Tbktcnsh nhóm9

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC MÔN HỌC: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH CÁC GENE MÃ HÓA TINH THỂ ĐỘC CRY CỦA CHỦNG VI KHUẨN Bacillus thuringensis var kurstaki BẰNG PCR Giảng viên hướng dẫn Nhóm sinh viên thực hiện TS HUỲNH VĂN BIẾT ĐẶNG QUỐC ĐẠI - 21126261 TRẦN LÊ HÙNG - 21126355 NGUYỄN TRỌNG KHÔI - 21126377 Thủ Đức, ngày 27 tháng 10 năm 2023 NỘI DUNG CHÍNH 1 Chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2 Gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 3 Vật liệu và nguyên lý 4 Khuếch đại trình tự 16S-rDNA và gen cry của các chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki 5 Kết luận 1 1 Chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis (viết tắt: Bt) là vi khuẩn Gram dương Bt có khả năng tổng hợp protein gây tệ liệt ấu trùng của một số loài côn trùng gây hại Bacillus thuringiensis var kurstaki ( Btk ) là một nhóm vi khuẩn được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học chống lại loài lepidopterans (bướm và bướm đêm) Giới (regnum) Eubacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Bacilli Bộ (ordo) Bacillales Họ (familia) Bacillaceae Chi (genus) Bacillus Loài (species) B thuringiensis Bảng 1 Bảng phân loại khoa học của B thuringiensis Hình 1 Cấu tạo vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2 2 Gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis Các chủng khác nhau thuộc loài B thuringiensis sinh ra hai loại độc tố chính: + Độc tố tinh thể (cry) được mã hóa bởi các gen cry khác nhau + Các chất độc phân giải tế bào (cyt) tác động riêng rẽ và tổ hợp cùng cry làm tăng tác dụng của tinh thể độc Để xác định sự tồn tại gen cry trong các chủng B thuringiensis phân lập, sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu với các gen đó Các tinh thể diệt côn trùng cry được mã hóa bởi rất nhiều gen cry khác nhau Hình 2 Mô hình cấu trúc protein tinh thể độc tố cry 3 Việc định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định chính xác được dòng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kurstaki mang các gen cry • Nhóm gen cry1 mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy • Nhóm gen cry2 mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt côn trùng bộ cánh vảy và hai cánh • Nhóm cry4 mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh • Nhóm cry9 mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy và cánh cứng 4 3 Vật liệu và nguyên lý 3.1 Vật liệu Hình 3 Máy luân nhiệt (PCR) • Các chủng vi khuẩn B thuringiensis phân lập từ mẫu đất • Máy luân nhiệt (PCR) • Máy điện di, máy vortex, máy chụp gel, máy li tâm 3.2 Nguyên lý Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân bản in vitro một đoạn DNA dựa vào cơ chế sao chép DNA trong tự nhiên ở sinh vật 5 4 Khuếch đại trình tự 16S-rDNA và gen cry của các chủng vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki Ly trích DNA PCR Điện di Đọc kết quả 6 Gen Tên mồi Trình tự Sản phẩm 16Sr PCR (bp) Cry1 63F 5’ – CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC – 3’ 1489R 5’ – TAC CTT GTT ACG ACT TCA – 3’ 1,5 kb Cry2 Un1(F) Un1(R) 5’ – CAT GAT TCA TGC GGC AGA TAA AC – 3’ 277 Cry4 Un2(F) 5’ – AAT GGG AAG CAG AAG TGT CAC AA – 3’ 701 Cry9 Un2(R) 5’ – GTT ATT CTT AAT GCA GAT GAA TGG G – 3’ 498 2AaR 5’ – CGG ATA AAA TAA TCT GGG AAA TAG T – 3’ 546 2AbR 725 5’ – GAG ATT AGT CGC CCC TAT GAG – 3’ 2AcR 439 Un4(F) 5’ – TGG CGT TAA CAA TGG GGG GAG AAA T – 3’ Un4(R) 351 5 – GCG TTG CTA AT AGT CCC AAC AAC A – 3’ Un9(F) 5’- GCA TAT GAT GTA GCG AAA CAA GCC – 3’ Un9(R) 5’ – GCG TGA CAT ACC CAT TTC CAG GTC C – 3’ 5’ – CGG TGT TAC TAT TAG CGA GGG GGG – 3’ 5’ – GCT TGA GCC GCT TCA CAG CAA TCC – 3’ Bảng 2 Trình tự primer sử dụng khuếch đại gen cry của vi khuẩn B thuringiensis var kusrtaki 7 Hình 4 Kết quả điện di sản phấm PCR vùng 16S-rDNA M: thang chuẩn 1 Kb; (1) chủng VBt246.1, (2) chủng VBT2119.1, (3) chủng VBt21110.1, (4) chủng VBt22210.2, (5) chủng VBt25211.1, (6) chủng VBt283.2, (7) chủng VBt2847, (8) chủng VBt2735, (9) chủng VBt26310.1, (10) chủng VBt27322.2, (11) chủng VBt27525.1, (12) chủng VBt27526.1, (13) chủng VBt2762.2, (14) chủng VBt27618.2, (15) đối chứng âm, (16) đối chứng dương (vi khuẩn B thuringiensis var kurstaki) 8 5 Kết luận Kết quả giải trình tự được kiểm tra có trùng khớp với vùng gen cry1, cry2, cry4, cry9 và đối chứng dương (chủng B thuringiensis var kurstaki) trên ngân hàng gene Trình tự DNA (sản phẩm Kích thước Mức độ tương Trình tự tham chiếu (số hiệu PCR/primer giải trình tự) (bp) đồng (%) GenBank) Bt var kurstaski (cry2A) 677 96 MH475907.1, CP009999.1 VBt2110.1 (cry1Aa, cry1Ac) MT892766 VBt27525.1 (cry1Aa, cry1Ac) 512 100 VBt27526.1 (cry1Aa, cry1Ac) MT892767 VBt2735 (cry1Aa, cry1Ac) 512 100 MT892768 VBt27611 (cry2A) MT892769 VBt21110.1 (cry2A) 512 100 MW194253 MW194254 512 100 672 100 672 100 Bảng 3 So sánh một số kết quả giải trình tự với dữ liệu gen của GenBank bằng công cụ BLAST- NCBI 9 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Porcar, M., & Juárez-Pérez, V (2003) PCR-based identification ofBacillus thuringiensispesticidal crystal genes FEMS Microbiology Reviews, 26(5), 419–432 doi:10.1111/j.1574- 6976.2003.tb00624.x 2 Cơ chế tác dụng của Bacillus thuringiensis, Viện công nghệ sinh học và ứng dụng vi sinh miền Nam, năm 2018 3 Ben-Dov E.Q., Zaritsky A., Dahan E., Barak Z., Sina R., Manasherob R., 1997 Extended screening by PCR for seven cry group genes from field collected strains of Bacillus thuringiensis Applied of environmental microbiolology, 63, 4883 – 4890 4 Wang, J., Boets, A., Van Rie, J., Ren, G., 2003 Characterization of cry1, cry2, and cry9 genes in Bacillus thuringiensis isolates from China Journal of Invertebrate Pathology 82, 63 – 71 5 Bravo, A., Sarabia, S., Lopez, L., Ontiveros, H., Abarca, C., Ortiz, A., Quintero, R., 1998 Characterization of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection Applied of environmental microbiolology, 64 6 Katara, J L., Kaur, S., Kumari, G K., Singh, N K 2016 Prevalence of cry2- type genes in Bacillus thuringiensis isolates recovered from diverse habitats in India and isolation of a novel cry2Af2 gene toxic to Helicoverpa armigera (cotton boll worm) Canadian Journal of Microbiology, 62(12), 1003 – 1012 10 CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI!