Thiết bị

Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHỦ ĐỀ: Chẩn đoán s

TP Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHỦ ĐỀ: Chẩn đoán sự hiện diện của Sarcoptes Scabiei

từ vết xước da ở bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ bằng

phương pháp PCR

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm lớp : THỨ 5 CA 3

Niên khóa : 2021 – 2025

TP.Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSH

CHỦ ĐỀ: Chẩn đoán sự hiện diện của Sarcoptes Scabiei

từ vết xước da ở bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ bằng

phương pháp PCR

Hướng dẫn khoa học:

TS HUỲNH VĂN BIẾT

ThS TRƯƠNG QUANG TOẢN

Nhóm sinh viên thực hiện:

Dương Phạm Phương Nguyên – 21126428 Trang Thị Tường Vi – 21126236

Nguyễn Hùng Cường – 21126295

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

LỜI CẢM ƠN iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH v

DANH SÁCH CÁC BẢNG vi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Một số đặc điểm của Sarcoptes scabiei 2

2.1.1 Phân loại khoa học ghẻ Sarcoptes scabiei var Hominis 2

2.1.2 Hình thái học và chu kỳ sinh học của cái ghẻ Sarcoptes scabiei var hominis 2

2.2 Triệu chứng lâm sàng 4

2.2.1 Các triệu chứng lâm sàng 4

2.2.2 Các thể lâm sàng của bệnh ghẻ 5

2.3 Chẩn đoán, chẩn đoán phân biệt và điều trị 6

2.3.1 Chẩn đoán 6

2.3.2 Chẩn đoán phân biệt 6

2.3.3 Điều trị 6

2.3.4 Nguyên tắc điều trị 7

2.4 Nhận diện con ghẻ Sarcoptes scabiei bằng phương pháp PCR 7

2.4.1 Phương pháp PCR 7

2.4.2 Ứng dụng PCR trong xét nghiệm y học 8

2.4.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR 9

2.4.3.1 Ưu điểm 9

2.4.3.2 Nhược điểm 9

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 10

3.2 Vật liệu 10

3.3 Phương pháp nghiên cứu 10

3.3.1 Nhận diện bằng kính hiển vi 10

3.3.2 Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR 10

3.3.2.1 Ly trích mẫu 10

3.3.2.2 Phản ứng PCR 12

3.3.3 Xử lí số liệu 13

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ DỰ KIẾN VÀ THẢO LUẬN 14

4.1 Kết quả kiểm tra chất lượng DNA dự kiến 14

4.2 Kết quả khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR dự kiến 14

4.2.1 Kết quả PCR được tiến hành thử trên web Primer-BLAST 14

4.2.2 Kết quả sản phẩm PCR 15

4.3 Kết quả thống kê nhận diện Sarcoptes scabiei của bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ 16

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 17

5.1 Kết luận 17

5.2 Đề nghị 17

TÀI LIỆU THAM KHẢO 18

LỜI CẢM ƠN

Chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến khoa Khoa học sinh học và trường Đại học Nông Lâm TP HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em được học tập bộ môn Thiết bị và kỹ thuật trong công nghệ sinh học, biết thêm nhiều các phương pháp kỹ thuật hiện đại để áp dụng vào nghiên cứu về sau và hoàn thành Seminar về chủ đề “Chẩn đoán sự hiện diện của

Sarcoptes Scabiei từ vết xước da ở bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ bằng phương pháp

PCR” Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến giảng viên hướng dẫn của chúng em TS Huỳnh Văn Biết đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt kiến thức và hướng dẫn chúng em trong quá trình học tập và làm báo cáo khoa học

Chúng em đã cố gắng vận dụng những kiến thức đã học được và tìm hiểu thêm nhiều thông tin để hoàn thành bài tiểu luận này Tuy nhiên, do kiến thức còn hạn chế và không có nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên khó tránh khỏi những thiếu sót trong bài làm Chúng em xin chân thành cảm ơn thầy đã dành thời gian đọc tiểu luận môn học của chúng em!

