công nghiệp Tuy nhiên, ngày càng có nhiều nghiên cứu về lợi ích sức khỏe tiềm tàng điển hình như các hợp chất polyphenol, làm thúc đẩy quá trình chứng minh vai trò của thành phần rong biển Hai loại rong biển
đỏ được nghiên cứu là HQL và ZGC nhằm xác định tác dụng chống viêm của các chiết xuất ELB và BLB từ hai loại rong biển đỏ này trong các đại thực bào RAW 264.7 Khả năng chiết xuất cũng như thành phần hóa học của ELB và BLB được đặc trưng bởi khả năng hấp thụ gốc oxy (ORAC), hàm lượng tannin tổng số (TTC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC), hàm lượng phenolic tổng số (TPC)… Bên cạnh đó còn các xét nghiệm nitric oxit (xét nghiệm NO) và khả năng sống của tế bào bởi phân tích Western blot, phân tích HPLC-MS/MS và xử lý thống kê Thông qua các nghiên cứu và số liệu thực nghiệm, ghi nhận được sự hiện diện của sáu hợp chất phenolic trong rong biển ZGC và một loại được phát hiện trong rong biển HQL Sở dĩ có sự khác nhau là do rong biển ZGC chiết xuất ELB và BLB không có sự chênh lệch cao Tất cả các chiết xuất này đều ức chế sản xuất oxit nitric (NO) trong các đại thực bào RAW 264.7 do LPS gây ra Ngoài ra, các phân đoạn ELB có tác dụng kháng viêm mạnh hơn các phân đoạn BLB ở hai loại rong biển Bên cạnh đó, rong biển ZGC cho thấy tác dụng mạnh hơn so với rong biển HQL, minh chứng sự hiện diện của các hợp chất phenolic như rutin, luteolin, acid chlorogen, acid caffeic và acid ferulic trực tiếp có liên quan đến tác dụng chống viêm Tổng quan lại,
cả hai chiết xuất ELB và BLB trong rong biển HQL và ZGC đều thể hiện các đặc tính và hoạt động chống viêm Tạo tiền đề cho các nghiên cứu trong tương lai sau này về các
thành phần trong rong biển đỏ đối với sức khỏe con người (400 từ)
2 Môi trường biển được xem là một trong những hệ sinh thái phong phú nhất trên thế
giới, tại đây có thể khai thác được các tài nguyên hoặc các động-thực vật có giá trị cao, trong đó có rong biển [1] Rong biển thuộc nhóm sinh vật bậc thấp, sinh sống chủ yếu tại các vùng nước mặn hay nước lợ ven biển [2] Đây là nhóm đối tượng được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, nuôi cấy tế bào, sinh học phân tử [3]…Rong biển chứa nhiều hợp chất vitanmin, chất chống oxy hóa, đây được xem là loại thực phẩm lành mạnh, tốt cho sức khỏe [4] Rong biển rất đa dạng và phong phú, được chia thành ba nhóm lớn dựa trên màu sắc của sắc tố quang hợp: rong biển lục (Chlorophyta) [5],[6], rong biển nâu (Phaeophyta) và rong biển đỏ (Rhodophyta) [7], một số nghiên cứu khác cho rằng nhóm tảo Lam cũng là một ngành thuộc rong biển [8],[9] Công dụng và vai trò của rong biển đã được nghiên cứu từ 2000 năm trước và đã được ghi nhận, tiếp tục phát triển theo lịch sử loài người [10],[11] Ngoài ra rong biển còn được sử dụng làm dược phẩm trong các bài thuốc dân gian [12] Một số công trình nghiên cứu về công dụng của rong biển như: người La Mã cổ đại sử dụng chúng để rửa vết thương, trong khi đó người
Ai Cập cổ đại điều trị ung thư vú bằng rong biển [13] Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu về rong biển hơn về tính kháng khuẩn, kháng nấm, giảm đau, chống viêm và
Trang 5chống oxy hóa ngày càng được báo cáo [14],[15] Điển hình, chiết xuất thô methanol của
Gracilaria corticata có tác dụng chống lại các vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes…[16] Ngoài ra, một số polysaccharides từ rong biển đỏ
được nghiên cứu là có hoạt tính kháng khuẩn và virus gây truyền nhiễm ở người [17], [18] Các polysaccharides này ngoài việc làm gián đoạn quá trình hấp thụ của virus tế bào bằng cách tương tác với các thụ thể protein ở bề mặt tế bào để ức chế sự nhân lên của virus RNA [19],[20] mà nó còn được xem là chất chông viêm tiềm năng [21] Đặc biệt tác dụng ức chế viêm phần lớn là ức chế các enzyme gây viêm như nitric oxidesynthase, cyclooxygenase và lipoxygenase [22],[23] Hiện tại, Trung Quốc đang là nước sản xuất rong biển lớn nhất thế giới trong đó rong biển đỏ là nhóm tảo biển lớn nhất với 607 loài chiếm 47,5%, chúng được sử dụng để sản xuất agar và carrageenan thương mại [24]
Ngoài ra còn được ứng dụng nhiều bởi hoạt tính sinh học [25] như Caloglossa leprieurii
để loại kí sinh trùng [26], Eucheuma chứa các hợp chất sinh học như carotenoid và
polyphenol [27] Hai loại rong biển đỏ được nghiên cứu là hong qi lin cai (HQL,
Eucheuma sp.) và zhe gu cai (ZGC, Caloglossa leprieurii) [28] (520 từ)
Hình 1: Rong biển đỏ Nguồn: Encyclopedia, Colombia University Press
Trang 6Ngành Chorophylls Sắc tố Phycobilins
Rong Lam
(Cyanophyta) a myxoxanthophyll,β-carotene,
zeaxznthin
C-phycocyanin (+) C-phycoerthrin (-)
Rong Đỏ
(Rhodophyta) a,d β-carotene, lutein,zeaxanthin R-phycoerythrin (+)R-phycocyanin (-)
Rong Nâu
(Phaeophyta) a, c fucoxanthin,β-carotene,
violaxanthin Rong Lục
(Chlorophyta) a, b β-carotene, lutein,neoxanthin,
violaxanthin, zeaxanthin Bảng 1: Thành phần sắc tố đặc trưng của ngành rong biển
Nguồn: Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến,
1993, Rong biển Việt Nam (phần phía Bắc) Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật Hà Nội
3 Nguyên vật liệu để tiến hành nghiên cứu này là hai loại rong biển có nguồn gốc từ
Trung Quốc: HQL và ZGC Rong biển HQL được thu mua tại chợ Quanjafu, còn rong biển ZGC được thu hoạch tại rừng Baoan Trước khi tiến hành thí nghiệm, các nguyên liệu này đều được tiền xử lý bằng cách nghiền thành bột mịn và bảo quản ở -20 Các℃ Các thí nghiệm lần lượt thực hiện như sau:
a Thí nghiệm 1: Chiết xuất ELB
Tiến hành trộn 10g bột rong biển với 200ml dung dịch lạnh acetone 80% (1% acid acetic) Dùng sóng siêu âm chiếu xạ trong 30 phút, sau đó ly tâm hỗn hợp này ở 10℃ Các trong 5 phút với tốc độ 3000 vòng/phút Quan sát, thu phần nổi trên bề mặt và lặp lại quá trình chiết xuất này Chất nổi được thu tiến hành xử lý ở 40 để loại bỏ acetone, cuối℃ Các cùng hòa tan trong 160ml ethanol Dung dịch ethanol phải được chiết xuất từ 3-5 lần để
có thể loại bỏ chất béo và các phân tử có tính ưa mỡ Sau đó phần ethanol cũng được loại
bỏ bằng cách bay hơi ở 40 Tiếp theo hỗn hợp này được chiết 2 lần bằng ethyl acetate.℃ Các Thu nhận phần nổi phía trên dung dịch bằng methanol và để trong tủ hút ẩm trong 12h
b Thí nghiệm 2: Chiết xuất BLB
Tương tự như thí nghiệm 1 nhưng phần cặn được xử lý bằng dung dịch NaOH 2M ở nhiệt
độ phòng trong khoảng 60 phút với điều kiện là không có oxy Phương pháp này dựa theo nguyên tắc thủy phân kiềm Lưu ý lắc đều hỗn hợp để thủy phân hoàn toàn Để đạt độ pH
Trang 7chuẩn (2.1 - 2.4) phải trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch HCl 6M Sau đó tiến hành chiết phenolic với ethyl acetate theo tỷ lệ 1:1, rồi ly tâm dung dịch này ở 10℃ Các trong 5 phút Các bước còn lại tương tự như thí nghiệm 1, thu phần dung môi hữu cơ và cho bay hơi để thu nhận phần nổi phía trên, đem đi hút ẩm
c Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng Phenolic tổng số
Hợp chất acid galic được xem là thước đo tiêu chuẩn cho phương pháp này Cụ thể các thí nghiệm nhỏ sẽ được tiến hành song song ở các nồng độ acid galic lần lượt 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 và 200 μmol TE/g bột).g/mL Phần dịch chiết thu được ở thí nghiệm 1 và 2 được điều chế bằng methanol 50% ở độ pha loãng 0.2mg/mL Phần aicd galic và dung dịch chuẩn được chiết vào đĩa 96 giếng với hàm lượng 20μmol TE/g bột).L và lặp lại 3 lần Kế tiếp, cho 20μmol TE/g bột).L nước khử ion và thuốc thử Folin-Ciocalteu đã pha loãng 10 lần Cuối cùng chiết 140μmol TE/g bột).L natri carbonat 7% cho vào các đĩa trên, tuy nhiên để xảy ra phản ứng thì phải kị ánh sáng ở
37 trong vòng 90 phút Sau đó đo quang phổ ở 760nm bằng thiết bị phổ kế và ghi nhận℃ Các kết quả Kết quả sẽ được tính bằng đơn vị mg aicd galic/100g bột rong biển
d Thí nghiệm 4: Xác định hàm lượng Flavonoid tổng số
Hợp chất Catechin được xem là thước đo tiêu chuẩn cho phương pháp này Các bước tiến hành tương tự như thí ngiệm 3 Đầu tiên catechin sẽ được điều chế bằng nước khử ion ở các nồng độ 0, 6.25, 12.5, 50, 100 và 200μmol TE/g bột).g/mL Sau đó cho các hỗn hợp này vào đĩa 96 giếng tương đương với 3 lần lặp lại cho mỗi nồng độ chuẩn Phần dịch chiết thu được ở thí nghiệm 1 và 2 được điều chế bằng methanol 50% ở độ pha loãng 0.2mg/mL Kế tiếp, cho 100μmol TE/g bột).L nước khử ion và 10μmol TE/g bột).L natri nitrit 5% vào hỗn hợp để xảy ra phản ứng Sau 6 phút, thêm 20μmol TE/g bột).L nhôm clorua 10% vào từng giếng để tiếp tục phản ứng Sau 5 phút, tiếp tục thêm 50 μmol TE/g bột).L natri hydroxit 1M Cuối cùng tiến hành đo ở bước sóng 510nm bằng phổ
kế và ghi nhận kết quả Kết quả sẽ được tính bằng đơn vị mg catechin/100g bột rong biển
e Thí nghiệm 5: Xác định hàm lượng Tanin tổng số
Catechin cũng được sử dụng là thước đo chuẩn cho phương pháp này Đầu tiên catechin được tiền xử lý với nước khử ion ở các nồng độ 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 và 200μmol TE/g bột).g/mL Dung dịch vanillin-H2SO4 được điều chế như sau: 4% vanillin trộn với aicd sunfuric ở nồng độ 30% theo tỷ lệ 1:1 Phần dịch chiết thu được ở thí nghiệm 1 và 2 được điều chế bằng methanol 50% ở độ pha loãng 0.2mg/mL và thêm vào đĩa 96 giếng cùng với 180μmol TE/g bột).L dung dịch vanillin-H2SO4 ở 37 trong khoảng 20 phút Sau đó tiến hành đo ở bước sóng℃ Các 510nm và ghi nhận kết quả Kết quả sẽ được tính bằng đơn vị mg catechin/100g bột rong biển
f Thí nghiệm 6: Xác định khả năng hấp thụ gốc oxy
Trang 8Trolox là hợp chất được sử dụng xem như thước đo tiêu chuẩn của phương pháp này Đầu tiên trolox được chuẩn bị bằng cách: trộn hỗn hợp 1mL ethanol và 9mL dung dịch đệm photphat để đạt các nồng độ 6.25, 12.5, 25, 50 và 100μmol TE/g bột).L Bên cạnh đó, fliorescein cũng được điều chế bằng đệm phophat ở nồng độ 75 μmol TE/g bột).M Trên đĩa 96 giếng có chứa 20μmol TE/g bột).L polyphenol (0.2 mg/mL) hoặc chất chuẩn sẽ được thêm vào 40 μmol TE/g bột).L fluorescein 75 μmol TE/g bột).M, lắc nhẹ để phản ứng xảy ra Sau 3 phút, thêm vào mỗi giếng 140 μmol TE/g bột).L dung dịch 2-amidinopropane và đặt ngay đầu đọc Tiến hành quan sát với cường độ huỳnh quang ở bước sóng chiết 485nm và bước sóng phát xạ 520nm Kết quả sẽ được tính dựa trên sự khác biệt về diện tích dưới đường cong phân rã fluorescein và được tính bằng đơn vị μmol TE/g bột).mol trolox/g bột rong biển
g Thí nghiệm 7: Xét nghiệm Nitric Oxit và khả năng sống của tế bào
Nitric oxit được biết đến là một trong những chất có liên quan đến các bệnh viêm mãn tính, ung thư, tiểu đường [29] Ngoài ra trong tế bào, đại thực bào RAW 264.7 đã được kiểm chứng cho cơ chế chống viêm, là tiền đề cho nghiên cứu, cụ thể là phương pháp này [30] Các tế bào RAW 264.7 sau khi được nuôi cấy sẽ tiến hành gieo vào đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, thu môi trường và xử lý tế bào trong các môi trường khác nhau Cụ thể, 3 μmol TE/g bột).L lipopolysaccharide được thêm vào môi trường vừa thu được, trộn đều
và thêm vào đĩa với thể tích 200 μmol TE/g bột).L mỗi giếng ( trừ mẫu âm tính của tế bào) Sau đó, trích phần nổi trên mặt giếng sang đĩa khác tương ứng và trộn với 100 μmol TE/g bột).L thuốc thử Griess trên mỗi giếng, để trong 10 phút và tiến hành quan sát ở nhiệt độ 37 Ghi nhận℃ Các
độ hấp thụ ở bước sóng 540 để xác định tạo ra NO Các tế bào đã xử lý còn lại trong đĩa ban đầu sẽ được kiểm tra khả năng sống của tế bào Ở thí nghiệm này, TTM (3-(4,5-dimethyl2-thizolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) sẽ được sử dụng làm chất chỉ thị khả năng tồn tại của tế bào bằng cách khử formazan, tùy thuộc vào ty thể Sau thời gian 24 giờ xử lý mẫu ban đầu, tiến hành loại bỏ phần chất nổi trên bề mặt Sau đó cho vào mỗi giếng 100 μmol TE/g bột).L dung dịch MTT Phần dung dịch này được điều chế bằng cách hòa bột MTT vào môi trường nuôi cấy tế bào ở nồng độ 0.1 μmol TE/g bột).g/mL Tiến hành đặt đĩa trong tủ
ấm ở nhiệt độ phòng để xử lý MTT Sau 2 giờ, phần nổi phía trên sẽ tiếp tục được loại bỏ
và thêm 100 μmol TE/g bột).L DMSO trên mỗi giếng Sử dụng đầu đọc đĩa để đo độ hấp thụ ở bước sóng 570nm
h Thí nghiệm phân tích Western blot
Tế bào RAW 264.7 được đem đi nuôi cấy ở nồng độ 2.5 ×10℃ Các 5 tế bào/mL và đặt trong tủ
ấm ở nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, phần nổi phía trên sẽ được loại bỏ và các tế bào được
xử lý bằng 1 μmol TE/g bột).g/mL LPS Các tế bào này sau khi được xử lý sẽ tiếp tục trong 24 giờ nữa Sau đó, phần nổi phía trên được loại bỏ, ta thu được tế bào sau khi rửa bằng PBS lạnh hai lần Các tế bào này tiếp tục được phân giải trong dung dịch đệm RIPA có chứa chất ức chế proteinase và ức chế phosphatase Sau 30 phút ly giải, phần huyền phù tế bào sẽ được
xử lý Tiếp tục thu thập phần chất nổi phía trên, đồng thời xác định nồng độ protein bằng
Trang 9phương pháp BCA Sau đó toàn bộ dịch trích ly giải tế bào được đưa về -80 để phục℃ Các
vụ các thí nghiệm tiếp theo
i Phân tích thống kê
Tất cả dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) Với các thí nghiệm độc lập và được phân tích phương sai một chiều (ANOVA) Dữ liệu được báo
cáo trung bình ± SD Sự khác biệt ở p<0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê (1611 từ)
4 Kết quả thí nghiệm:
a Kết quả thí nghiệm chiết xuất ELB và BLB
Hiệu suất chiết xuất của HQL và ZGC có sự chêch lệch với nhau Với hàm lượng 70g bột rong biển HQL sử dụng ta thu được 5163mg ELB (0.74%) và 84.2mg BLB (0.12%) Đối với 20g bột rong biển ZGC ta thu được 121.41mg ELB (0.61%) và 133.5mg BLB (0.67%) Ở rong biển HQL có sự chêch lệch giữa ELB và BLB, hàm lượng ELB thu được cao gấp 6 lần so với hàm lượng BLB Tuy nhiên đối với rong biển ZGC thì hàm lượng ELB và BLB ở mức tương đương nhau Các nguyên nhân ảnh hưởng đến sự chêch lệch này có thể là do môi trường, nhiệt độ, ánh sáng và chất lượng rong biển…
Hiệu suất, năng xuất chiết ELB (mg/100g bột) BLB (mg/100g bột)
Bảng 2: Hiệu suất chiết xuất HQL và ZGC (mg/100g bột)
b Kết quả thí nghiệm xác định hàm lượng Phenolic tổng số
Kết quả thí nghiệm ghi nhận hàm lượng TPC ở rong biển ZGC cao hơn đáng kể so với rong biển HQL Cụ thể, hàm lượng chiết xuất ZGC BLB cao nhất 52.02 ± 2.00mg GAE (Gallic Acid Equivalent) Trong khi hàm lượng chiết xuất của HQL ELB ở mức thấp nhất
là 3.16 ± 0.24mg GAE và hàm lượng chiết xuất của HQL ELB thấp nhất là 3.16 ± 0.24mg GAE Bên cạnh đó, năng suất của ELB và BLB của rong biển ZGC ở mức tương
tự nhau Vì vậy có thể thấy rằng, ngoài hợp chất phenolic, các hợp chất khác cũng có trong dịch chiết thu được
Bảng 3: Hàm lượng phenolic tổng số của dịch chiết EP và NEP của rong biển HQL và
ZGC (mg GAE/100g bột)
Trang 10Hình 2: Hàm lượng tổng số Phenolic của chiết xuất ELB và BLB của rong biển HQL và
ZGC
c Kết quả thí nghiệm xác định hàm lượng Tanin tổng số
Kết quả của thí nghiệm ghi nhận tổng hàm lượng TFC của cả hai rong biển HQL và ZGC, đặc biêt là ZGC có hàm lượng chiết xuất cao hơn đáng kể so với rong biển HQL Đối với rong biển HQL cả BLB và ELB đều có hàm lượng flavonoid tổng số rất thấp cũng như không có sự khác biệt giữa TFC của ELB và TFC của BLB Bên cạnh đó, kết quả đối với rong biển ZGC lại khác hoàn toàn, điển hình TFC của phần BLB là 57.27 ± 5.36mg CE/100g bột, cao gấp ba lần so với phần ELB là 18.43 ± 0.81mg CE/100g bột
Bảng 4: Hàm lượng Flavonoid tổng số trong chiết xuất ELB và BLB của rong biển HQL
và ZGC (mg CE/100g bột)
Hình 3: Hàm lượng Flavonoid tổng số của chiết xuất ELB VÀ BLB của rong biển HQL
và ZGC