Báo cáo seminar genomic phân tử phương pháp định tính định lượng trong covid – 19

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO SEMINAR GENOMIC PHÂN TỬ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH / ĐỊNH LƯỢNG TRONG COVID – 19 Trang 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHO

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO SEMINAR GENOMIC PHÂN TỬ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH / ĐỊNH LƯỢNG TRONG COVID – 19 Người hướng dẫn: PhD PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG Người thực hiện: PHẠM NHẬT ANH – 620H0194 LÊ CÔNG ĐỨC – 620H0024 LÊ HỮU KHÁNH – 620H0291 LÊ NGỌC TUYỀN – 620H0167 Lớp : 20H60301 Nhóm: 4 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO SEMINAR GENOMIC PHÂN TỬ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH / ĐỊNH LƯỢNG TRONG COVID – 19 Người hướng dẫn: Ph.D PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG Người thực hiện: PHẠM NHẬT ANH – 620H0194 LÊ CÔNG ĐỨC – 620H0024 LÊ HỮU KHÁNH – 620H0291 LÊ NGỌC TUYỀN – 620H0167 Lớp: 20H60301 Nhóm: 4 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập ngành Công nghệ sinh học tại trường Tôn Đức Thắng, chúng em đã được giảng dạy rất nhiều kiến thức, tuy nhiên, những bài thực hiện báo cáo nhóm đã giúp chúng em có cơ hội tìm hiểu và nghiên cứu những cách ứng dụng kiến thức vào thực tiễn Chúng em chân thành cảm ơn thầy Phạm Đình Chương vì đã tạo điều kiện thực hiện bài nghiên cứu cho chúng em cũng như đã hướng dẫn chúng em những kiến thức căn bản để có thể tìm hiểu về đề tài này Qua bài báo cáo này, chúng em đã có thêm nhiều kiến thức bổ ích, tìm ra được những định hướng quan trọng cho tương lai và đã có thêm một số kinh nghiệm bổ ích cho việc thực hiện báo cáo Trong quá trình thực hiện, chúng em đã nỗ lực và hỗ trợ lẫn nhau để có thể hoàn thành bài một cách tốt nhất, tuy nhiên, do lượng kiến thức còn hạn hẹp có thể dẫn đến một số sai sót không đáng có Chúng em mong nhận được sự góp ý từ thầy để có thể cải thiện hơn trong tương lai ii LỜI MỞ ĐẦU Bộ môn Genomic phân tử là môn học dành cho các đối tượng sinh viên khoa Khoa học ứng dụng trường đại học Tôn Đức Thắng Đây là bộ môn rất quan trọng cung cấp kiến thức cơ bản, giúp sinh viên hiểu và áp dụng được các kiến thức đã học vào các môn học chuyên ngành Ứng dụng trong các nghiên cứu khoa học và sự sống trong chuyên ngành Công nghệ sinh học, cũng như áp dụng vào quá trình làm việc sau này Bài báo cáo gồm 4 phần chính: Chương 1: Tổng quan (là những định nghĩa, cấu trúc về SARS – CoV – 2 và khái niệm về phương pháp PCR) Chương 2: Phương pháp RT – PCR trong định tính và phương pháp RT – qPCR trong định lượng Covid 19 Chương 3: Phương pháp Droplet Digital – PCR Chương 4: So sánh giữa RT – qPCR và Droplet digital – PCR Bài báo cáo này còn giúp sinh viên ôn lại được toàn bộ kiến thức trong quá trình học tập vừa qua và bài báo cáo này còn dùng làm tài liệu tham khảo cho những ai quan tâm đến môn Genomic phân tử Em xin chân thành cám ơn đến thầy vì đã giúp đỡ chúng em trong thời gian qua iii LỜI CAM ĐOAN CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của Ph.D Phạm Đình Chương Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình Trường đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có) TP Hồ Chí Mính, ngày 29 tháng 04 năm 2022 Đại diện Phạm Nhật Anh iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI MỞ ĐẦU ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG .viii CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1 1.1 Tổng quan về virus SARS – CoV – 2 1 1.1.1 Hiện trạng dịch bệch Covid – 19 1 1.1.2 Cấu tạo của virus SARS – CoV – 2 1 1.2 Khái niệm về phương pháp PCR 2 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP RT – PCR TRONG ĐỊNH TÍNH VÀ PHƯƠNG PHÁP RT – qPCR TRONG ĐỊNH LƯỢNG COVID – 19 3 2.1 Phương pháp RT – PCR 3 2.1.1 Định nghĩa 3 2.1.2 Nguyên tắc 3 2.1.3 Kĩ thuật trong RT – PCR 4 2.1.4 Các bước thực hiện 4 2.1.5 Cách đọc kết quả 6 2.2 Phương pháp RT – qPCR 7 v 2.2.1 Định nghĩa 7 2.2.2 Nguyên tắc 7 2.2.3 Các bước thực hiện 7 2.3 Cách đọc kết quả 11 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP DROPLET DIGITAL – PCR 12 3.1 Định nghĩa 12 3.2 Nguyên tắc 12 3.3 Cách bước thực hiện 13 3.3.1 Chuẩn bị 13 3.3.2 Tạo vi giọt và khuếch đại 13 3.3.3 Đọc vi giọt 14 3.4 Cách đọc kết quả 15 CHƯƠNG 4 SO SÁNH GIỮA RT – qPCR VÀ DROPLET DIGITAL – PCR 17 4.1 Ưu điểm 17 4.2 Nhược điểm 18 4.3 So sánh 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 cDNA vi Ct ddPCR DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA dNTP complementary DNA dsDNA threshold cycle PCR Droplet digital – PCR RdRp Deoxyribonucleic acid RNA Deoxyribonucleotide triphosphate RT-PCR Double-stranded DNA Polymerase Chain Reaction RT-qPCR RNA-dependent RNA polymerase Ribonucleic acid SARS Reverse transcription polymerase chain ssDNA reaction WHO Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction Hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng Single-stranded DNA Tổ chức Y tế Thế Giới vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc của virus Conorna 2 Hình 2.1 Chỉ số Ct 6 Hình 2.2 Cách hoạt động của đầu dò Hydrolysis 9 Hình 2.3 Cơ chế hoạt động của đầu dò Molecular Beacon 10 Hình 2.4 Cơ chế hoạt động của đầu dò lai 10 Hình 3.1 Máy QX200 droplet digital pcr system 12 Hình 3.2 Các vi giọt 13 Hình 3.3 Cách hình thành giọt nhũ tương 14 Hình 3.4 Biểu đồ 1 - D 15 Hình 3.5 Biểu đồ 2 - D 16 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng đánh giá kết quả RT-qPCR dựa trên chu kỳ phát tín hiệu huỳnh quang 11 Bảng 4.1 So sánh ddPCR và RT-qPCR 19 8 huỳnh quang để làm tín hiệu bám vào các mạch DNA vừa được khuếch đại Khi chùm tia sáng với bước sóng xác định trước chiếu vào mẫu sẽ phát hiện và đếm số lượng DNA được tạo thành trong thời gian thực Có 2 cách để thêm huỳnh quang vào mẫu: nhuộm mẫu (Dye-based) hoặc dùng đầu dò mẫu (Probe-based) [8] 2.2.3.3 Các cách thêm huỳnh quanh và đầu dò mẫu Nhuộm mẫu (Dye – based): Thường được sử dụng trong phương pháp nhuộm mẫu là SYBR Green I Thuốc nhuộm này có đặc tính chỉ cho phép nó bám vào các đoạn dsDNA chứ không bám vào các đoạn ssDNA Vì thế, thuốc nhuộm chỉ bám vào mạch khi giai đoạn bắt cặp bắt đầu Khi DNA khuếch đại hoàn chỉnh, thuốc nhuộm sẽ phát tín hiệu huỳnh quang để máy đọc và cho ra kết quả số lượng DNA được khuếch đại tại thời điểm đó [7] Đầu dò mẫu (Probe – based): [8]  Đầu dò Hydrolysis: Phổ biến nhất là TaqMan probe Đầu dò có trình tự bổ sung với 1 đoạn của khuôn DNA và bám vào mạch khuôn Chúng được gắn Reporter (nhóm phát huỳnh quang) ở đầu 5’ và Quencher (nhóm tắt huỳnh quang) ở đầu 3’ Khi ở trạng thái bình thường, Quencher tác động ức chế sự hoạt động của Reporter Trong quá trình tổng hợp mạch mới, với sự tham gia của Taq polymerase, hoạt tính 5’ exonuclease của enzyme sẽ cắt đầu dò ra khỏi mạch Reporter và Quencher tách nhau ra, Reporter không còn bị ức chế nên phát tín hiệu huỳnh quang cho máy thu nhận [8] 9 Hình 2.2 Cách hoạt động của đầu dò Hydrolysis  Đầu dò Molecular Beacon: Đầu dò có cấu trúc tương tự như đầu dò TaqMan tuy nhiên, hai đầu Reporter và Quencher được gắn với nhau tạo thành một cấu trúc “kẹp tóc” với trình tự bổ sung mạch DNA nằm phía trong Khác với TaqMan, Molecular Beacon phát tín hiệu huỳnh quang khi hai đầu của đầu dò tách ra xa và gắn vào trình tự bổ sung trên mạch DNA mới được tạo thành [8] 10 Hình 2.3 Cơ chế hoạt động của đầu dò Molecular Beacon  Đầu dò lai (Hybridization): Đầu dò này là một bộ gồm hai trình tự bổ sung trên DNA khuôn gọi là Acceptor và Donor Đuôi 3’ của Donnor sẽ nhận tín hiệu kích thích phát huỳnh quang, trong khi đầu 5’ của Acceptor mang một tín hiệu phát huỳnh quang Ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, nếu không có sản phẩm khuếch đại thì Acceptor không thể phát huỳnh quang do không nhận được kích thích từ Donnor Nếu DNA được khuếch đại hiện diện thì đầu dò Acceptor và Donor bắt cặp đồng thời vào sợi khuôn, lúc này khoảng cách giữa Donnor và Acceptor đủ gần để Acceptor có thể nhận được tín hiệu kích thích từ Donor và phát huỳnh quang Dựa vào hiện tượng chuyển đổi năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (Fluorescence Resonance Energy Transfer), đầu dò sẽ phát ra tín hiệu huỳnh quang cho máy nhận biết [8] Hình 2.4 Cơ chế hoạt động của đầu dò lai