Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng sinh của hợp chất steroid trong củ loài trọng lâu (paris polyphylla) tại việt nam

Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM VALIPHONE SISAVATH PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA HỢP CHẤT STEROID TRONG CỦ LOÀI TRỌNG LÂU PAR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VALIPHONE SISAVATH

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA HỢP CHẤT STEROID

TRONG CỦ LOÀI TRỌNG LÂU (PARIS POLYPHYLLA)

TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2023

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VALIPHONE SISAVATH

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA HỢP CHẤT STEROID

TRONG CỦ LOÀI TRỌNG LÂU (PARIS POLYPHYLLA)

TẠI VIỆT NAM

Ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN KHANG

THÁI NGUYÊN - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Trải qua quá trình nghiên cứu các tài liệu cộng với sự nỗ lực của bản thân trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm, công trình nghiên cứu của tôi đến nay đã hoàn thành Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, các chỉ số, số liệu trong bài báo cáo đều là trung thực và chưa từng được bất kỳ ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2023

Học viên

VALIPHONE SISAVATH

LỜI CẢM ƠN

Với những thành công đã đạt được trong quá trình nghiên cứu, tôi xin được

gửi lời cảm ơn chân thành của mình tới PGS.TS Phạm Văn Khang - người thầy

đã tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cũng như tài trợ toàn bộ kinh phí thực hiện luận văn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm

ơn tới các thầy cô giáo và các học viên Cao học K29 trên phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ đã tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn các em sinh viên làm đề tài nghiên cứu khoa học cũng như khoá luận tốt nghiệp về hợp chất thiên nhiên đã cùng cộng tác với tôi trong trong việc tiến hành các thí nghiệm thuộc đề tài luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu nhà trường, Ban lãnh đạo khoa Hóa học và phòng Đào tạo (bộ phận sau Đại học) - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2023

Học viên

VALIPHONE SISAVATH

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ vi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát về loài Trọng lâu 3

1.1.1 Tên khoa học 3

1.1.2 Phân loại và đặc điểm thực vật chi Paris 3

1.1.3 Phân bố 5

1.1.4 Một số công dụng của loài Trọng lâu 6

1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hoá học của các loài trong chi Paris 6

1.3 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của các loài trong chi Paris 11

1.3.1 Hoạt tính chống ung thư 11

1.3.2 Hoạt tính chống oxi hoá 13

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn 14

1.3.4 Hoạt tính kháng virus 14

1.3.5 Hoạt tính chống Leishmania 15

1.3.6 Hoạt tính tẩy giun sán 15

1.3.7 Điều trị các bệnh phụ khoa 15

1.3.8 Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase 16

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 17

2.1 Hóa chất và thiết bị phân lập 17

2.1.1 Hóa chất 17

2.1.2 Thiết bị 18

2.2 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được 19

2.2.1 Mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu thực vật 19

2.2.2 Chiết xuất và phân lập hợp chất 19

2.2.3 Xác định cấu trúc các chất 20

2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh của hợp chất steroid 20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Phân lập hợp chất 21

3.2 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 21

3.2.1 Hợp chất 1 21

3.2.2 Hợp chất 2 27

3.3 Hoạt tính kháng sinh của các hợp chất phân lập được 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

1 Kết luận 34

2 Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

13C-NMR : 13C-Nuclear Magnetic Resonance

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

1H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H ESI-Ms : Electron Impact Mass Spectroscopy

: Phổ khối lượng HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

: Phổ tương quan hai chiều H-C HSQC : Heteronuclear Spectroscopy - Quantum Coherence

: Nồng độ ức chế tối thiểu TSSAP : Tổng saponin steroid của cả cây

TSSR : Tổng saponin steroid của thân rễ

NF-κB : Nuclear factor kappa-B

: Yếu tố nhân kappa-B

IKKα/β : Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase α/β

: Chất ức chế yếu tố hạt nhân kappa-B kinase α/β

: Tia tử ngoại (Tia cực tím) TLTK : Tài liệu tham khảo

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất được sử dụng trong quá trình nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong quá trình phân lập 18

Bảng 3.1 Một số giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H và 13 C đặc trưng của chất 1 24

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của chất 2 27

Bảng 3.3 Kết quả kháng vi sinh vật của các hợp chất 32

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Hình ảnh loài Trọng lâu 4

Hình 1.2 Hình vẽ mô tả loài Trọng lâu 5

Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất chính của loài Trọng lâu 9