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR: Polymerase Chain Reaction

IgE: Globulin miễn dịch E

CT - cholera toxin: độc tố ruột của vi khuẩn tả

V erotoxigenic E.coli (VTEC)

TopPURER® GENOMIC DNA EXCTRACTION KIT: TL Buffer, CL Bufer, WB1 Buffer, WB2 Buffer, EB Buffer, Proteinase K, PBS Buffer, Ethanol và dụng cụ (cột silica, tube) WB1, WB2 : Washing buffer 1,2

DNA: Deoxyriboncleic acid

OD: Optical Density

TAE: Tris – Acetate – EDTA

vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hình thái ghẻ Sarcoptes scabiei trưởng thành 2

Hình 2.2 Trứng Sarcoptes scabiei 3

Hình 2.3 Cái ghẻ đào hang dưới da và đẻ trứng 3

Hình 2.4 Ghẻ ký sinh thực bào 4

Hình 2.5 Tổn thương da trên bệnh nhân nhiễm Sarcoptes scabiei 4

Hình 2.6 Triệu chứng của bệnh ghẻ gây ra 5

Hình 2.7 Một chu kỳ phản ứng PCR 7

Hình 2.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR với nhiều mẫu trong xét nghiệm 9

Hình 2.5 Phương pháp lên men trạng thái rắn 5

Hình 2.6 Một chu kỳ phản ứng PCR 7

Hình 4.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 1 % M: ladder 100bp 14

Hình 4.2 Kết quả PCR được tiến hành trên Primer BLAST 15

Hình 4.3 Hình ảnh đại diện cho điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen mục tiêu 15

v

vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng 10

Bảng 3.2 Trình tự primer 12

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 12

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt 13

Bảng 4.1 Kết quả thống kê và so sánh số bệnh nhân dương tính và âm tính từ hai phương pháp nhận diện bằng kính hiển vi và nhận diện bằng phản ứng PCR dự kiến 16

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh ghẻ (Scabies) là bệnh nhiễm trùng trên da do ký sinh trùng ghẻ Sarcoptes

scabiei hominis gây nên có tính nghiêm trọng toàn cầu ở người và các động vật khác, cả

vật nuôi và động vật hoang dã (Tamieka và ctv, 2018) Bệnh có ở khắp mọi trên thế giới, nhất là ở những nơi thiếu vệ sinh, môi trường sống thấp kém Bệnh ghẻ được tìm thấy

từ thế kỷ XVI nhưng mãi đến năm 1934 mới tìm được ký sinh trùng gây bệnh ghẻ ở người (Theo 4568/QĐ-BYT)

Kí sinh trùng ghẻ lây lan từ người này qua người khác do dùng chung quần áo, chăn, chiếu hoặc do tiếp xúc khi quan hệ tình dục Bệnh có thể xuất hiện thành ổ dịch ở các đơn vị tập thể, ở các đơn vị tân binh mới nhập ngũ, vùng dân cư đông đúc, nhà ở chật hẹp, thiếu vệ sinh, ở trại giam Bệnh ghẻ tuy không gây hậu quả nghiêm trọng về sức khỏe, nhưng nếu không được điều trị chu đáo bệnh sẽ gây ra các biến chứng như: nhiễm trùng, chàm hóa, viêm cầu thận cấp

Theo Bệnh viện Phong – Da liễu Trung ương Quy Hòa bệnh ghẻ được chẩn đoán bằng nhiều phương pháp áp dụng trong thực hành lâm sàng như là soi tìm dưới kính hiển vi, có thể thấy cái ghẻ, trứng ghẻ, chất cặn thải của cái ghẻ Phương pháp khác mang tính chất in vivo là sử dụng soi da dermoscopy Nhưng so với các biện pháp chấn đoán lâm sàn này thì việc chẩn đoán bệnh ghẻ bằng phương pháp PCR- Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase có độ chính xác cao hơn, không gây nhiều biến đổi chủ yếu là do dương tính giả và là một biện pháp khả thi cho sử dụng rộng rãi và hiệu quả (Tamieka

và ctv, 2018)

1.2 Mục tiêu

Xác định chính xác kí sinh trùng con ghẻ Sarcoptes scabiei có xuất hiện trên da của

bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ghẻ Chẩn đoán bệnh đúng đắn và kịp thời chữa trị

1.3 Nội dung thực hiện

Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số đặc điểm của Sarcoptes scabiei

2.1.1 Phân loại khoa học ghẻ Sarcoptes scabiei var Hominis

Cái ghẻ ở người do ký sinh trùng Sarcoptes scabiei var hominis gây ra, thuộc

giới động vật tiết túc, ngành động vật chân khớp (Arthropoda), lớp nhện (Arachnida),

lớp phụ Acari, bộ Sarcoptiformes, họ Sarcoptoidae, giống Sarcoptes, loài S scabiei (De

Geer, 1778)

2.1.2 Hình thái học và chu kỳ sinh học của cái ghẻ Sarcoptes scabiei var hominis

Ngoài lây nhiễm cho người, ghẻ còn có thể ký sinh trên các loài động vật khác

nhau do đó có sự biến đổi hình thái, nên có nhiều tên phụ loài như: Sarcoptes scabiei

hominis, S scabiei equi, S Scabiei ovis Ghẻ trưởng thành có hình bầu dục, màu xám,

miệng rất ngắn, lưng gồ, bụng phẳng, không có mắt, không có lỗ thở, có bốn cặp gồm tám chân, mỗi chân có 5 đốt, hai chân trước nằm hẳn về phía trước, cuối chân trước dài

và hình ống như các hấp khẩu, còn hai chân sau nằm hẳn về phía sau thân, có gai cứng Trên cơ thể có nhiều gai mọc thưa và có dáng dấp như một con rùa, thân mình có nhiều nếp gấp và bao phủ bởi nhiều gai cứng Tận cùng một số chân có mang ống hút Ghẻ đực có nhiều hấp khẩu trên chân, ngoại trừ cặp chân thứ ba, để dễ dàng phân biệt với ghẻ cái Ghẻ cái dài 0,3 - 0,45 mm và rộng 0,25 - 0,35 mm, kích thước con đực khoảng

¾ con ghẻ cái Scabiei là một giống ký sinh trùng trên da và thuộc một phần của họ ve

bét lớn hơn thường có tên gọi “scab mites” (ve bét gây vảy da), liên quan đến ghẻ

Psoroptes spp thường nhiễm trên da động vật nuôi Bệnh ghẻ trong thú y ảnh hưởng

trên các vật nuôi hoặc nhiễm và lở chân ở chim nuôi

Hình 2.1 Hình thái ghẻ Sarcoptes scabiei trưởng thành

Về chu kỳ sinh sản và phát triển, con ghẻ Sarcoptes scabiei var hominis trải qua

4 giai đoạn trong đời sống của nó gồm trứng, ấu trùng, nhộng và con trưởng thành Tùy thuộc vào nhiễm vật chủ nào, các con cái thường hay đào hầm trong da, chủ yếu lớp ngoài da, ở đó ghẻ cái đẻ 2 - 3 trứng mỗi ngày Trứng hình ô van dài khoảng 0,1 - 0,15

mm, nở ấu trùng trong vòng 3 - 4 ngày sau đó

Hình 2.2 Trứng Sarcoptes scabiei

Một con cái có thể đẻ 30 trứng rồi chết ở cuối đường hầm mà chúng đào trong

da Trong quá trình nở, các ấu trùng 6 chân di chuyển đến bề mặt da và sau đó tiếp tục đào hầm vào trong các túi nhỏ, thường là các nang chân tóc, ở đó các túi nhỏ hình thành (các túi này nhỏ và ngắn hơn đường hầm) Sau 3 - 4 ngày, ấu trùng sẽ rụng lông thành các con nhộng có 8 chân

Hình 2.3 Cái ghẻ đào hang dưới da và đẻ trứng

Các nhộng này sẽ rụng lông lần hai thành nhộng lớn hơn, trước khi chúng rụng lông thành con ghẻ trưởng thành Các con ghẻ trưởng thành rồi giao phối nhau khi con đực xuyên qua các túi trú ẩn của con cái và sự giao phối này chỉ xảy ra một lần Các con

cái thụ tinh sẽ rời túi chứa tìm đến nơi thích hợp để đào hầm liên tục Một khi có vị trí nào đó được phát hiện, con cái sẽ tạo ra các đường hầm hình chữ S, đẻ trứng tiếp tục Con cái sau đó tiếp tục đào hầm, đẻ trứng duy trì cuộc sống của nó đến khi chết

Hình 2.4 Ghẻ ký sinh thực bào 2.2 Triệu chứng lâm sàng

2.2.1 Các triệu chứng lâm sàng

Thời kỳ ủ bệnh thay đổi từ 2 - 40 ngày, trung bình từ 10 - 15 ngày Tổn thương đặc hiệu của bệnh ghẻ là luống ghẻ và mụn nước (còn gọi là mụn trai và đường hang) Mụn nước trong bệnh ghẻ thường nhỏ mọc rải rác, trong như hạt ngọc (nếu chưa bị bội nhiễm), nhỏ bằng hạt tấm, không mọc thành chùm, thường mọc ở vùng da non

Đường hang do cái ghẻ đào ở lớp sừng là một đường cong ngoằn ngoèo hình chữ chi, dài 2 - 3 cm, gờ cao hơn mặt da, màu trắng đục hay trắng xám, không khớp với hằn

da, ở đầu đường hang có mụn nước 1 - 2 mm đường kính, chính là nơi cư trú của cái ghẻ Đường do cái ghẻ đào thường hiếm thấy, nhưng khi thấy đường đào của nó thì có thể chẩn đoán xác định bệnh ghẻ

Hình 2.5 Tổn thương da trên bệnh nhân nhiễm Sarcoptes scabiei

Tổn thương thứ phát thường do ngứa gãi gây nên, bao gồm: vết xước gãi, vết trợt, sẩn, vẩy tiết, mụn nước, mụn mủ, chốc nhọt , sẹo thâm màu, bạc màu, tạo nên hình ảnh được ví như bức tranh "khảm xà cừ", "hình hoa gấm"

Triệu chứng cơ năng: ngứa nhiều nhất là về đêm, lúc đi ngủ do cái ghẻ di chuyển gây kích thích đầu dây thần kinh cảm giác ở da và một phần do độc tố ghẻ cái tiết ra khi đào hang Ngứa gãi gây nhiễm khuẩn và có thể có sốt Người bị nhiễm ký sinh trùng ghẻ lần đầu tiên trong vòng 2 tuần đầu hoàn toàn chưa có biểu hiện ngứa mặc dù ngứa ghẻ được so sánh với đau đẻ và đòn ghen Nhưng do có thể mới bị ghẻ xâm nhập nên chưa có sự phản ứng lại nên chưa thấy ngứa, điều đó lý giải tại sao một số bệnh nhân có tổn thương ghẻ thực sự mà hoàn toàn chưa thấy ngứa Những người bị tái nhiễm ghẻ thì xuất hiện ngứa dữ dội ngay từ khi cái ghẻ xâm nhập vào da

Hình 2.6 Triệu chứng của bệnh ghẻ gây ra

Vị trí tổn thương đặc hiệu: lòng bàn tay, kẽ ngón tay, ngấn cổ tay, mu tay, bờ trước nách, quanh rốn, mông, 2 chân, đặc biệt nam giới hầu như đều có tổn thương ở qui đầu, thân dương vật Phụ nữ còn bị ở núm vú, trẻ em còn bị ở gót chân, lòng bàn chân, ghẻ ít khi có tổn thương ở đầu mặt

2.2.2 Các thể lâm sàng của bệnh ghẻ

Ghẻ giản đơn: chỉ có đường hang và mụn nước, ít có tổn thương thứ phát

Ghẻ nhiễm khuẩn: có tổn thương của ghẻ, mụn mủ do bội nhiễm liên cầu, tụ cầu, có thể gặp biến chứng viêm cầu thận cấp

Ghẻ biến chứng viêm da, eczema hoá: do chà xát cào gãi lâu ngày

Ghẻ nhiễm khuẩn có biến chứng viêm cầu thận cấp

Ghẻ Na Uy (Norwrgian) – ghẻ vảy: khác với ghẻ thông thường, tổn thương ghẻ không

phải là mụn nước mà là đám vảy tiết lẫn vảy da dày giống như bệnh vảy nến

Tổn thương cả ở dưới móng, mặt và đầu Điều đặc biệt là triệu chứng ngứa rất nhẹ nhưng lại rất nhiều cái ghẻ nằm trong đám vảy tiết Ghẻ vảy rất hiếm gặp chỉ thấy ở những người có miễn dịch kém như: bệnh nhân AIDS, hội chứng Down, người mắc bệnh tâm thần phân liệt

2.3 Chẩn đoán, chẩn đoán phân biệt và điều trị

2.3.1 Chẩn đoán

Chẩn đoán dựa vào các yếu tố và các phương pháp sau:

Tổn thương ở vị trí đặc biệt

Triệu chứng lâm sàng

Ngứa nhiều về đêm

Dịch tễ: gia đình, đơn vị, tập thể nhiều người bị

Soi tươi: dùng curette nạo mụn nước ở đầu luống ghẻ hoặc nạo luống ghẻ, cho lên lam kính, nhỏ một giọt KOH 10%, soi kính hiển vi thấy trứng hoặc cái ghẻ (Ahmet Yücel và ctv, 2021)

Dùng kính lúp soi bắt được cái ghẻ nằm ở cuối đường hầm trong da

IgE tăng cao

Phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp PCR

2.3.2 Chẩn đoán phân biệt

Tổ đỉa: mụn nước sâu, tập trung thành cụm, không có đường hang, chỉ có ở lòng bàn tay, đầu ngón, mặt dưới ngón, ria ngón bàn tay chân

Sẩn ngứa tuổi già, sẩn ngứa trẻ em

Sẩn ngứa ngoại lai: viêm da dị ứng do cây cỏ, lá ngứa, do nước suối, do hoá chất nhưng không có mụn nước ở lòng bàn tay, kẽ tay, qui đầu , không có tính chất dịch tễ lây lan người này sang người khác

khoảng từ 2 - 7 ngày

2.3.4 Nguyên tắc điều trị

Phát hiện sớm, điều trị sớm khi chưa có biến chứng

Điều trị tất cả những người bị ghẻ sống chung cùng một lúc

Điều trị kết hợp với phòng bệnh chống lây lan Cách ly người bệnh, giặt luộc, là, phơi nắng quần áo, chăn màn, đồ dùng Không dùng chung quần áo, ngủ chung

2.4 Nhận diện con ghẻ Sarcoptes scabiei bằng phương pháp PCR

2.4.1 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 Phương pháp PCR cho phép khuếch đại DNA hay đoạn DNA với số lượng bản sao lớn trong một thời gian ngắn Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất của biến tính, hồi tính của DNA và sự tổng hợp DNA Trên mạch trình tự của DNA khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp được đoạn DNA mục tiêu mong muốn (Khuất Hữu Thanh, 2006)

Hình 2.7 Một chu kỳ phản ứng PCR

Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu mong muốn được lặp lại nhiều lần các chu

kỳ nhân lên của gen, trong một thời gian ngắn số lượng bản sao DNA tạo thành sẽ tăng theo cấp số nhân

Nguyên lý chung của phương pháp PCR: PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm