Báo cáo seminar genomic phân tử phương pháp định tính định lượng trong covid – 19

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO SEMINAR GENOMIC PHÂN TỬ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH / ĐỊNH LƯỢNG TRONG COVID – 19 Trang 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BÁO CÁO SEMINAR GENOMIC PHÂN TỬ

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH / ĐỊNH

LƯỢNG TRONG COVID – 19

Người hướng dẫn: PhD PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG Người thực hiện: PHẠM NHẬT ANH – 620H0194

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BÁO CÁO SEMINAR GENOMIC PHÂN TỬ

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH / ĐỊNH

LƯỢNG TRONG COVID – 19

Người hướng dẫn: Ph.D PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập ngành Công nghệ sinh học tại trường Tôn Đức Thắng, chúng

em đã được giảng dạy rất nhiều kiến thức, tuy nhiên, những bài thực hiện báo cáo nhóm đã giúp chúng em có cơ hội tìm hiểu và nghiên cứu những cách ứng dụng kiến thức vào thực tiễn Chúng em chân thành cảm ơn thầy Phạm Đình Chương vì đã tạo điều kiện thực hiện bài nghiên cứu cho chúng em cũng như đã hướng dẫn chúng em những kiến thức căn bản

để có thể tìm hiểu về đề tài này Qua bài báo cáo này, chúng em đã có thêm nhiều kiến thức

bổ ích, tìm ra được những định hướng quan trọng cho tương lai và đã có thêm một số kinh nghiệm bổ ích cho việc thực hiện báo cáo

Trong quá trình thực hiện, chúng em đã nỗ lực và hỗ trợ lẫn nhau để có thể hoàn thành bài một cách tốt nhất, tuy nhiên, do lượng kiến thức còn hạn hẹp có thể dẫn đến một

số sai sót không đáng có Chúng em mong nhận được sự góp ý từ thầy để có thể cải thiện hơn trong tương lai

LỜI MỞ ĐẦU

Bộ môn Genomic phân tử là môn học dành cho các đối tượng sinh viên khoa Khoa học ứng dụng trường đại học Tôn Đức Thắng Đây là bộ môn rất quan trọng cung cấp kiến thức cơ bản, giúp sinh viên hiểu và áp dụng được các kiến thức đã học vào các môn học chuyên ngành Ứng dụng trong các nghiên cứu khoa học và sự sống trong chuyên ngành Công nghệ sinh học, cũng như áp dụng vào quá trình làm việc sau này

Bài báo cáo gồm 4 phần chính:

Chương 1: Tổng quan (là những định nghĩa, cấu trúc về SARS – CoV – 2 và khái niệm về phương pháp PCR)

Chương 2: Phương pháp RT – PCR trong định tính và phương pháp RT – qPCR trong định lượng Covid 19

Chương 3: Phương pháp Droplet Digital – PCR

Chương 4: So sánh giữa RT – qPCR và Droplet digital – PCR

Bài báo cáo này còn giúp sinh viên ôn lại được toàn bộ kiến thức trong quá trình học tập vừa qua và bài báo cáo này còn dùng làm tài liệu tham khảo cho những ai quan tâm đến môn Genomic phân tử

Em xin chân thành cám ơn đến thầy vì đã giúp đỡ chúng em trong thời gian qua

LỜI CAM ĐOAN CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của Ph.D Phạm Đình Chương Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này

là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập

từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình Trường đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có)

TP Hồ Chí Mính, ngày 29 tháng 04 năm 2022

Đại diện

Phạm Nhật Anh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI MỞ ĐẦU ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về virus SARS – CoV – 2 1

1.1.1 Hiện trạng dịch bệch Covid – 19 1

1.1.2 Cấu tạo của virus SARS – CoV – 2 1

1.2 Khái niệm về phương pháp PCR 2

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP RT – PCR TRONG ĐỊNH TÍNH VÀ PHƯƠNG PHÁP RT – qPCR TRONG ĐỊNH LƯỢNG COVID – 19 3

2.1 Phương pháp RT – PCR 3

2.1.1 Định nghĩa 3

2.1.2 Nguyên tắc 3

2.1.3 Kĩ thuật trong RT – PCR 4

2.1.4 Các bước thực hiện 4

2.1.5 Cách đọc kết quả 6

2.2 Phương pháp RT – qPCR 7

2.2.1 Định nghĩa 7

2.2.2 Nguyên tắc 7

2.2.3 Các bước thực hiện 7

2.3 Cách đọc kết quả 11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP DROPLET DIGITAL – PCR 12

3.1 Định nghĩa 12

3.2 Nguyên tắc 12

3.3 Cách bước thực hiện 13

3.3.1 Chuẩn bị 13

3.3.2 Tạo vi giọt và khuếch đại 13

3.3.3 Đọc vi giọt 14

3.4 Cách đọc kết quả 15

CHƯƠNG 4 SO SÁNH GIỮA RT – qPCR VÀ DROPLET DIGITAL – PCR 17

4.1 Ưu điểm 17

4.2 Nhược điểm 18

4.3 So sánh 19

TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

reaction

polymerase chain reaction

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của virus Conorna 2

Hình 2.1 Chỉ số Ct 6

Hình 2.2 Cách hoạt động của đầu dò Hydrolysis 9

Hình 2.3 Cơ chế hoạt động của đầu dò Molecular Beacon 10

Hình 2.4 Cơ chế hoạt động của đầu dò lai 10

Hình 3.1 Máy QX200 droplet digital pcr system 12

Hình 3.2 Các vi giọt 13

Hình 3.3 Cách hình thành giọt nhũ tương 14

Hình 3.4 Biểu đồ 1 - D 15

Hình 3.5 Biểu đồ 2 - D 16

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng đánh giá kết quả RT-qPCR dựa trên chu kỳ phát tín hiệu huỳnh quang 11

Bảng 4.1 So sánh ddPCR và RT-qPCR 19

Hồ Bắc, Trung Quốc ngày 03/12/2019 Ngày 11/03/2020, WHO nhận định dịch

COVID-19 là đại dịch toàn cầu [1]

COVID-19 do vi-rút có tên là SARS-CoV 2 gây ra Nó là một phần của họ vi-rút corona, bao gồm các loại vi-rút phổ biến gây ra nhiều loại bệnh từ cảm thông thường hoặc viêm phế quản đến các bệnh nghiêm trọng hơn (nhưng hiếm gặp hơn) như hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng (SARS) và Hội Chứng Hô Hấp Trung Đông (MERS) [2]

Giống như nhiều loại vi-rút đường hô hấp khác, vi-rút corona lây lan nhanh chóng qua các giọt nhỏ mà bạn bắn ra khỏi miệng hoặc mũi khi bạn thở, ho, hắt hơi hoặc nói [2]

1.1.2 Cấu tạo của virus SARS – CoV – 2

Bộ gen của SARS-CoV-2 có độ dài khoảng 25-32 kilobase, đây là virus có bộ gen lớn nhất trong số các virus RNA Bộ gen bao gồm các vùng: vùng 5’UTR, khung đọc mở, vùng 3’UTR và cuối cùng là Đuôi-poly (A) Hai phần ba đầu tiên của bộ gen mã hóa cho các protein phi cấu trúc từ 2 khung mở đọc ORF1a và ORF1b 1/3 cuối của bộ gen mã hóa cho các protein cấu trúc [3]

Có 4 protein cấu trúc được bảo tồn trên các CoV đó là protein (S), protein màng (M), protein vỏ (E) và nucleocapsid (N) protein (Hình 1) Protein S chịu trách nhiệm liên kết với tế bào vật chủ và là thụ thể để virus xâm nhập vào tế bào vật chủ Các protein M, E và

N là một phần của nucleocapsid của các hạt virus [3]

Trong bộ gen của SARS-CoV-2 có một gen thiết yếu là gen RdRp (RNA phụ thuộc RNA polymerase), gen này có độ bảo tồn cao, điều này làm cho gen này rất hữu ích để đo

lường khoảng cách sự tiến hóa và sự liên quan của chúng với virus khác Mặt khác gen này cùng dùng để phát hiện chẩn đoán SARS – CoV – 2 [3]

1.2 Khái niệm về phương pháp PCR

Xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction) hay còn gọi là xét nghiệm sinh học phân tử là một kỹ thuật khuếch đại 1 bản sao hay 1 vài bản sao DNA để tạo ra hàng triệu bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt Kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985 Ngày nay, xét nghiệm PCR là

kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong y học Phương pháp này thường được dùng để chẩn đoán một số bệnh đặc hiệu, liên quan đến các loại virus mà các phương pháp xét nghiệm truyền thống không thể làm được [4]

Xét nghiệm PCR đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học do phản ứng rất nhạy và cho kết quả đặc hiệu Xét nghiệm PCR thường có kết quả độ chính xác rất cao Tuy nhiên kết quả cũng còn tùy thuộc trình độ của kỹ thuật viên, phương tiện máy móc làm việc và việc quản lý chất lượng Cùng một xét nghiệm nhưng có nơi cho kết quả nhạy và chính xác, nơi khác thì không có được độ nhạy bằng [4]

Hiện nay để thực hiện xét nghiệm PCR thường đắt tiền hơn so với các xét nghiệm thông thường khác do hầu hết hóa chất để làm phản ứng đều phải nhập ngoại và phải mua với giá cao [4]

Hình 1.1 Cấu trúc của virus Conorna

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP RT – PCR TRONG ĐỊNH TÍNH VÀ PHƯƠNG PHÁP RT – qPCR TRONG ĐỊNH LƯỢNG COVID – 19

2.1 Phương pháp RT – PCR

2.1.1 Định nghĩa

Phiên mã ngược là quá trình tổng hợp DNA bổ sung (cDNA) xảy ra từ khuôn mẫu RNA trong retrovirus Quá trình phiên mã ngược nói trên chỉ thực hiện được nhờ một loại enzyme đặc trưng gọi là enzyme Reverse transcriptase ( enzyme phiên mã ngược) [5]

Enzyme Reverse Transcriptase chịu trách nhiệm cho quá trình phiên mã ngược của các Retrovirus Enzyme này giúp tổng hợp mạch cDNA từ mạch khuôn RNA nhờ vào các hoạt tính sinh học sau:

 Hoạt tính của RNA – dependent – DNA polymerase: giúp tổng hợp mạch cDNA từ RNA [5]

 Hoạt tính RNAse H: giúp tách 2 mạch RNA và mạch cDNA vừa được tổng hợp.[5]

Enzyme này có thể được tổng hợp từ nhiều virus có cấu trúc bộ gene là RNA Tuy nhiên trong các phản ứng xét nghiệm hay sử dụng loại có nguồn gốc từ virus Avian myeloblastosis (AMV) do chúng hoạt động tốt trong nhiệt độ 44 – 48°C và hoạt tính RNAse

H của loại enzyme này cao và ổn định [5]

2.1.2 Nguyên tắc

Nguyên lý hoạt động của RT - PCR là tạo một lượng lớn các bản sao DNA từ một đoạn ADN chọn lọc chỉ trong một thời gian ngắn Sự sao chép DNA được diễn ra trong môi trường in vitro tương tự như trong quá trình phân bào Bằng kỹ thuật RT-PCR, từ một lượng nhỏ ADN trong mẫu bệnh phẩm sẽ được khuếch đại chính xác thành một lượng lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng [6]

2.1.3 Kĩ thuật trong RT – PCR

RT – one step: Trong kỹ thuật này, các vật liệu và hóa chất của quá trình phiên mã ngược sẽ được cho vào ống tube, đồng thời, những vật liệu và hóa chất của các kỹ thuật khác cũng được chọn lọc và cho vào ống Kỹ thuật này giúp tiết kiệm thời gian và hạn chế được nguy cơ lây nhiễm làm bẩn mẫu vì các quá trình được diễn ra liên tục trong chỉ một ống tube duy nhất Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ chấp nhận loại mồi đặc hiệu, độ nhạy không cao, dễ xảy ra sai sót và không thể lưu trữ mẫu cDNA cho các lần xét nghiệm khác [4]

RT – two step: Kỹ thuật này được chia làm hai bước:

 Bước đầu tiên, thực hiện quá trình phiên mã ngược với các vật liệu và hóa chất cần thiết trong một ống tube Kết quả thu được trình tự cDNA từ mạch khuôn RNA [4]

 Sau đó, kết quả vừa thu được được lấy sang một tube khác, cho các vật liệu

và hóa chất cần thiết để thực hiện các kỹ thuật liên quan khác [4]

Kỹ thuật này cho phép chọn và sử dụng đoạn mồi phù hợp với mẫu RNA, hiệu suất tổng hợp cao hơn và có thể lưu trữ mẫu cDNA nếu dừng lại ở bước đầu tiên Tuy nhiên,

kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian hơn và độ tinh sạch của kết quả cũng khó đảm bảo hơn [4]

2.1.4 Các bước thực hiện

Giai đoạn 1: Tách chiết RNA [8]

 Mẫu bệnh phẩm sau khi thu được từ bệnh nhân là một hỗn hợp các tế bào của người, của virus và các các tạp chất có thể gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm Để đảm bảo quá trình thực hiện kỹ thuật và tính chính xác của kết quả, mẫu bệnh phẩm sau khi được đưa về phòng xét nghiệm sẽ được đem tách chiết RNA [8]

 Có rất nhiều phương pháp và chất hóa học dùng để tách RNA khỏi dung dịch tuy nhiên trên thực tế, phương pháp dựa trên độ pH của acid được sử dụng nhiều nhất [8]

 Sau khi sử dụng chất hóa học để làm màng ngoài virus mở ra, lộ bộ gene RNA, hỗn hợp dung dịch acid sẽ được cho vào ống để tạo môi trường acid Trong điều kiện môi trường acid (4 ≤ pH ≤ 5), gốc Hydroxyl ở vị trí C2 của Ribose trong cấu trúc RNA sẽ giúp RNA trung hòa với môi trường, giúp giữ lại được lượng RNA trong mẫu Đồng thời, các DNA và tạp chất sẽ bị phân giải bởi nồng độ acid trong dung dịch Kết quả ta thu được mẫu RNA tinh khiết có thể sử dụng trong các xét nghiệm [8]

 Một phương pháp khác cũng đang được thử nghiệm và phát triển đó là cho vào ống chứa mẫu các hạt nano iron oxide magnetic Các hạt nano này sau khi vào dung dịch sẽ bám chặt lấy RNA RNA sau đó có thể được lấy khỏi ống chứa nhờ vào nam châm Các hạt nano này có thể được rửa sạch bằng nước, kết quả thu được mẫu RNA tinh khiết có thể sử dụng trong các xét nghiệm [8]

Giai đoạn 2: Chạy chu trình đầu để tạo cDNA từ RNA [8]

Sau quá trình tách chiết, mẫu RNA thu được sẽ được dùng để làm khuôn tổng hợp mạch cDNA Quá trình này xảy ra trong 1 chu trình đầu trong máy PCR với nhiệt độ được thay đổi theo từng giai đoạn Chu trình này gồm 4 bước:

 Biến tính RNA (Denature): Bước này giúp RNA được duỗi thành mạch thẳng Bước này diễn ra trong vòng 10 phút ở nhiệt độ 65°C [8]

 Gắn mồi (Annealing): Đoạn mồi bám vào mạch khuôn RNA ở đầu 3’ để phát tín hiệu bắt đầu phiên mã trong vòng 10 phút ở 25°C [8]

 Tổng hợp cDNA (cDNA Synthesis): Enzyme Reverse Transcriptase nhận được tín hiệu bắt đầu bám vào mạch và tổng hợp các dNTPs tự do trong dung dịch thành một chuỗi cDNA có trình tự bổ sung với mạch RNA gốc có chiều 3’ - 5’ [8]

 Tách mạch cDNA khỏi khuôn (Cleaving RNA - DNA hybrid): Enzyme Revese Transcriptase có kèm hoạt tính của RNAse H sẽ giúp tách cDNA và RNA thành 2 mạch riêng biệt, đồng thời phân hủy mạch RNA trong dung

dịch Quá trình kéo dài và tách mạch diễn ra trong 1 giờ và có nhiệt độ phụ thuộc vào enzyme, thường là ở 42°C [8]

2.1.5 Cách đọc kết quả

Ct value (threshold cycle value) được gọi là giá trị chu kỳ ngưỡng Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại một thời điểm thiết bị RT-PCR (Real-time Polymerase Chain Reaction) bắt đầu ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng PCR vượt qua cường độ huỳnh quang nền, hay nói một cách dễ hiểu là số chu kỳ máy phải chạy để phát hiện được tín hiệu huỳnh quang từ mẫu bệnh phẩm Do đó Ct value tỷ lệ nghịch với nồng độ virus bởi mẫu càng nhiều virus Sars-CoV-2 thì tín hiệu huỳnh quang sẽ xuất hiện sớm ở những chu kỳ đầu tiên (Ct nhỏ), và ngược lại mẫu càng ít virus Sars-CoV-2 thì tín hiệu huỳnh quang sẽ xuất hiện muộn ở những chu kỳ lớn (Ct lớn) [3]

Hình 2.1 Chỉ số Ct

2.2.2 Nguyên tắc

PCR phiên mã ngược định lượng (RT-qPCR) được sử dụng khi nguyên liệu ban đầu

là RNA Trong phương pháp này, RNA lần đầu tiên được phiên mã thành DNA bổ sung (cDNA) nhờ enzym phiên mã ngược từ RNA tổng số hoặc RNA thông tin (mRNA) Sau

đó, cDNA được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng qPCR [6]

2.2.3 Các bước thực hiện

2.2.3.1 Tạo cDNA từ RNA bằng RT – PCR

Mẫu được đem xử lý qua các bước RT – PCR để tạo ra được mẫu chỉ chứa cDNA

để dễ dàng thực hiện các chu trình sau [8]

2.2.3.2 Tạo khuôn DNA hoàn chỉnh, thực hiện RT – qPCR (37 đến 40 chu trình)

Tạo khuôn DNA hoàn chỉnh [8]

 Đoạn mồi ngược (RP) có trình tự bổ sung với mạch đơn cDNA bám vào tạo tín hiệu cho DNA polymerase (thường dùng Taq polymerase) bắt đầu quá trình tổng hợp mạch DNA còn lại Kết quả thu được một DNA hoàn chỉnh với 2 mạch DNA anti-parallel [8]

huỳnh quang để làm tín hiệu bám vào các mạch DNA vừa được khuếch đại Khi chùm tia sáng với bước sóng xác định trước chiếu vào mẫu sẽ phát hiện

và đếm số lượng DNA được tạo thành trong thời gian thực Có 2 cách để thêm huỳnh quang vào mẫu: nhuộm mẫu (Dye-based) hoặc dùng đầu dò mẫu (Probe-based) [8]

2.2.3.3 Các cách thêm huỳnh quanh và đầu dò mẫu

Nhuộm mẫu (Dye – based): Thường được sử dụng trong phương pháp nhuộm mẫu

là SYBR Green I Thuốc nhuộm này có đặc tính chỉ cho phép nó bám vào các đoạn dsDNA chứ không bám vào các đoạn ssDNA Vì thế, thuốc nhuộm chỉ bám vào mạch khi giai đoạn bắt cặp bắt đầu Khi DNA khuếch đại hoàn chỉnh, thuốc nhuộm sẽ phát tín hiệu huỳnh quang để máy đọc và cho ra kết quả số lượng DNA được khuếch đại tại thời điểm đó [7]

Đầu dò mẫu (Probe – based): [8]

 Đầu dò Hydrolysis: Phổ biến nhất là TaqMan probe Đầu dò có trình tự bổ sung với 1 đoạn của khuôn DNA và bám vào mạch khuôn Chúng được gắn Reporter (nhóm phát huỳnh quang) ở đầu 5’ và Quencher (nhóm tắt huỳnh quang) ở đầu 3’ Khi ở trạng thái bình thường, Quencher tác động ức chế sự hoạt động của Reporter Trong quá trình tổng hợp mạch mới, với sự tham gia của Taq polymerase, hoạt tính 5’ exonuclease của enzyme sẽ cắt đầu dò ra khỏi mạch Reporter và Quencher tách nhau ra, Reporter không còn bị ức chế nên phát tín hiệu huỳnh quang cho máy thu nhận [8]