Hình 3.1 Hình phổ 1 H-NMR của chất 1 21

Hình 3.2 Phổ 13C-NMR của chất 1 23

Hình 3.3 Phổ tương quan trực tiếp (C-H) của chất 1 (HSQC) 25

Hình 3.4 Phổ sự tương quan giữa HC của chất 1 (HMBC) 25

Hình 3.5 Phổ HR-MS của chất 1 26

Hình 3.6 Công thức cấu tạo của chất 1 27

Hình 3.7 Phổ 1 H-NMR của chất 2 29

Hình 3.8 Phổ 13 C -NMR của chất 2 30

Hình 3.9 Phổ HSQC của chất 2 30

Hình 3.10 Phổ HR-MS của chất 2 31

Hình 3.11 Công thức cấu tạo của chất 2 (Diosgenin) 32

Hình 3.12 Cơ chế ức chế các loài vi khuẩn [76] 33

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hóa học các hợp chất thiên nhiên nói chung và các hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng là một trong những lĩnh vực nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Từ xa xưa, con người đã khám phá sức mạnh của thiên nhiên và biết sử dụng nhiều loại thực vật nhằm mục đích chữa bệnh, đồng thời tránh được một số tác nhân có hại cho sức khỏe con người và được đặt lên hàng đầu Do vậy, việc nghiên cứu các chất mang hoạt tính sinh học cao có trong các loài cây, cỏ có tác dụng thiết thực trong đời sống hàng ngày là vấn đề quan tâm của toàn xã hội

Như đã biết, động - thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và là nguồn cung cấp các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học vô cùng quý giá Việc khai thác và sử dụng các loài thực vật để làm thuốc và hỗ trợ chữa bệnh đã được thực hiện từ lâu Hiện nay, xu hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học Từ thực tế nhận thấy các hợp chất thiên nhiên thường có hoạt tính mạnh, độ ổn định cao và có độc tính thấp so với các hợp chất nguồn gốc tổng hợp

Loài Trọng lâu (Paris polyphylla) là loài thực vật có giá trị làm thuốc và

chữa nhiều bệnh như viêm gan, viêm dạ dày và đại tràng Các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng cao chiết và các hợp chất tách ra được từ loài thực vật này

có khả năng ức chế mạnh nhiều dòng tế bào ung thư

Ở Việt Nam, loài thực vật này hiện nay rất được quan tâm nhân giống để trồng trong các vườn dược liệu để phục vụ cho nhu cầu chữa bệnh bằng các bài thuốc cổ truyền có chứa thành phần là cây Trọng lâu Tuy nhiên, việc nghiên cứu một cách hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài thực vật này mọc hoang trong tự nhiên chưa được quan tâm đúng mức Do đó chúng tôi

đề xuất đề tài: Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng sinh

của hợp chất steroid trong củ loài Trọng lâu (Paris polyphylla) tại Việt Nam

Đề tài này khi hoàn thành sẽ cung cấp các thông tin khoa học giá trị làm

cơ sở khoa học quan trọng để sử dụng loài thực vật này làm thuốc chữa bệnh và sàng lọc các hợp chất có hoạt tính tốt để tiến hành nghiên cứu tiếp theo Đồng thời góp phần vào việc đào tạo nguồn nhân lực cho vùng núi phía Bắc và cả nước

2 Mục tiêu của đề tài

1- Phân lập được 2 - 3 hợp chất steroid từ củ của loài Trọng lâu (Paris polyphylla)

2- Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại (NMR và MS)

3- Tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của các hợp chất phân lập được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về loài Trọng lâu

1.1.1 Tên khoa học

- Tên khoa học: Paris polyphylla Smith Họ: Melanthiaceae Chi: Paris

- Tên Việt Nam: Cây Trọng lâu, Thất diệp nhất chi hoa, Cây bảy lá một hoa, Tảo hưu, Độc cước liên, Thiết đăng đài, Chi hoa đầu, Thảo hà xa…

1.1.2 Phân loại và đặc điểm thực vật chi Paris

Theo hệ thống phân loại mới nhất APG III dựa trên những dẫn liệu về sinh

học phân tử, chi Paris được xếp vào họ Hắc dược hoa (Melanthiaceae)[73] với

tổng số 26 loài và 13 thứ Chi Paris L là một chi nhỏ, phân bố ở vùng cận nhiệt

đới hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu, trong đó Trung Quốc được coi là trung tâm đa

dạng của các loài thuộc chi Paris

Thực vật chí Trung Quốc đã mô tả hình thái và xếp chi Paris vào họ Loa

kèn (Liliaceae) với 22 loài và 17 thứ (var.) trong đó có 12 loài đặc hữu Đồng

thời các nhà thực vật Trung Quốc cũng phân loại loài Paris polyphylla (P polyphylla) thành 10 thứ, bao gồm: P polyphylla var polyphylla, P polyphylla var yunnanensis, P polyphylla var chinensis, P polyphylla var nana, P polyphylla var alba, P polyphylla var stenophylla, P polyphylla var latifolia,

P polyphylla var pseudo thibetica và P polyphylla var kwangtungensis [48]

Ở Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Paris là những cây thuốc quý hiếm

nhưng có nguy cơ tuyệt chủng cao Nạn phá rừng và tình trạng thu gom bán qua biên giới trong thời gian dài là nguyên nhân gây suy giảm mạnh nguồn cung cấp

loài dược liệu này Hiện nay, loài P polyphylla var yunnanensis Smith đã được

đưa vào Sách đỏ Việt Nam (2007) và Danh mục cây thuốc Việt Nam (2006)

1.1.2.2 Đặc điểm thực vật của chi Paris L

Bảy lá một hoa là một loại cỏ nhỏ, có dạng rất đặc biệt, sống lâu năm, thân

rễ ngắn, dài chừng 5 - 15cm, đường kính khoảng 2.5cm rất nhiều đốt, khó bẻ, vết

bẻ trông như có bột, màu vàng trắng hay xám vàng[1] Từ thân rễ mọc lên mặt đất một thân thẳng đứng cao tới 1m, phía gốc có một số lá thoái hoá thành vẩy, bao lấy thân Giữa thân có một tầng lá mọc gồm 3 đến 10 lá, nhưng thường là 7 lá, cuống lá dài từ 2,5 đến 3cm, phiến lá hình mác rộng, dài 15 - 21cm, rộng 4 - 8cm, đầu phiến lá nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt dưới màu xanh nhạt, đôi khi

có màu tím nhạt Hoa mọc đơn độc ở đỉnh cành, cuống hoa dài 15 - 30cm Lá đài gồm 5 đến 10, thường là 7, màu xanh lá cây, dài 3 - 7cm, rời từng cái một, trông như lá, không rụng Số cánh tràng bằng số lá đài, hình sợi rủ xuống, màu vàng nâu, chiều dài bằng hay ngắn hơn chiều dài của lá đài Nhuỵ màu tím đỏ, bầu thường gồm 3 ngăn Quả mọng màu tím đen Ra hoa vào các tháng 3, 4 và 5 (vùng Sapa), mùa quả vào các tháng 10 và 11

Hình 1.1 Hình ảnh loài Trọng lâu

Năm 2015, qua quá trình nghiên cứu về đặc điểm thực vật, Nguyễn Quỳnh

Nga và cộng sự đã khẳng định các loài thuộc chi Paris đã ghi nhận ở Việt Nam đều thuộc nhóm bầu 1 ô, noãn đính bên thuộc dưới chi Daiswa theo quan điểm

của Li Heng [3, 4, 58, 59]

Hình 1.2 Hình vẽ mô tả loài Trọng lâu

Trọng lâu phát triển mạnh trên bụi rậm, cỏ hoặc dốc đá ẩm ướt, mùn, giàu nitrogen và phosphorus dưới tán rừng [14, 32, 46] Nó phát triển ở những khu vực riêng rẽ với độ tán che hơn 80% [14] Quần thể Trọng lâu hoang dã đang suy giảm

do nạn phá rừng, khai thác quá mức và thu hái trái phép, đã được liệt kê trong Sách đỏ của IUCN về Các loài bị đe dọa [6]

1.1.3 Phân bố

Trên thế giới, Trọng lâu xuất hiện ở các nước châu Á như: Trung Quốc,

Ấn Độ, Lào, Myanmar, Nepal, Thái Lan, Việt Nam… [23]

Tại Việt Nam, loài Trọng lâu mọc hoang tại hầu hết những vùng rừng núi, nhiều nhất tại các tỉnh Lào Cai, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Hà Tây, Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Nghệ An… Ngoài ra còn được khai ở Lào [30]

1.1.4 Một số công dụng của loài Trọng lâu

Bộ phận thường được sử dụng là thân rễ, thu hái quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa thu và mùa đông, rửa sạch phơi khô [1] Tính vị và công dụng:

Vị đắng, hơi cay; có tác dụng chữa sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc, nhất

là khi bị rắn độc cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho lao, ho lâu ngày, hen suyễn [1]…

Liều dùng: Ngày uống 4 - 12g thân rễ dưới dạng thuốc sắc Dùng ngoài với tác dụng sát trùng, tiêu sưng, giã thân rễ đắp lên những nơi sưng đau, vết rắn cắn, mụn lở, nhọt [1]

Ở Trung Quốc, các loài thuộc chi Paris được sử dụng chữa gãy xương, co

giật, cầm máu, điều tiết miễn dịch và sử dụng như là thuốc giảm đau, thuốc chống viêm, thuốc hạ sốt, thuốc ho, thuốc kháng sinh, thuốc động kinh, thuốc thanh lọc

cơ thể [35, 72, 74 - 75]

Ở Ấn Độ, thân rễ loài P polyphylla sử dụng trị giun sán và làm thuốc bổ [29]

Tại Nepal, các loài thuộc chi Paris được thu hái tự nhiên dùng làm thuốc trị

giun sán, bệnh dạ dày, long đờm [7]

1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hoá học của các loài trong chi Paris

Năm 1938, Dutt cùng cộng sự bắt đầu tiến hành nghiên cứu thành phần hóa

học của chi Paris và đã phân lập được 2 hợp chất paridin và paristaphin từ loài

P Quadrolia [21] Năm 1983, Nakano và Chen (1995) công bố các hợp chất saponin, flavonoid glycoside, sterol, 𝛽-phytoecdyson và polysaccharide [34] Tiếp đến, vào năm 2002, Hiashi Matsuda cùng cộng sự đã phân lập được 4 loại spirostanol saponin steroid [18]

Các hợp chất khác nhau đã được phân lập và đặc trưng cho các bộ phận từ

thân rễ, rễ, thân và lá của P Polyphylla bao gồm saponin steroid, sterol, saponin

triterpenoid và polysaccharide [16-18] Từ năm 1960 đến 2010, hơn 90 hợp chất đã được phân lập, bao gồm saponin steroid, phytosterol, flavone và phytoecdysone [70], và khoảng 67 saponin steroid được phân lập từ 11 loài thuộc chi Paris [18, 22]

Cho đến năm 2020, khoảng 320 hợp chất đã được xác định, bao gồm saponin steroid, C-21 steroid, phytosterol, triterpene pentacyclic, flavonoid và các chất hóa học khác [18-22] Hơn 50 saponin paris đã được xác định từ P polyphylla var yunnanensis (Ủy ban Dược điển Trung Quốc, 2015) Tuy nhiên, chỉ có bốn

saponin là Paris saponin I, II, VI và VII được chính thức công nhận là thành phần tiêu chuẩn chất lượng của Dược điển Trung Quốc [40, 41] Saponin là một loại glycoside bao gồm aglycone (không tan trong nước) như steroid hoặc triterpenoid, cũng như một hoặc nhiều chuỗi đường (tan trong nước) như glucose, galactose, pentose hoặc methyl pentose Saponin có thành phần aglycone chủ yếu là diosgenin; pennogenin; 24-hydroxy pennogenin; 27-hydroxy pennogenin;

23, 27-dihydroxy pennogenin; 25S- isonuatigenin, nuatigenin và C-21 saponin steroid Saponin trong thực vật có cấu trúc đa dạng do sự hiện diện của các loại đường khác nhau ở các vị trí và định hướng khác nhau Một số hoạt tính như chống ung thư, chống oxi hóa, long đờm, ức chế kết tập tiểu cầu, diệt côn trùng, trị đái tháo đường, kháng nấm/kháng nấm men, chống ký sinh trùng, kháng khuẩn, hạ lipid máu và chống viêm chỉ là một vài trong số các ứng dụng điều trị của saponin steroid (Sparg và cộng sự, 2004) Cấu trúc của một số hợp chất chính được thể hiện trong hình 1.3

(3) Paris saponin VII

(8) Dioscin

(9) Paris saponin II

(10) Polyphyllin VII

Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất chính của loài Trọng lâu

Wang và cộng sự [58] đã phân lập được hai hợp chất mới và sáu hợp chất

đã biết từ thân rễ của loài Trọng lâu, bao gồm falcarindiol, β-ecdysterone, pennogenin-3-O-α-L-arabinofuranosyl (1→4)-β-D-glucopyranoside, pennogenin-3-O-α-L-arabinofuranosyl (1→4)-[ α-L-rhamnopyranosyl (1→2)]- β- D-glucopyranoside, diosgenin-3-O-β-D-glucopyranoside, diosgenyl-3-Oα- L-

rhamnopyranosyl (1→4)-β-D-glucopyranoside, diosgenin-3-O-α-L-

rhamnopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranoside và diosgenin-3-O -α-L-rham nopyranosyl (1→4)-[ α-L-rhamnopyra nosyl (1→2)]-β-D-glucopyranoside

Devkota và cộng sự [20] phân lập được bốn hợp chất đã biết từ thân rễ của Trọng lâu được thu hái ở Parbat, Nepal, bao gồm: Przewalskinone B, polyphyllin C, polyphyllin D và dioscin Xiao và cộng sự (2009) đã phân lập được năm saponin paris: Paris saponin I (PSI), paris saponin V (PSV), paris saponin VI (PSVI), paris saponin VII (PSVII) và paris saponin H (PSH) Thân rễ chứa pariphyllin

A, pariphyllin B, paristerone, polyphyllin D và trillin (Buckingham, 1994) Năm

2012, Kang và cộng sự đã xác định được ba saponin steroid mới bao gồm:

Parisyunnansides G - J và ba hợp chất đã biết là padelaoside B, pinnatasterone

và 20-hydroxyecdyson từ thân rễ của P polyphylla var yunnanensis Năm 2013,

Li và cộng sự cũng phân lập được chín saponin steroid bao gồm PSI, PSII, PSV, PSVI, PSVII, PSH, dioscin, gracillin và PGRR từ thân rễ của loài Trọng lâu Theo Li và cộng sự [41], Trọng lâu là một cây thuốc quan trọng có chứa nhiều saponin steroid như polyphyllin D, dioscin và balanitin-7

Wu và cộng sự [61] phân lập được mười tám saponin steroid và sterol từ

thân rễ của P polyphylla, pariposide A, pariposide B, pariposide C, pariposide

D, pariposide E, pariposide F, (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol-3 rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyrano, (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol-3 O-β- D-glucopyranosyl-(1→6)-glucopyranoside, (3β,25R)- spirost-5-en-3-ol-3 O-β- D-glucopyranosyl-(1→6)-[α-L-rhamnopyranosyl- (1→2)]-β-D- glucopyranoside, (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)- α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside, (3β, 25R)- spirost-5-en-3-

O-α-L-ol-3 rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside, (3β, 17α, 25R)-spirost-5-en- 3,17-diol 3-O-β-D-glucopyranoside, (3β, 17α,25R)-spirost-5-en-3,17-diol-3-O- α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D glucopyranoside, (3β,17α,25R)-spirost-5-en- 3,17-diol-3-O-α-L-arabino furanosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-

O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-D-glucopy ranoside, (3β, glucopyranoside, β-daucosterol, 24-epi-pinnatasterone và 20-hydroxyecdyson

22E)-stigmasterol-5,22-dien-3-O-β-D-Tiếp theo sau đó, Wu và cộng sự [62] cũng đã phân lập được sáu saponin triterpenoid loại oleanane mới từ thân rễ của loài này; paritrisides A - F cùng với

9 saponin triterpenoid đã biết gồm: Paritriside A, paritriside B, paritriside C,

paritriside D, paritriside E, paritriside F, 3β-hydroxyoleane-12-en-28-oic acid 3- O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside, β-hydroxyoleane-12-en- 28-oic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranoside, 3β-

hydroxyoleane-12-en-28-oic acid 3-O-α-L-arabinopyranoside,

12-en-28-oic 3-O-β-D-xylopyranoside acid, 12-en-28-oic acid 3-O-β-D-glucuronide, 3β-hydroxyoleane-12-en-28-oic acid 3- O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside, 3β- hydroxyoleane-12- en-28-oic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside, 3β,23-

3β-hydroxyoleane-dihydroxyoleane-12-en-28-oic acid 3-O-β-D- arabinopyranoside và 3β,23-dihydroxyoleane-12-en-28-oic acid 3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-α-L-arabinopyranoside

xylopyranosyl-(1→2)-α-L-Với các báo cáo đã công bố về thành phần khác nhau trong thân rễ của loài Trọng lâu cho thấy, saponin steroid được công nhận là hợp chất chính trong dịch chiết ethanol từ thân rễ của loài thực vật này

1.3 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của các loài trong chi Paris 1.3.1 Hoạt tính chống ung thư

Dịch chiết ether dầu hỏa, dichloromethane, methanol, ethanol và nước cũng như saponin steroid thu được từ các bộ phận khác nhau của loài Trọng lâu như thân rễ, rễ, lá, thân và toàn bộ cây đã cho thấy hoạt tính chống ung thư đối với bệnh ung thư phổi, ung thư đại thể xương, ung thư xương, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, ung thư bàng quang, ung thư gan, ung thư ruột kết và ung thư tế bào tiêu hóa Dịch chiết methanol có IC50 thấp nhất là < 10 μg/mL ở cả dòng tế bào chondrosarcoma và tế bào chondrocyte sơ cấp[49] Trong khi đó, dịch chiết ethanol có IC50 nằm trong khoảng từ 10 μg/mL đến 30 μg/mL so với dịch chiết dạng nước trên sáu dòng tế bào khối u tiêu hóa ở người [54] Dịch chiết ethanol

gây ra phản ứng chống khối u in vivo trong sự phát triển xenograft PC3 ở chuột

trụi lông BALB/c, trong đó liều cao nhất cho thấy tác dụng tương tự như 5-FU (đối chứng dương) [9] Saponin có thể gây chết tế bào theo nhiều cách khác nhau bao gồm các tuyến được lập trình (apoptosis và autophagy) và các tuyến không được lập trình [21] Mặt khác, các saponin được phát hiện có khả năng chống lại năm dòng tế bào ung thư gồm bệnh bạch cầu, ung thư phổi, ung thư gan, ung thư

vú và ung thư ruột kết [48] Chúng được sử dụng như các tác nhân để hạn chế sự

tăng sinh tế bào và cảm ứng hoại tử vì tác dụng của chúng đối với các tế bào khối

u được đánh giá với IC50 thấp hơn

Cùng với đó, các hợp chất tinh khiết được chiết xuất từ Trọng lâu được phát hiện có khả năng chống lại nhiều loại tế bào ung thư Polyphyllin D là saponin steroid được nghiên cứu thường xuyên nhất để điều trị ung thư và nó được phát hiện có hoạt tính chống lại ung thư vú, ung thư buồng trứng, bệnh bạch cầu, ung thư gan, u não và phản sinh trong khối u Trong các dòng tế bào

ung thư, nó hoạt động như một chất chống ung thư mạnh in vitro với IC50 thấp hơn, dao động từ 0.2 đến 1.4 μM đối với tế bào ung thư buồng trứng, từ 0.8 đến 0.9 μM đối với tế bào bệnh bạch cầu Paris saponin VI cho thấy hoạt tính chống ung thư đối với dòng ung thư gan với IC50 là 8.18 μM và 6.65 μM Paris saponin VII ức chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung ở người với IC50 là 2.62 ± 0.11 μM, tế bào ung thư gan có IC50 là 0.80 - 2.75 μM và các dòng tế bào ung thư buồng trứng kháng thuốc Paris saponin H ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan với IC50 là 1.25 μM, tế bào ung thư phổi diosgenin với IC50 là 149.75

± 10.43 μM, các tế bào ung thư gan pennogenin với IC50 là 9.7 - 13.50 μM Paris saponin I ức chế sự phát triển của tế bào ung thư buồng trứng có IC50 < 15.00

μM, tế bào ung thư gan có IC50 là 0.84 - 4.66 μM, tế bào ung thư dạ dày có IC50

từ 20.30 đến 30.40 μM và tế bào ung thư phổi có IC50 từ 1.21 đến 2.51 μg/mL Paris saponin II ức chế sự phát triển của tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư gan

và tế bào ung thư buồng trứng; polyphyllin I ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan,tế bào ung thư xương và tế bào ung thư phổi; polyphyllin VII ức chế sự phát triển của tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư vòm họng

và tế bào ung thư não

Dữ liệu cho thấy rằng, giá trị IC50 của saponin có thể so sánh với các loại thuốc hóa trị liệu tổng hợp và cùng một loại saponin có tác dụng chống ung thư đối với nhiều loại ung thư Bởi vì, kháng thuốc và tái phát lâm sàng phổ biến trong điều trị ung thư, việc sử dụng các saponin liên cầu của Trọng lâu có thể là

một nguồn đáng tin cậy Các sản phẩm tự nhiên ức chế sự phát triển của tế bào

ung thư ở người in vitro và in vivo bằng cách kích hoạt quá trình chết rụng và bắt

giữ chu kỳ tế bào, với các tác dụng phụ có hại nhỏ trên các mô và tế bào bình thường của vật chủ [9] Sử dụng quá nhiều saponin có thể dẫn đến buồn nôn, nôn mửa, tiêu chảy, tim đập nhanh và co giật [33] Kết quả là, các sản phẩm tự nhiên chiết xuất từ Trọng lâu như saponin steroid và saponin triterpenoid có ít tác dụng tiêu cực hơn đối với con người so với thuốc tổng hợp và do đó có thể được phát triển như một loại thuốc tự nhiên để điều trị ung thư Lý do là vì, lượng saponin steroid được tạo ra trong cơ thể không thể đáp ứng được yêu cầu, nên phương

pháp tiếp cận in vitro tăng cường các hóa chất này bằng công nghệ nuôi cấy mô

sẽ rất thuận lợi trong tương lai

Các hợp chất này cũng đã chứng minh khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư biểu mô, quá trình tự chết của tế bào và sự chết của tế bào xảy ra trên các loại dòng tế bào ung thư và các hợp chất/thuốc được sử dụng qua nhiều con đường như rối loạn chức năng ty thể, bắt giữ tế bào ở pha G2/M, bắt giữ tế bào

ở pha G1, bắt giữ tế bào ở pha G2/S, con đường stress oxi hóa ROS, con đường protein kinase kích hoạt mitogen (MAPK), ngăn chặn sự hình thành mạch bệnh

lý, ngăn chặn con đường yếu tố hạt nhân-κB (NF-κB), ngăn chặn sự bắt chước mạch máu, ngăn chặn con đường CIP2A/AKT/mTOR, ngăn chặn con đường PI3K/Akt và ngăn chặn hoạt động AKT/mTORC1 do ROS gây ra

1.3.2 Hoạt tính chống oxi hoá

Chất chống oxi hóa là các hợp chất ngăn chặn protein, lipid, DNA và các phân tử khác trong tế bào khỏi các gốc tự do và ứng kích oxi hóa Ứng kích oxi hóa được báo cáo là dẫn đến lão hóa và các bệnh như ung thư, bệnh tim, suy giảm nhận thức và suy giảm hệ thống miễn dịch Mặt khác, chất chống oxi hóa hòa tan trong nước phản ứng với chất oxi hóa trong bào tương và huyết tương, trong khi chất chống oxi hóa hòa tan trong lipid bảo vệ màng tế bào khỏi quá trình peroxy hóa lipid [54] Methanol, ethanol, ether dầu hỏa, dịch chiết nước và

saponin steroid có nguồn gốc từ thân rễ của loài Trọng lâu cho thấy hoạt tính chống oxi hóa Hoạt tính chống oxi hóa của mẫu hoặc dịch chiết được phân loại

là mạnh nếu giá trị IC50 là 50.00 - 100.00 μg/mL, trung bình nếu giá trị IC50 là 100.00 - 150.00 μg/mL và yếu nếu IC50 là 151.00 - 200.00 μg/mL Dịch chiết ethanol của Trọng lâu thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh với giá trị IC50 là 68.00 μg/mL [14], nhưng dịch chiết methanol lại có hoạt tính chống oxi hóa rất yếu (IC50 = 1.09 mg/mL) [38]

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn

Dịch chiết methanol, ethanol và nước từ lá, thân rễ và toàn bộ cây của Trọng lâu cho thấy hoạt tính kháng nấm và hoạt tính kháng khuẩn Đồng thời, các hợp chất tinh khiết được phân lập từ loài Trọng lâu cũng cho thấy các hoạt động kháng nấm trong ống nghiệm Pennogenin cho thấy hoạt tính kháng nấm với giá trị MIC từ 0.60 mg/mL đến 2.50 mg/mL [73] Các saponin steroid cho thấy

tác dụng chống nấm đối với Candida albicans với nồng độ ức chế tối thiểu tương

ứng là 5.15 và 10.30 μg/mL [45] Các saponin steroid của pennogenin cho thấy

MIC 0.60 - 2.50 mg/mL chống lại Saccharomyces cerevisae và MIC 0.60 - 1.20 mg/mL đối với Candida albicans [73] Điều đó cho thấy, saponin steroid của

pennogenin có hiệu quả chống lại nấm Candida albicans cao hơn những chất

khác Các saponin steroid được chọn lọc trong hoạt động chống lại các loại vi

khuẩn khác nhau như Pseudomonas aeruginosa (100%), Staphylococcus aureus (80%), Listeria innocua (65%), Escherichia coli (57%), Salmonella enteric (67%) và Shigella sonnei (47%)

1.3.4 Hoạt tính kháng virus

Dịch chiết methanol từ lá của loài Trọng lâu được phát hiện có hoạt tính chống lại virus Chikungunya với IC50 là 8.74 μg/mL [29] Polyphylla saponin I có nguồn gốc từ Trọng lâu được phát hiện có tác dụng kháng virus đối với virus cúm A [44] Trên tế bào MDCK, polyphylla saponin I ở 40.00 μg/mL ức chế 91.40% virus cúm A, trong khi oseltamivir (đối chứng dương) ở cùng liều lượng

ức chế 91.70% [44]

1.3.5 Hoạt tính chống Leishmania

Bệnh leishmania là một bệnh ký sinh trùng đơn bào nội bào do khoảng 20

loài Leishmania gây ra Nó lây lan qua vết cắn của bướm cát phlebotomine cái

thuộc hơn 90 loài khác nhau Hàng năm, có từ 700.000 đến 1.000.000 trường hợp mắc bệnh leishmania[60] In vitro, hoạt tính chống nôn được tìm thấy ở

saponin steroid được chiết xuất từ thân rễ của Trọng lâu [15] Hoạt động kháng khuẩn mạnh (IC50 = 0.23 μM), nhẹ (IC50 = 0.93 - 36.87 μM) và trung bình (IC50

= 1.59 - 83.72 μg/mL) đã được xác định tương ứng với dịch chiết chloroform, ethyl acetate và butanol của cây

1.3.6 Hoạt tính tẩy giun sán

Đánh giá hoạt tính tẩy giun sán của dịch chiết methanol của thân rễ loài Trọng lâu cho thấy giá trị EC50 là 18.06 mg/L [57] Polyphyllin D (EC50 = 0.70 mg/L) và dioscin (EC50 = 0.44 mg/L) được chiết xuất từ dịch chiết methanol cho thấy hoạt tính tẩy giun sán cao hơn so với dịch chiết methanol thô ban đầu [57]

1.3.7 Điều trị các bệnh phụ khoa

Một trong những căn bệnh phổ biến ở phụ nữ là chảy máu tử cung bất thường (AUB) AUB đề cập đến chảy máu tử cung bất thường do các vấn đề về cấu trúc, khó mang thai [18] và tránh thai [48] Nó cũng có thể được gây ra bởi các khối u lành tính và ác tính cũng như các bệnh liên quan đến thai kỳ và rối loạn

nội tiết In vitro, saponin steroid có nguồn gốc từ thân rễ của Trọng lâu làm giảm

chảy máu tử cung bất thường ở chuột bằng cách gây ra các cơn co thắt cơ tử cung theo pha [22] Tổng saponin steroid (TSSP) tạo ra phản ứng trong cơ tử cung của chuột là 23.19 ± 0.27% phản ứng với potassium và giá trị EC50 của TSSP là 19.82

± 0.42 μg/mL Trong cùng điều kiện, phản ứng potassium cao nhất với oxytocin

và PGF-2a (thuốc gây chuyển dạ) lần lượt là 51.09 ± 0.03% và 42.00 ± 0.05%

Nó cho thấy TSSP có tác động mạnh hơn đến sự co cơ tử cung của chuột so với oxytocin hoặc PGF-2a

1.3.8 Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase

Enzyme tyrosinase chứa nguyên tố Cu được tìm thấy bên trong các melanosome trong mô động vật và thực vật xúc tác quá trình oxi hóa tyrosine để tạo ra melanin (sắc tố đen) và các sắc tố khác Các chất ức chế tyrosinase đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị các bệnh về da liên quan đến tăng sắc tố melanin hoặc các bệnh về da liên quan đến sinh tổng hợp melanin Dịch chiết chloroform, ethyl acetate và butanol từ thân rễ của Trọng lâu cho thấy sự

ức chế từ yếu đến trung bình đối với enzym tyrosinase [15] Ngoài ra, przewalskinone B, được phân lập từ thân rễ của Trọng lâu, có IC50 là 0.25 mM cũng có tác dụng chống lại enzym tyrosinase [15]

Do sự tồn tại của các chất chuyển hóa thứ cấp hữu ích, Trọng lâu được xác định là một loài thực vật tiềm năng để điều trị một số loại bệnh ung thư và các triệu chứng rối loạn khác trong y học hiện đại Thân rễ là bộ phận được sử dụng rộng rãi nhất và nó có nhiều hoạt tính chống lại các dòng tế bào ung thư, mầm

bệnh và ký sinh trùng hơn so với các bộ phận khác Dựa trên các thí nghiệm in vitro và in vivo, một số saponin steroid tinh khiết và dịch chiết thô của Trọng lâu

cho thấy hoạt động mạnh mẽ chống lại các dòng tế bào ung thư biểu mô, vi khuẩn

và ký sinh trùng Vì vậy, đây sẽ là một loài thực vật đầy triển vọng cho những nghiên cứu về thuốc điều trị ung thư trong tương lai

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất và thiết bị phân lập

2.1.1 Hóa chất

Các loại dung môi và hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều tinh khiết

Bảng 2.1 Các hóa chất được sử dụng trong quá trình nghiên cứu

5 Sắc ký cột khô dùng khi phân lập là silica gel cỡ hạt 230

- 400/mesh (Merck)

Trung Quốc

7 Sắc ký lớp mỏng RP-TLC (Merck), sắc ký pha đảo

dùng silicagel cỡ hạt 5 - 10/mesh (Merck)

Đức

8 Thuốc thử là dung dịch C2H5OH/H2SO4/Vanillin

(C8H8O3)

Trung Quốc

2 Máy đo khối phổ Mass Spectrometter Khoa Hóa học - Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

3 Máy Bruker 500MHz để đo Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân

Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

6 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được

tiến hành trên bản mỏng kính và bản

mỏng nhôm silicagel tráng sẵn (dài 0.2

2.2 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được

2.2.1 Mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu thực vật

- Củ của loài Trọng lâu được lấy tại huyện Ba Bể, tỉnh Bắc Kạn - Việt Nam và là mẫu tươi vào năm 2022 Tên loài thực vật và mẫu được PGS.TS Sỹ Danh Thường xác định

- Củ sau khi thu hoạch được cắt nhỏ, sấy khô ở 50oC trong 72 giờ, bảo quản trong túi nilon dùng để nghiên cứu

2.2.2 Chiết xuất và phân lập hợp chất

Từ 1,5 kg củ Trọng lâu tươi, tiến hành sấy khô, thu được 450 gram mẫu khô Mẫu khô được chiết trong ethanol 90% trong 4 giờ Lặp lại quá trình chiết

3 lần Cất thu hồi dung môi, thu được 90 gram cao chiết ethanol Cao chiết này được phân bố trong 500 mL nước và chiết lần lượt với dichloromethane (DCM)

và butanol Thu hồi dung môi, ta thu được 20 gram cao chiết DCM và 25 gram cao chiết butatnol

Lấy 15 gram phần cao chiết butanol để tiến hành phân lập các chất trên sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 20-63 µm) với cột có kích thước 5x60 cm

Ổn định cột bằng dung môi DCM Hệ dung môi rửa giải là DCM/ethanol với tỉ

lệ từ 10/1-1/2 (v/v) Tiến hành sắc ký thu được 5 phân đoạn Tại phân đoạn số 3,

tiến hành lọc chất rắn, thu được 25 mg chất rắn vô định hình màu trắng (chất 1)

Cũng tiến hành phân lập tương tự như trên đối với 15 gram phần cao chiết DCM trên sắc ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 20-63 µm) với cột có kích thước 5x60 cm Ổn định cột bằng dung môi hexane Hệ dung môi rửa giải là hexane/acetone với tỉ lệ từ 10/1-1/2 (v/v) Tiến hành sắc ký thu được 5 phân đoạn Tại phân đoạn 3, tiến hành lọc chất rắn, thu được chất rắn vô định hình

màu trắng có khối lượng 50 mg (chất 2)