Nghiên Cứu Chế Tạo Vật Liệu Trên Cơ Sở Nanocomposite Carbon Ứng Dụng Trong Cảm Biến Glucose.pdf

Trang 1 ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --- Nguyễn Đức Nghĩa NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU TRÊN CƠ SỞ NANOCOMPOSITE CARBON ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN GLUCOSE LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC Trang

Tổng quan

Cảm biến sinh học

1.1.1 Định nghĩa và cấu tạo cảm biến sinh học

Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 đã định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer) Chất được gắn trên bộ phận chuyển đổi được gọi là

“phần tử dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích trong mẫu được gọi là “phần tử đích” Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên/kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa DNA-DNA (cảm biến DNA) hoặc enzym/cơ chất (cảm biến enzym)… Trên cơ sở các phản ứng đặc hiệu này, phần tử nhận biết sinh học giữ vai trò dò tìm đối tượng đích trong mẫu phân tích và phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyển đổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đưa qua bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo (hình 1.1)

Hình 1.1 Nguyên lý cấu tạo của cảm biến sinh học[1]

Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ… Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có nhiều khả năng ứng dụng trong phân tích các đối tượng y sinh vì độ nhạy tốt và có thể vi cấu trúc hóa để chuyển đổi thành các thiết bị cầm tay Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển các tín hiệu của phản ứng sinh hóa giữa phần tử nhận biết sinh học và phần tử đích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu được nhận biết bởi kỹ thuật điện hóa Các kỹ thuật điện hóa có thể được sử dụng để đánh giá một cách định lượng (theo nồng độ) hoặc định tính (âm tính/dương tính) sự có mặt của các thành phần sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…) trong dung dịch Có nhiều phương pháp để đo tín hiệu điện hóa khi có sự tương tác giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích như đo dòng, đo thế, đo độ dẫn và đo phổ tổng trở…[54] Tuy nhiên, bên cạnh đó cảm biến sinh học điện hóa cũng có nhiều nhược điểm như (1) cần thiết bị nghiên cứu đắt tiền (máy đo), các điện cực để nghiên cứu cũng có chi phí cao, gia công phức tạp

So với cảm biến điện hóa thì cảm biến so màu có một số lợi thế như có thể quan sát bằng mắt thường nhờ sự chuyển màu của các chất chỉ thị, dụng cụ tiến hành đơn giản, gia công dễ dàng…Do đó cảm biến sinh học so màu đang được dùng nhiều trong thực tế và khẳng định được sự tin cậy như phép xét nghiệm ELISA trong xét nghiệm bệnh ung thư, cảm cúm, các bệnh do virus, ở bệnh viện [1, 2]

1.1.2 Các thành phần của cảm biến sinh học

Cảm biến sinh học là khái niệm chỉ cảm biến mà có đầu dò là các phần tử sinh học (bioreceptors) như là enzym, kháng thể (antibody), các chuỗi DNA hoặc RNA hoặc các chuỗi peptit hoặc protein dùng để phát hiện các chất cần phân tích Quan hệ giữa đầu dò (probe) và đối tượng cần phát hiện (hay còn gọi là đích- target) có thể tóm lược thành 3 nhóm chính như sau:

(1) Nếu đầu dò là các đoạn DNA hay RNA hoặc axit nucleic peptide sẽ ứng dụng trong chế tạo các bộ cảm biến DNA hay RNA nhằm phát hiện ra các đoạn DNA hoặc RNA dùng trong các nghiên cứu sinh học xét nghiệm huyết thống bệnh tật, trong chuyển đổi gen Nguyên tắc hoạt động là các chuỗi này có quan hệ bổ sung (ghép cặp) rất nhạy và rất chọn lọc nên cảm biến loại này có độ nhạy cao và tính chọn lọc [3-17] Ngày nay, chủ yếu là oligodeoxyribo- nucleotides tổng hợp (ODNs) được sử dụng làm đầu dò trong cảm biến DNA

(2) Với đầu dò là kháng thể (antibody) thì sẽ dùng để phát hiện kháng nguyên

(antigen) tạo ra cảm biến miễn dịch (immunosensor) Một kháng thể (antibody) sẽ liên kết một cách đặc hiệu với một đối tượng kháng nguyên (antigen) [7, 18-22], tạo ra độ chọn lọc bộ kit được phát triển để phân tích các mẫu thực phẩm, nước uống, bệnh phẩm…với tên gọi chung là bộ kit ELISA Ví dụ bộ kit xét nghiệm là các chất độc hại như 2,4-D (chất độc màu da cam); các phụ gia trong sản xuất giấy gói có ảnh hưởng đến sức khỏe như bisphenol A; các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu như atrazine hoặc các loại protein bệnh như virus cúm, bệnh ung thư

(3) Với đầu dò là enzym có cảm biến enzym dùng để phát hiện các phân tử đích

(target) đặc trưng của chúng (hay còn gọi là cơ chất của enzym) Một số cảm biến enzym đã được phát triển và ứng dụng [23-29] Ví dụ với đầu dò là enzym thì sẽ dùng để phát hiện các cơ chất tương ứng với enzym đó, ví dụ enzym glucose oxidase (GOx) dùng để phát hiện glucose; enzym cholesterol oxidase dùng để phát hiện cholesterol….Ngoài ra, do cảm biến enzym rất nhạy, phản ứng nhanh và chọn lọc nên cảm biến enzym còn được dùng trong việc khuếch đại tín hiệu để nâng cao giói hạn phát hiện cho các loại cảm biến khác Trong Luận án này sử dụng đầu dò enzym GOx để nhận biết cơ chất tương ứng là glucose, một trong các chỉ số sinh hóa quan trọng của máu GOx sẽ oxy hóa glucose thành gluconic và giải phóng H2O2 theo phản ứng (PT 1.1)

Có nhiều cách khác nhau để đo nồng độ H2O2 giải phóng ra theo (PT 1.1) và nồng độ H2O2 sẽ phản ánh nồng độ glucose trong mẫu Ngày nay, phân tích glucose bằng GOx tích hợp thêm enzym Horseradish peroxidase (HRP) một loại enzym phân hủy H2O2 tạo gốc OH tự do và giải phóng electron qua đó có thể đo nồng độ H2O2 bằng phương pháp điện hóa hoặc so màu trở thành một cấu trúc cảm biến sinh học kinh điển

1.1.2.2 Bộ phận chuyển đổi (transducer)

Hình 1.2 Phân loại cảm biến trên cơ sở bộ phận chuyển đổi (transducer)[2]

Bộ phận chuyển đổi trong các cảm biến sinh học là bộ phận chuyển đổi tín hiệu của việc bắt cặp nhau giữa đầu dò và đích thành các tín hiệu có thể đo được [30-32] Tùy vào tín hiệu đầu ra (output signal) mà chúng ta có thể gọi tên là cảm biến điện hóa hay cảm biến quang…Như tóm tắt ở hình 1.2, hầu hết các loại cảm biến sinh học có thể phân thành

5 loại bộ phận chuyển đổi tín hiệu khi có phản ứng (bắt cặp giữa đầu dò và đích) thành tín hiệu đo đạc được, gồm tín hiệu điện hóa (electrochemical), điện (electrical), quang (optical), cơ hoặc áp điện (piezoelectric) hoặc nhiệt (thermal) Trong luận án này chúng tôi sử dụng bộ phận chuyển đổi quang học hay còn gọi là cảm biến quang với sự đổi màu của chất chỉ thị nên còn có thể gọi là cảm biến so màu

Từ khi ngành hóa học phát triển đã sử dụng các chất chỉ thị, chất chỉ thị màu để phát hiện môi trường các chất một cách nhanh chóng và đến nay các chất chỉ thị vẫn được sử dụng rộng dãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau Để nâng cao độ tiện dụng cũng như để ứng dụng rộng rãi trong đời sống người ta đã chế tạo ra các bộ kit so màu để xác định nồng độ một số chất thậm chí để xác định tình trạng bệnh tật Chẳng hạn, bộ so màu đơn giản và hay dùng nhất là giấy pH (hình 1.3a), sau đó là các que thử như thử 10 chỉ tiêu trong nước tiểu (gồm pH, tỷ trọng) (hình 1.3b và 1.3c), giấy thử hàn the trong thực phẩm như chả, bún, phở (hình 1.3d); bộ kit xét nghiệm sự có mặt của methanol trong rượu (hình 1.3e) và cao cấp là que thử thai (hình 1.3f)

Hình 1.3 Cảm biến so màu phổ dụng: (a) giấy đo độ pH; (b) Hộp que thử 10 thông số của nước tiểu và (c) các màu sắc ứng với nồng độ trong 10 thông số của que thử nước tiểu; (d) giấy thử hàn the trong thực phẩm; (e) bộ kit xác định hàm lượng methanol trong rượu và (f) que thử thai

Nguyên tắc hoạt động của cảm biến so màu ở dạng giấy chỉ thị khá đơn giản, đó là trên cơ sở giấy có độ tro thấp, người ta sẽ tẩm các hóa chất đóng vai trò là chất chỉ thị lên vào màu sắc và cường độ để xác định sự có mặt của tác nhân cần kiểm tra cao hay thấp Đại đa số cảm biến so màu là cảm biến hóa học, chỉ một số ít là cảm biến sinh học như que thử thai là cảm biến sinh học dựa theo phản ứng kháng nguyên - kháng thể để xét nghiệm hormone HCG (Human Chorionic Gonadotrophin) Hiện nay ngày càng có nhiều cảm biến sinh học dựa trên phương pháp so màu đang được phát triển vì tính tiện lợi và đơn giản của quy trình xét nghiệm Cảm biến so màu không chỉ được phát triển để xét nghiệm các hóa chất hay các phần tử sinh học, loại cảm biến này đang được phát triển cho xét nghiệm quản lý môi trường, kiểm tra chất lượng nước

1.1.4 Một số ứng dụng của cảm biến sinh học

Các cảm biến sinh học tỏ ra có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh, đơn giản và chính xác Chính vì vậy nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, tuy nhiên hiện nay chủ yếu được dùng cho các lĩnh vực sau:

1.1.4.1 Ứng dụng trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và kiểm soát môi trường

Enzym

Enzym (hay còn gọi là men) là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, với một hiệu suất rất cao, mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH Sở dĩ như vậy vì nó có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học được gọi chung là enzym; như vậy, enzym là các protein xúc tác các phản ứng hóa học Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất, enzym sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau Enzym có tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó Hầu hết phản ứng được xúc tác bởi enzym đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được xúc tác Có trên 4 000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym Tuy vậy, hoạt tính của enzym chịu tác động bởi nhiều yếu tố (nhiệt độ, áp suất, pH,

1.2.1 Cấu trúc phân tử và đặc tính xúc tác ưu việt của enzym

Bản chất enzym là những protein đặc hiệu có cấu tạo phân tử rất phức tạp, do vậy nó có tất cả các thuộc tính hóa học của protein Enzym có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu rất cao Để đảm bảo cho chức năng của enzym là chất xúc tác sinh học, cấu trúc của enzym phải rất tinh vi và phức tạp Enzym là những loại phân tử lớn, phần nhiều những enzym đã được nghiên cứu có trọng lượng phân tử từ 10.000 đến 1.000.000 dalton

1.2.2 Đặc điểm xúc tác của enzym

Chất xúc tác là chất làm tăng cường phản ứng hóa học, nhưng không bị biến đổi tiêu hao và tham gia vào thành phần sản phẩm của phản ứng Chỉ cần một lượng nhỏ xúc tác cũng làm tăng vận tốc phản ứng lên nhiều lần Chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học bằng cách tạo nhiều hợp chất trung gian có năng lượng hoạt hóa (Ea) thấp hơn nhiều so với khi không có xúc tác Enzym có đầy đủ các tính chất cơ bản của chất xúc tác, ngoài ra nó còn có đặc điểm riêng là tính chất đặc hiệu rất cao và hiệu lực xúc tác rất lớn Enzym làm giảm năng lượng hoạt hóa nhiều hơn so với các chất xúc tác hóa học Hoạt tính của enzym chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố lý, hóa và sinh học như nhiệt độ, ánh sáng, tia cực tím, sóng siêu âm, pH của môi trường,bản chất hóa học và nồng độ của cơ chất, nồng độ của enzym, thời gian tác dụng của enzym, tác dụng của chất ức chế, tác dụng của chất hoạt hóa, sản phẩm của phản ứng enzym và các chất chuyển hóa khác Đặc tính ưu việt của enzym so với với các chất xúc tác khác thể hiện ở các điểm: (i) Có hiệu quả xúc tác cao, có thể làm tăng vận tốc phản ứng lên 10 5 -10 12 lần so với khi không có chất xúc tác; (ii) Có thể hoạt động ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường (nhiệt độ 20- 40 o C, pH từ 5-8); (iii) Có tính đặc hiệu cao: chỉ tác dụng lên những cơ chất nhất định và xúc tác cho những phản ứng nhất định do vậy ít có sản phẩm phụ tạo ra đồng thời hiệu suất thu được sản phẩm chính cao; (iv) Nhiều enzym không bị mất hoạt tính trong dung môi hữu cơ; (v) Sử dụng enzym đem lại hiệu quả kinh tế lớn (hiệu quả xúc tác của phản ứng có thể tăng lên gấp hàng triệu lần) không gây ảnh hưởng xấu đến môi trường; (vi) Điều chỉnh các yếu tố vật lý, hóa học thích hợp cho hoạt động của enzym sẵn có để chuyển hóa cơ chất sẵn có trong nguyên liệu khi không tách enzym khỏi nguyên liệu Tách enzym khỏi nguyên liệu, sản xuất các chế phẩm enzym có độ sạch khác nhau để sử dụng trên nhiều đối tượng khác nhau và nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu cấu trúc phân tử; phân tích các chất, xác định chính xác hàm lượng các chất; ứng dụng trong các ngành công nghiệp; ứng dụng trong y, dược

1.2.3 Tính đặc hiệu của enzym

Mỗi enzym đều có tác dụng chọn lọc đối với một cơ chất hoặc một loại cơ chất nhất định đối với một loại phản ứng nhất định.Tính chất xúc tác chọn lọc này được gọi là tính đặc hiệu của enzym Đây là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của enzym, do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzym và đặc biệt là trung tâm hoạt động mà enzym có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường khác Tính chất đặc hiệu gắn liền với phản ứng: phần lớn mỗi enzym đều có tính đặc hiệu với mỗi loại phản ứng nhất định Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại phản ứng phải có một enzym đặc hiệu xúc tác Ví dụ: axit amin có khả năng xảy ra phản ứng khử cacboxyl, phản ứng oxy hóa khử amin và phản ứng trao đổi nhóm amin, vì vậy mỗi loại phản ứng trên cần có một enzym đặc hiệu tương ứng xúc tác là decacboxylase, axit amin oxydase, amino transferase

HRP chứa hai loại khác nhau của trung tâm kim loại, sắt (III) protoporphyrin IX (thường được gọi là ‘nhóm heme’) và hai nguyên tử canxi Cả hai đều cần thiết cho sự toàn vẹn về cấu trúc và chức năng của enzym Nhóm heme được gắn vào enzyme tại His170 (gốc histidine gần) bằng liên kết phối trí giữa nguyên tử NE2 chuỗi bên histidine và nguyên tử sắt heme Vị trí phối hợp trục thứ hai (ở phía xa của mặt phẳng heme) không bị chiếm giữ trong trạng thái nghỉ của enzym nhưng có sẵn cho hydrogen peroxide trong quá trình chuyển enzym Các phối tử như cacbon monoxit, xyanua, florua và azit liên kết với nguyên tử sắt heme ở vị trí xa này tạo ra phức peroxidase có số phối trí là 6 Một số liên kết ở dạng proton hóa được ổn định thông qua tương tác liên kết hydro với chuỗi axit amin ở bên của nhân heme phía xa của Arg38 (arginine xa) và His42 (histidine xa) (Hình 1.6)

Hình 1.6 Biểu diễn cấu trúc ba chiều của tinh thể peroxidase isoenzym C của cây cải ngựa (mã truy cập Brookhaven 1H5A) sử dụng nhiễu xạ tia X Nhóm heme (có màu đỏ) nằm giữa miền xa và miền gần, mỗi miền chứa một nguyên tử canxi (được hiển thị dưới dạng hình cầu màu xanh lam) α-Vùng xoắn (α-Helica) và vùng tấm β (β –sheet) của enzym lần lượt có màu tím và vàng Các xoắn (α-Helica) F’ và F’’ xuất hiện ở góc phần tư phía dưới bên phải của phân tử.[35]

Hình 1.7 Các gốc axit amin chính trong vùng liên kết heme của HRP C Nhóm heme và nguyên tử sắt heme được hiển thị bằng màu đỏ, các gốc còn lại có màu nguyên tử His170, dư lượng histidine gần nhất, được kết hợp với nguyên tử sắt heme trong khi vị trí phối trí xa tương ứng phía trên mặt phẳng của hemelà trống rỗng[35]

Hầu hết các phản ứng được xúc tác bởi HRP C và các isoenzym peroxidase của cây cải ngựa khác có thể được biểu thị bằng phương trình sau, trong đó AH2 và AH∙ lần lượt đại diện cho cơ chất khử và sản phẩm gốc của nó Các chất khử điển hình bao gồm phenol thơm, axit phenolic, indol, amin và sulfonat

Việc chuyển đổi hydrogen peroxide thành nước không phải là chức năng chính của peroxidase thực vật cấp III như HRP C Các enzym khác, bao gồm ascorbate peroxidase (class I) được thực vật sử dụng để điều chỉnh mức độ hydrogen peroxide nội bào Sự hình thành các sản phẩm gốc trong các phản ứng có xúc tác HRP cho thấy một số chức năng in vivo có thể có trong cây Những phản ứng này có thể liên quan đến các phản ứng liên kết ngang, chẳng hạn như sự hình thành các liên kết trễ từ các nhóm polysaccharide hoặc pectin được gắn polyme lên men, sự hình thành các liên kết dityrosine, liên kết ngang của các monome phenolic trong việc hình thành suberin và sự liên kết oxy hóa của các hợp chất phenolic như một phần của quá trình sinh tổng hợp lignin Các peroxidase xúc tác các phản ứng liên kết ngang có thể được biểu hiện trong phản ứng với các yếu tố bên ngoài như vết thương của mô thực vật Do đó, sự mất nước và sự xâm nhập của mầm bệnh có thể được hạn chế bằng cách hình thành một hàng rào cao phân tử bảo vệ như suberin Mặc dù vai trò in vivo đối với isoenzyme HRP vẫn chưa được xác định, người ta biết rằng hoạt động của peroxidase được gây ra khi lá cải ngựa bị tổn thương (Kawaoka và cộng sự, 1994).[36]

Cơ chế xúc tác của Enzym HRP đã được nghiên cứu rộng rãi (được xem xét trong Dunford, 1991, 1999; Veitch và Smith, 2001)[37] Một số đặc điểm quan trọng của chu trình xúc tác được minh họa trong Hình 1.8 với axit ferulic làm cơ chất khử Việc tạo ra các loại gốc trong hai bước khử một điện tử có thể dẫn đến một cấu trúc phức tạp của các sản phẩm phản ứng, bao gồm các chất dimer, trime và các oligome mà bản thân chúng có thể hoạt động như chất khử trong các lần chuyển tiếp sau đó

Hình 1.8 Chu trình xúc tác của peroxidase củ cải ngựa (HRP) với ferulate là chất khử Các hằng số tốc độ k 1 , k 2 và k 3 lần lượt thể hiện tốc độ hình thành hợp chất I, tốc độ khử hợp chất I và tốc độ khử hợp chất II tương ứng.[37]

Cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose

Những năm gần đây, cảm biến glucose đang là một trong những lĩnh vực nghiên cứu nhận được sự quan tâm, lựa chọn đặc biệt của các nhà khoa học, các hãng chế tạo thiết bị phân tích sinh hóa vì những triển vọng ứng dụng rất lớn của chúng trong phân tích, kiểm tra các chỉ dấu glucose trong chăm sóc sức khỏe, theo dõi, phát hiện sớm bệnh tiểu đường (với nguy cơ và xu hướng phát triển của bệnh này như đề cập ở trên) với những ưu điểm vượt trội như phân tích nhanh, đơn giản, dễ sử dụng so với việc đến bệnh viện để thực hiện các việc kiểm tra, xét nghiệm Các kết quả trên có được là nhờ ứng dụng các vật liệu tiên tiến (vật liệu lai tạo, vật liệu nano…) và tích hợp các tính chất sinh-hóa-lý của các vật liệu (hoạt tính xúc tác, tính chất quang, tính chất điện…) để tăng cường hoạt tính của các phần tử sinh học, tăng độ nhạy, giảm thời gian xét nghiệm, giới hạn phát hiện thấp, giảm chi phí phân tích Quan trọng hơn nữa, sử dụng các vật liệu tiên tiến nói trên sẽ kéo dài được thời gian sử dụng của cảm biến sinh học vì các phần tử sinh học (như enzym) có thời gian sống không dài, lại yêu cầu hoạt động trong những điều kiện khá nghiêm ngặt (pH, nhiệt độ…) Nhìn chung, cảm biến glucose có hai loại, loại thứ nhất có sử dụng đầu dò là enzym glucose oxidase (GOx) để xác định nồng độ glucose trong mẫu thì được gọi là cảm biến sinh học

Loại thứ hai không cần đầu dò, tiến hành phản úng hóa học để xác định nồng độ glucose thì không được xếp vào cảm biến sinh học Trong luận án này chúng tôi chế tạo loại cảm biến thứ nhất để xác định nồng độ glucose trong các mẫu sinh học (máu, nước tiểu, nước bọt hoặc mồ hôi)

1.3.1 Các phương pháp xét nghiệm nồng độ glucose

Xét nghiệm nồng độ glucose có vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm để điều trị, do đó các nghiên cứu trong lĩnh vực này được phát triển rất đa dạng và phong phú nhằm mục đích chế tạo ra các cảm biến glucose, cholesterol, axit uric có độ nhạy cao, độ đặc hiệu (chọn lọc) tốt, nhanh, phân tích đơn giản, và giá rẻ Để đạt được điều này, các nhà khoa học đã và đang tìm tòi các vật liệu, chế tạo các thiết bị, thiết kế các cảm biến và đã thu được những kết quả nhất định Có thể chia ra các hướng nghiên cứu chính để phát triển cảm biến loại này bao gồm:

1.3.1.1 Phương pháp so màu trên cơ sở sử dụng enzym đặc chủng Đây là phương pháp đang áp dụng phổ biến để xét nghiệm trong các bệnh viện hiện nay Nguyên tắc của phương pháp, lấy xét nghiệm glucose làm ví dụ, là sử dụng enzym glucose oxidase (thường được ký hiệu là GOD hoặc GOx) để oxy hoá glucose trong mẫu thành gluconic acid và giải phóng peroxide hydrogen (H2O2) Sau đó peroxide hydrogen tạo thành bị enzym peroxidase (POD) - thông thường enzym horseradish peroxidase (HRP) được sử dụng phổ biến, để phân huỷ H2O2 và giải phóng oxy Oxy giải phóng oxy hoá chất chỉ thị, phổ biến là hệ 4 – aminophenzon(4-AAP) và phenol hay hệ 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidine (TMB) để tạo ra sản phẩm có màu đặc trưng (cơ chế được minh họa trên hình 1.6a và các phản ứng chính diễn ra được miêu tả trên hình 1.6b, như hệ 4-AAP, phenol tạo ra chất quinonimin có màu đỏ hồng (Hình 1.6c), hay TBM tạo ra dạng TMB dạng oxi hóa có màu xanh lá cây Cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng glucose qua đó sử dụng đường chuẩn sẽ xác định được nồng độ glucose

Hình 1.9 (a) Cơ chế hoạt động của các enzym trong hệ cảm biến 2 enzym phát hiện glucose

1.3.1.2 Xét nghiệm bằng máy đo sử dụng cảm biến sinh học điện hóa sử dụng các enzym đặc chủng

Về nguyên tắc thì phương pháp so màu đã nói ở trên và phương pháp này giống nhau ở chỗ là sử dụng các enzym đặc chủng (ví dụ GOx) để chuyển hóa chỉ dấu sinh học là glucose thành các axit tương ứng và giải phóng ra H2O2 Sự khác biệt ở đây là tín hiệu đầu ra thu được là dòng điện dùng để hiển thị giá trị nồng độ các chỉ dấu sinh học trong mẫu thay vì thay đổi màu sắc như trong phương pháp so màu Ví dụ, thành phần, một bộ thiết bị kiểm tra nồng độ glucose trong máu gồm các bộ phân như trong hình 1.7a, gồm: máy đọc kết quả (1), que lấy máu (2), que thử (3), hộp chứa các que thử chưa sử dụng (4) và hộp đựng máy (5) Một mẫu que test thử điển hình được cấu tạo bởi các điện cực hoạt động chính (working electrode-WE) và các điện cực thu (counter electrode-CE), điện cực so sánh (Reference Electrode-RE), cấu tạo của một que thử theo nguyên lý điện hóa mô tả trên hình 1.7b Nguyên lý hoạt động như sau, dòng điện được sinh ra do quá trình oxy hóa một cách chọn lọc lượng đường glucose trong mẫu máu thử cùng với hai thành phần chất xúc tác phản ứng được “tráng” sẵn bên trong của que test thử, bao gồm enzym GODx phản ứng trực tiếp với các phân tử đường glucose để tách lấy hai điện tử (electron) sẵn có của nó, và thành phần thứ 2 là một phân tử môi chất/hoặc enzym thứ 2 (thường là HRP) sẽ đảm nhiệm việc nhận lấy 2 điện tử được giải phóng từ enzym dưới dạng đơn lẻ hay cặp đôi rồi chuyển các điện tử này đến điện cực làm việc (working electrode-WE) để tạo ra tín hiệu có thể đo được (quá trình này được minh họa trong hình 1.7c) Enzym và môi chất hoạt động như một cơ chế chọn phân loại từ một số lượng lớn các điện tử từ các phân tử đường glucose được chuyển đến điện cực làm việc (WE) Mỗi phân tử enzym và môi chất có thể lặp đi lặp lại quá trình dịch chuyển này nếu cần thiết Có rất nhiều loại môi chất thích hợp khác nhau có thể được sử dụng để sản xuất các que thử đường huyết hoạt động theo cơ chế điện hóa (Electrochemical Blood Glucose Test Strips - EBGTS), tuy nhiên, dù có nhiều sự khác nhau về yếu tố này (bí quyết công nghệ) với các sản phẩm que test thử đã thương mại hóa trên thị trường nhưng tất cả chúng đều hoạt động dựa trên cùng cơ chế giống như đã minh họa ở hình trên Bộ kit thử glucose theo nguyên lý điện hóa này đã được thương mại hóa, tuy nhiên khả năng tiếp cận của người dân, đặc biệt là ở những nước đang phát triển như Việt Nam là khó khăn vì giá thành còn cao, vì vậy nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang tiếp tục phát triển hướng này nhằm giúp giá thành giảm xuống để có thể phổ cập tới những người có thu nhập thấp

Hình 1.10 (a) Một bộ dụng cụ và thiết bị của máy đo đường huyết gồm: (1) Máy phân tích và đọc kết quả; (2) Dụng cụ lấy máu; (3) Que thử; (4) Hộp đựng que thử và (5) Hộp đựng thiết bị (b) Cấu tạo của que thử; (c) Nguyên tắc hoạt động của điện cực làm việc và (d) Nguyên lý truyền và xử lý tín hiệu của thiết bị Xét nghiệm bằng que thử bộ chỉ số trong nước tiểu

Ngoài ra, có thể dùng que thử bằng giấy (hình 1.8) để kiểm tra nồng độ đường trong nước tiểu, tuy nhiên đây là que thử tổng hợp, cùng lúc có thể phát hiện được nhiều thông số cùng lúc (như pH, axit ascorbic…) và dùng bảng màu chuẩn để tra ra nồng độ Cảm biến loại này hoạt động trên nguyên lý phản ứng hóa học làm thay đổi màu chất chỉ thị giữa chất cần kiểm tra với chất chỉ thị nên có độ đặc hiệu thường không cao, chỉ thích hợp dùng để kiểm tra sơ bộ

Hình 1.11 Bộ que thử glucose trong nước tiểu Uriscan và bảng màu chuẩn để so sánh[38]

1.3.2 Các xu hướng phát triển cảm biến glucose

1.3.2.1 Tổng hợp và ứng dụng các vật liệu thay thế enzym glucose oxidase

(GOx) trong chế tạo cảm biến

Một số báo cáo mới đã nghiên cứu thay thế cả 2 enzym trong cảm biến phát hiện glucose theo phương pháp so màu, như nhóm của tác giả Tangsong Li [39] đã sử dụng hệ nano bạc/nano vàng cấu trúc lõi vỏ để phát hiện glucose theo cơ chế nêu trên hình 1.9

Hình 1.12 Nguyên lý phát hiện glucose bằng phương pháp so màu không sử dụng enzym [39]

Theo đó, phản ứng tráng gương giữa ion Ag + với glucose trong mẫu cần phân tích được hỗ trợ bởi các hạt nano vàng (nano Au), khi đó bạc (Ag 0 ) hình thành sẽ bám lên bề mặt hạt nano vàng tạo ra cấu trúc lõi (là nano Au) và vỏ là bạc (Ag 0 ), do đó làm thay đổi phổ hấp thụ của dung dịch từ pic đặc trưng của hạt nano vàng (ở 520 nm) thành phổ hấp thụ của hạt nano bạc (có pic đặc trưng ở 425 nm) và nồng độ glucose trong mẫu tỷ lệ thuận với cường độ pic hấp thụ tại bước sóng 425 nm Với thiết kế này cảm biến có thể phát hiện glucose trong khoảng nồng độ từ 0,04 mM đến 1 mM với giới hạn phát hiện bằng mắt thường là 10 nM Tuy nhiên cảm biến kiểu này có độ đặc hiệu (độ chọn lọc) không cao vì không có đầu dò đặc hiệu (là enzym GOx) do đó ngoài glucose thì các tác nhận khác cũng có thể gây ra sự thay đổi màu như trên, có thể gồm formaldehit, axit ascorbic…Ngoài ra, cảm biến này không dùng đầu dò là phần tử sinh học nên cũng không được coi là cảm biến sinh học (theo định nghĩa của IUPAC)

1.3.2.2 Tổng hợp và sử dụng các vật liệu có hoạt tính xúc tác thay thế enzym peroxidase (POD) Đã có một số nghiên cứu đã thay thế enzym HRP (một loại enzym POD phổ biến nhất) bằng các vật liệu có hoạt tính xúc tác tương tự như enzym HRP, các vật liệu thường Đỏ Vàng g được sử dụng là các oxit kim loại chuyển tiếp như Co3O4 [40]; Fe3O4 [41-44], Prussian blue ( Fe7(CN)18 ) [45] hay các vật liệu trên cơ sở carbon như C60 [46] Các vật liệu tổ hợp trên cơ sở các oxit trên với các vật liệu như ống nano carbon (CNTs), graphen/graphen oxit như

Fe3O4/graphen [41, 42, 47], Fe2O3/graphen [47] để tăng cường hoạt tính thông qua khả năng chuyển điện tích nhanh giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn, nhạy hơn Thêm vào đó, việc thay thế enzym HRP làm cho cảm biến có thời gian bảo quản đơn giản hơn và dài hơn (vì enzym HRP sẽ bị mất hoạt tính khi gặp ánh sáng nên để sử dụng chúng cần thao tác trong điều kiện thiếu sáng) Ngoài ra các kim loại quý và các vật liệu tổ hợp trên cơ sở các hạt nano kim loại này có hoạt tính xúc tác tương tự như enzym HRP cũng đã được nghiên cứu thay thế HRP trong phát hiện glucose như nano bạc (nanoAg) [48], nano platin (nano Pt) hay nano paladi (nano Pd) hay nano PtPd [49]

Hình 1.13 Nguyên lý phát hiện glucose sử dụng enzym GOx kết hợp với sử dụng C60-carboxy- fullerenes thay thế enzym HRP [50]

Chẳng hạn, nhóm của Ruimin Li [50] sử dụng quả cầu C60 fullerenes chức năng hóa bằng các nhóm -COOH để thay thế HPR khi phân hủy H2O2, cơ chế của quá trình mô tả trên hình 1.10 Trong nghiên cứu này, Li đã dùng TMB làm chất chỉ thị, màu xanh của TMB tỷ lệ thuận với nồng độ glucose trong mẫu và phương pháp này có khoảng phát hiện glucose là từ 1 -40 àM và giới hạn phỏt hiện là 0,5 àM Để nâng cao độ nhạy của cảm biến phát hiện glucose theo phương pháp điện hóa, nhiều vật liệu mới đã được ứng dụng và nghiên cứu gồm sử dụng các vật liệu nao có hoạt tính xúc tác cho quá trình phân giải H2O2 (là sản phẩm của quá trình chính do GOD chuyển hóa glucose), vì vậy về nguyên tắc thì các vật liệu này có thể gồm các oxit kim loại chuyển tiếp như Fe3O4 [51]; CuO [52], NiO [53, 54] hoặc các hạt nano kim loại quý (như nano Ag [55], nano Pt [56, 57], nano Pd [58]) và các vật liệu tổ hợp của chúng với CNTs, graphene…để tăng cường hiệu năng phản ứng, tăng độ nhạy, giảm thời gian

Jia và các cộng sự [58] trình bày quy trình tổng hợp vật liệu mới dạng sợi trên cơ sở các hạt paladi (Pd) đính trên các sợi carbon xoắn nano (helical carbon nanofiber) (hình 1.11) Tiếp theo, vật liệu này phủ lên điện cực, sau đó cho thêm GOx rồi dùng nafion làm chất kết dính phủ lên bề mặt để định vị chúng trên điện cực để ứng dụng phát hiện glucose Cảm biến này hoạt động trong khoảng nồng độ glucose từ 0.06 đến 6.0 mM với giới hạn phát hiện lên tới 0.03 mM

Hình 1.14 Cấu tạo điện cực làm việc để phát hiện glucose trên cơ sở sử dụng kết hợp enzym GOx với vật liệu lai tạo Pt/sợi helical carbon và cơ chế phản ứng khi điện cực làm việc[58]

Claussen và các cộng sự [59] đã phát minh ra một bộ cảm biến sinh học mới có thể thay thế một phần hoặc hoàn toàn cho pinprick (kim chích máu) để kiểm tra tiểu đường Bộ cảm biến này có thể phát hiện nồng độ glucose trong nước bọt, nước mắt và nước tiểu (trong khi đó test xét nghiệm tiểu đường thông thường thường chỉ đo được nồng độ glucose trong máu) Bộ cảm biến bao gồm một vài tấm nano giống như cánh hoa hồng được làm từ graphen, các cạnh của tấm nano liên kết hóa học không đầy đủ do đó enzym glucose oxidase có thể gắn vào Enzym sau đó chuyển đổi glucose thành peroxide tạo ra một tín hiệu trên các điện cực của cảm biến Công nghệ này có thể phát hiện glucose ở nồng độ thấp từ 0,3μM (hình 1.12)

Hình 1.15 Cấu trúc cảm biến phát hiện nồng độ glucose trong nước bọt, nước mắt và nước tiểu trên cơ sở các tấm graphen/hạt nano Pd [59]

Hình 1.16 Sơ đồ của cảm biến phát hiện H 2 O 2 và glucose theo phương pháp điện hóa sử dụng hệ vi lưu làm từ giấy (paper-based microfluidic devices) [60]

Các vật liệu nano tiên tiến trên nền carbon được nghiên cứu trong luận án

1.4.1 Vật liệu nano bạc (silver nanoparticles-AgNPs)

Hạt nano bạc (AgNPs) là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm Do có diện tích bề mặt lớn nên AgNPs có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag + hơn

Hình 1.17 (a) Khẩu trang chứa nano bạc; (b) các dược phẩm sử dụng nano bạc; (c) bình sữa làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc; (d) ảnh SEM của các hạt nano bạc kết hợp với film polyolefin; (e) bàn chải đánh răng có chứa nano bạc

Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên AgNPs thường được sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa AgNPs như: (i) Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm AgNPs có tác dụng khử trùng Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt 99.9% vi khuẩn; (ii) Đồ may mặc: AgNPs được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử mùi; (iii) Các thiết bị điện tử: Điều hòa, tủ lạnh, máy giặt; (iv) Ứng dụng trong y tế như khẩu trang AgNPs: Được thiết kế với 3 - 4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu tẩm AgNPs và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt khuẩn, diệt virus, lọc không khí rất tốt Lớp vải tẩm nano bạc có chức năng diệt vi khuẩn, virus, nấm bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng khử mùi; (v) Sản xuất thuốc chữa bệnh; (vi) Ứng dụng trong màng hô hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước qua nhưng không thể cho chất lỏng đi qua, có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại trong tấm film Các AgNPs gần đây đã được kết hợp với film polyolefin với đặc tính kháng khuẩn rất tốt và (vii) các sản phẩm tiêu dùng khác như các dung dịch

(d) (e) xịt khử mùi cho tủ lạnh, cho giầy dép; nước sục miệng; bàn chải đánh răng…Các ứng dụng được tóm lược trên hình 1.17

Dung dịch chứa AgNPs có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa AgNPs với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các thuộc tính trên Thông thường, các hạt nano bạc có kích thước nhỏ hơn 50 nm chỉ có một bề mặt plasmon duy nhất nên trong phổ UV-Vis của chúng chỉ có một đỉnh hấp thụ đặc trưng, đỉnh phổ này sẽ bị thay đổi (dịch chuyển, giảm cường độ hấp thụ) khi có các tác nhân tấn công sự tồn tại hoặc làm biến dạng hình học các hạt AgNPs, bằng mắt thường có thể quan sát được sự biến đổi tông màu hoặc độ đậm nhạt (cường độ màu) của dung dịch AgNPs Vì vậy thời gian gần đây có nhiều nghiên cứu ứng dụng các tính chất này để chế tạo cảm biến hóa học, sinh học Tuy nhiên để đáp ứng cho các ứng dụng này thì AgNPs yêu cầu có độ sạch cao, trong mẫu không có dư lượng sản phẩm phụ hoặc các sản phẩm phụ không ảnh hưởng/ tương tác với các chất trong hệ ứng dụng của AgNPs Do đó các phương pháp truyền thống tổng hợp AgNPs tỏ ra bị hạn chế khi sản xuất AgNPs cho các ứng dụng này Để khắc phục hạn chế đó, trong luận án này, chúng tôi trình bày phương pháp “xanh” để tổng hợp các AgNPs, trong đó điểm mới là sử dụng các hạt nano cacbon (hay chấm lượng tử graphen -CQDs) làm chất khử và đồng thời làm chất ổn định Tiếp đó chúng tôi dùng AgNPs tổng hợp được để làm đầu dò đa chức năng để chế tạo cảm biến H2O2, tiếp đó kết hợp cảm biến H2O2 và enzym GOx để chế tạo cảm biến glucose theo phương pháp so màu Đây đều là các nội dung nghiên cứu mới và có ý nghĩa thực tiễn

1.4.2 Hạt nano Fe 3 O 4 bọc carbon (cấu trúc lõi/vỏ) (core-shell)

Các hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4) đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực quan trọng do đặc tính vật lý tuyệt vời ở kích thước nano của chúng, như tính siêu thuận từ Các hạt nano Fe3O4 từ là vật liệu nano bền, dễ dàng tập hợp lại khi có sự hiện diện của từ trường bên ngoài, nhưng cũng phân tán lại dễ dàng khi ngắt từ trường ngoài đó Với thuộc tính siêu thuận từ này, các hạt nano oxit sắt được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong y sinh, bao gồm: tách sinh học và tinh chế, cảm biến sinh học, truyền, chụp

Vào năm 2007, người ta đã phát hiện ra rằng các hạt nano Fe3O4 có các hoạt tính giống như enzym peroxidase (POD) tự nhiên Đây là lần đầu tiên các hạt nano vô cơ được coi là một enzym nhân tạo thay thế trong các ứng dụng y sinh Sự kiện này khởi xướng cho việc phát hiện ra một loạt vật liệu nano với các hoạt tính giống như enzym, bao gồm kim loại, oxit kim loại và hợp chất carbon-kim loại vật liệu nano có đặc tính xúc tác tương tự như peroxidase Đặc điểm của hạt nano sắt từ sau khi chế tạo là diện tích bề mặt lớn, sức căng bề mặt cao, không ổn định, dễ bị kết tụ, độc tính cao Bề mặt của các hạt từ này được cải biến thông qua việc bọc vài lớp nguyên tử của các polime hữu cơ, kim loại, các oxit vô cơ như SiO2, Al2O3… Các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, dextran, chitosan…Các polyme tổng hợp như polyvinylpyrrolidone (PVP), polyetylenglycol (PEG), polyvinylalcohol (PVA), polystyren (PS)… Polyme vô cơ như oxide của silica và titania Chất hoạt động bề mặt như oleic, alkyl photphonates và photphates sulfonates

Các hạt nano được bọc một lớp chất hoạt động bề mặt có thể phân tán trong dung môi đồng nhất gọi là chất lỏng từ Ngoài các chức năng bảo vệ phần lõi, lớp vỏ còn làm giảm độc tố của hạt từ và dễ dàng chức năng hóa bằng việc gắn các phân tử có đặc tính sinh học khác nhau Mặt khác để phối hợp các hạt nano từ với các thành phần khác tạo cấu trúc lõi/vỏ (nano core/shell) đa chức năng thì phương thức chủ yếu được sử dụng là bọc hạt nano từ bằng lớp silica, sau đó tạo 1 lớp các thành phần chức năng khác như vàng, tâm màu hoặc chấm lượng tử trên lớp silica đó để tạo thành hạt đa lớp, đa chức năng

Hạt nano đa lớp gồm các hạt nano có cấu trúc 2 lớp, 3 lớp…Ví dụ những hạt có lõi điện môi, vỏ là kim loại quý, những hạt có lõi vật liệu từ (sắt từ); những hạt nano lớp trong cùng là vật liệu từ, lớp tiếp theo là lõi điện môi và vỏ ngoài là lớp kim loại mỏng Hạt nano core-shell đã nhận được sự chú ý đáng kể trong những năm gần đây vì tiềm năng ứng dụng của chúng Những vật liệu này cho một loạt những ứng dụng trong chẩn đoán huỳnh quang, xúc tác, nâng cao độ tương phản hình ảnh, tạo tinh thể quang tử, trị liệu và phân phối thuốc, điều trị quang nhiệt Các hạt nano core/shell kim loại đầu tiên được phát hiện bởi Shou bao gồm một lõi điện môi Au2S được bao quanh bởi 1 lớp vỏ vàng, tùy thuộc vào kích thước của các hạt nano, các đỉnh cộng hương palamon có thể thay đổi trong dải rộng từ vùng nhìn thấy tới các bước sóng tới 900 nm Hạt nano core-shell có cấu trúc đa dạng nhưng thông thường có 2 thành phần chính là lõi và vỏ Hình dạng và tính chất của các hạt lõi/vỏ theo lý thuyết cho thấy có thể điều chỉnh bằng cách khống chế các thành phần và thông số chế tạo Dưới đây là một số dạng nano core-shell thường gặp thể hiện trên hình 1.18

Hình 1.18 Các dạng nanoshell: (a) Hạt nano chứa nhiều nhân giống nhau, (b) Hạt nano chứa nhiều nhân khác nhau, (c) Hạt nano chứa một lõi đồng nhất, (d) Hạt nano được bao quanh bởi nhiều lớp vỏ

Trong các dạng này, vật liệu chọn làm lõi/vỏ, tỉ lệ và kiểu liên kết lõi/vỏ là các yếu tố cơ bản để tạo ra các cấu trúc khác nhau của hạt nano core-shell Việc lựa chọn các thành phần để làm lõi và vỏ được tiến hành phụ thuộc vào các tính chất mong muốn của sản phẩm cuối cùng, hướng áp dụng và quy trình chế tạo Có rất nhiều vật liệu vô cơ hay hữu cơ được chọn làm lõi như chất keo, carbon hoạt hóa các hợp chất hữu cơ, các chất xúc tác, dược phẩm và thuốc, các chất tương phản sử dụng trong việc chẩn đoán, các enzym hoạt hóa…

Tỷ lệ lõi/vỏ là một yếu tố quan trọng quyết định tính chất của hạt nano core-shell Việc điều chỉnh 2 thông số độ dày của vỏ và tỷ lệ lõi/vỏ là rất quan trọng trong chế tạo hạt nano Chẳng hạn độ dày của vỏ tác động đến tính chất đặc trưng của phần lõi, sự giải phóng của chất hoạt tính làm thay đổi thời gian tồn tại của sản phẩm cuối cùng Kiểu liên kết lõi/vỏ có thể có nhiều dạng, theo kiểu liên kết hóa học hoặc liên kết tĩnh điện

Một trong những dạng nano core-shell đang có xu hướng phát triển mạnh là loại cấu trúc lõi là các hạt kim loại như sắt từ, Au, Ag… và vỏ là các chất khác với các chức năng khác nhau như từ/vàng, từ/vàng/chất huỳnh quang, vàng/chấm lượng tử, từ/chấm lượng tử… Các cấu trúc trên có vai trò thực hiện đa chức năng khác như làm giàu/hiện ảnh…

Vật liệu Fe@C là vật liệu đa chức năng có cấu trúc lõi-vỏ, vật liệu lõi là nano Fe3O4, vỏ là Cacbon Trong đó, vật liệu vỏ là cacbon, tác nhân hấp phụ với diện tích bề mặt riêng thứ hai là tạo khả năng thu hồi vật liệu sau khi hấp phụ bằng cách dùng nam châm Đây là vật liệu hấp phụ và làm giàu tế bào thế hệ mới Vật liệu này có khả năng được thu lại sau khi hấp phụ, đồng thời có khả năng tái sinh để tái sử dụng chất hấp phụ Đây là loại vật liệu có tiềm năng ứng dụng tốt, quy trình chế tạo tương đối đơn giản, có thể mở rộng quy mô, chi phí chế tạo thấp, có khả năng hoạt hóa bề mặt cacbon để ứng dụng cho các mục đích khác như hấp phụ kim loại nặng, hấp phụ kim loại quý, hấp phụ các hydrocacbon nên vật liệu này có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế và được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm nghiên cứu

Việc sử dụng hạt nano Fe3O4 làm lõi sẽ tạo từ tính cho vật liệu nhằm mục đích thu hồi và ngoài ra cung cấp ion Fe 3+ làm xúc tác cho phản ứng oxi hoá khử Tỉ lệ lõi/vỏ là một yếu tố quan trọng để chế tạo nên các tiểu cầu Việc điều chỉnh cả hai thông số độ dày của vỏ và tỉ lệ lõi/vỏ là rất quan trọng đối với viêc chế tạo tiểu cầu Trong luận án sử dụng lớp vỏ cacbon vô định hình để bọc hạt sắt từ tạo ra vật liệu Fe3O4/C nanocomposite (vật liệu Fe@C) có cấu trúc lõi vỏ với lõi là Fe3O4 còn lớp vỏ là cacbon Sau đó sẽ ứng dụng vật liệu này thay thế enzym HRP trong cảm biến sinh học enzym để phân tích glucose Mục đích của việc chế tạo vật liệu này là để bảo vệ độ bền cho vật liệu bởi lẽ trong thực tế, Fe 2+ rất dễ bị oxi hóa thành Fe 3+ qua đó thay đổi hoạt tính xúc tác (quá mạnh sẽ mất tính chọn lọc vì Fe 3+ có hoạt tính xúc tác rất mạnh) Vì vậy việc tạo ra vật liệu có cấu trúc lõi/vỏ là rất quan trọng để loại bỏ đến mức thấp nhất các yếu tố tác động của môi trường đến lõi vật liệu, nâng cao tính chất từ tính của vật liệu Tùy theo từng tỉ lệ mà ta có thể điều chế ra lớp vỏ cacbon dày hay mỏng khác nhau

1.4.3 Vật liệu FeOOH/ chấm carbon lượng tử pha tạp nitơ

Một hợp chất có mặt nguyên tố sắt (Fe), còn được biết đến với tên gọi là “gỉ sắt” oxy-hydroxit sắt (FeOOH) được nghiên cứu nhiều trong việc hấp phụ xử lý nước và có hoạt tính xúc tác cao Hơn nữa việc chế tạo các oxy-hydroxit sắt cũng không quá phức tạp, đem lại hiệu quả cao Các oxy-hydroxit sắt có những tính chất nổi trội như diện tích bề mặt lớn, cấu trúc xốp, bền hóa, bền nhiệt và khả năng xúc tác cao đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu chế tạo vật liệu ứng dụng làm xúc tác và hấp phụ [61,

Thực nghiệm

Nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất

- Chitosan được chiết tách, xử lý, deaxetyl hoá và đã được xác định các thông số như độ deacetyl; khối lượng phân tử bởi các nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu;

- Các hóa chất dùng trong nghiên cứu này gồm:

- Axit citric monohydrate (C6H8O7.H2O) (A.R, Trung Quốc);

- Thioure (SC(NH2)2) (A.R, Trung Quốc);

- AgNO3 tinh thể (Sigma Aldrich -Đức);

- Muối sắt clorua (Fe@Cl3.6H2O), (A.R, Trung Quốc);

- Muối Morh ((NH4)2Fe(SO4)2.6H2O) (A.R, Trung Quốc);

- Viên đệm PBS (Sigma Aldrich - Đức);

- Axit ascorbic (C6H8O6) (A.R, Sigma Aldrich -Đức);

- Axit acetic (CH3COOH) (A.R, Trung Quốc);

- Muối natri axetat (CH3COONa) (A.R, Trung Quốc);

- Hydrogen peroxide (H2O2) dung dịch 30% (A.R, Trung Quốc);

- Glucose oxidase (GOx, 149800 U/g) (Sigma Aldrich-Đức);

- 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) (C16H20N2) (Sigma Aldrich -Đức);

- Nước cất 1 lần được dùng để chế tạo vật liệu và pha chế các dung dịch

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị

- Máy ly tâm tốc độ cao Tommy (Nhật), (tốc độ tối đa 15.000 vòng/phút);

- Bể điều nhiệt Laudra (Pháp);

- Tủ sấy có đặt lịch trình Memmert;

- Cân phân tích, cân kỹ thuật;

- Bình thủy nhiệt (autoclave) : teflon, dung tích 250 ml

- Các dụng cụ thủy tinh khác như cốc, ống đong, bình tam giác,…

Tổng hợp vật liệu AgNPs/CQDs và ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học

2.2.1 Tổng hợp vật liệu AgNPs/CQDs

2.2.1.1 Tổng hợp carbon dots bằng phương pháp từ dưới lên (bottom-up)

Luận án tham khảo quy trình tổng hợp [69] để tổng hợp CQDs: 3,44 g acid citric và 3,005 g urea hòa tan trong 100 mL nước Cho hỗn hợp trên vào autoclave và tiến hành gia nhiệt ở 160 o C trong vòng 4h Làm nguội tự nhiên về nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong vòng 30 phút để thu được chất rắn là bột nano carbon (CQDs) Sấy khô ở 80 o C trong 10h để thu được CQDs ở dạng bột màu nâu đen, đem phân tán trong nước cất thu được dung dịch CQDs Sơ đồ thể hiện trên hình 2.1

Hình 2.1 Cơ chế hình thành hạt CQDs dots theo phương pháp từ dưới lên (bottom-up) 2.2.1.2 Chế tạo vật liệu nano Ag/Carbon dots (AgNPs/CQDs)

Quy trỡnh chế tạo vật liệu này đó được cụng bố [70], theo đú: lấy 100 àL dung dịch CQDs đem pha vào 3 mL nước cất, sau đó dùng NaOH 0,1 M và CH3COOH 1M để điều chỉnh pH dung dịch về từ 3 đến 11 Sau đó cho 20 μL dung dịch AgNO3 0,1 M vào dung dịch trên Hỗn hợp sau đó được gia nhiệt đến 90 o C trong 3 giờ để khử Ag + thành nano bạc (AgNPs); để nguội hỗn hợp đến nhiệt độ phòng thu được dung dịch chứa vật liệu nano bạc được bền hóa bởi chấm lượng tử graphen (AgNPs/CQDs); bảo quản ở 4 o C để sử dụng

Dung dịch đầu dò được chuẩn bị bằng cách pha dung dịch AgNPs/CQDs ở trên với nước cất theo tỷ lệ 1:10 Sơ đồ chế tạo mô tả trên hình 2.2

Hình 2.2 Cơ chế tạo thành vật liệu AgNPs/CQDs

2.2.2 Chế tạo cảm biến phát hiện hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs

Pha dung dịch H2O2 với các nồng độ khác nhau (0,5 M đến 100 M) Lấy 200 L dung dịch H2O2 đã chuẩn bị cho vào ống eppendorf loại 1,5 mL Sau đó, cho vào 1000 L dung dịch AgNPs/CQDs, lắc trộn dung dịch trên máy vortex trong khoảng 10 giây rồi đem ống eppendorf ngâm vào bể ổn nhiệt ở 40 o C trong vòng 30 phút Lấy ống eppendorf ra, để nguội đến nhiệt độ phòng và đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 425 nm (OD425 nm) Phần trăm chênh lệch độ hấp thụ quang ở 425nm (A/A) của dung dịch có và không có mặt H2O2 được sử dụng làm tín hiệu của cảm biến để xác định nồng độ H2O2 trong mẫu theo công thức:

Trong đó: A = A0 - AC với A0 và AC lần lượt là độ hấp thụ quang A ở bước sóng

425 nm (OD425) của dung dịch AgNPs/CQDs trước và sau khi có mặt H2O2 ở nồng độ C (mM) Để tối ưu hóa điều kiện phản ứng, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như pH, nhiệt độ, nồng độ của xúc tác Quy trình thực nghiệm giống như trên, chỉ thay đổi điều kiện hoặc nồng độ của các tác nhân khi khảo sát phản ứng

2.2.3 Chế tạo cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs

Trước hết, 100 μL dung dịch glucose với các nồng độ khác nhau (từ 0,5 mM đến 8 mM) pha trong đệm PBS (pH=7) được lấy vào ống eppendorf, tiếp đó 100 μL dung dịch nhiệt trong 30 phút Tiếp theo, 1000 μL dung dịch AgNPs/CQDs được thêm vào ống, hỗn hợp được trộn đều rồi ủ ở nhiệt độ 40 o C trong bể ổn nhiệt trong vòng 30 phút, sau đó lấy ra để nguội đến nhiệt độ phòng rồi chuyển vào cuvet để đo độ hấp thụ A ở bước sóng 425 nm Phần trăm chênh lệch độ hấp thụ ở bước sóng 425 nm (A/A) được dùng làm tín hiệu để xác định nồng độ glucose trong mẫu theo công thức (CT2.1) tuy nhiên, với A =A0 -

AC với A0 và AC lần lượt là độ hấp thụ quang A ở bước sóng 425 nm (OD425) của hỗn hợp chứa AgNPs/CQDs khi không có và có mặt glucose ở nồng độ C (mM)

2.2.4 Ứng dụng cảm biến glucose trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs cho mẫu thực

Cảm biến được ứng dụng để xác định nồng độ glucose trong mẫu nước tiểu người Cách tiến hành: mẫu nước tiểu được lấy từ các tình nguyện viên, sau đó đem pha loãng với dung dịch đệm PBS nồng độ 0,001 M với tỷ lệ 1:4 về thể tích Lấy 100 μL dung dịch nước tiểu pha loãng với vai trò như mẫu glucose rồi tiến hành các bước như với dung dịch glucose ở mục 2.2.3

2.2.5 Chế tạo hệ thống xét nghiệm hàng loạt, ứng dụng để phát hiện hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) trên cơ sở vật liệu AgNPs/CQDs sử dụng phần mền ImageJ

2.2.5.1 Chế tạo hệ thống đo

Hệ thống được chế tạo dựa trên các thiết bị và sản phẩm quy chuẩn gồm điện thoại thông minh (smartphone), ipad, và khay Elisa 96 giếng Quy trình chế tạo như sau:

- Buồng tối bằng gỗ hoặc tấm nhựa có kích thước dài x rộng x cao (19cm x 14 cm x 30 cm), rỗng hai đầu, đầu hở trên đỉnh có kích thước 12,5 cm x 8,5 cm trên đỉnh, phù hợp với mặt lưng chứa camera của điện thoại thông minh và phía dưới chân để hở để đặt nguồn sáng từ màn hình ipad mini như hình 2.3

Hình 2.3 (a) Hệ thống phân tích được chế tạo, (b) Top-view và (c) Sơ đồ bố trí của thiết phân tích nồng độ H 2 O 2 trong giếng Elisa bằng điện thoại qua phần mềm ImageJ

- Màn hình của iPad mini được sử dụng làm nguồn ánh sáng nền, thông qua ứng dụng miễn phí MyLight trên Apple Store

- Giữa thân hình trụ của buồng tối có gắn thanh để gá khay Elisa 96 giếng;

- Điện thoại thông minh được đưa vào bên trong buồng tối đặt bên dưới buồng tối và chụp lại ảnh

- Phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ được sử dụng để đánh giá cường độ màu của ảnh

[15] Để định lượng màu vàng, cường độ kênh xanh lam được chọn vì nó mang lại kết quả tốt nhất Quy trình chụp ảnh và xử lý ảnh để thu số hiệu được sơ đồ hoá như trên hình 2.4

Hình 2.4 Sơ đồ xử lý tín hiệu đo từ hệ thống 2.2.5.2 Quy trình thao tác trên hệ thống

- Cho vào các giếng trong khay Elisa 96 200 L dung dịch AgNPs/CQDs Sau đó, lấy 50

L dung dịch H2O2 với các nồng độ khác nhau (50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM) đã chuẩn bị vào, để ở nhiệt độ phòng trong 40 phút Mỗi một nồng độ được đưa vào

- Tiến hành chụp ảnh khay Elisa;

- Dùng phần mềm để đo cường độ màu các giếng trên ảnh Cho kết quả cường độ màu của mẫu là kết quả trung bình của 12 giếng;

- Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như trên và H2O2 được thay bằng nước cất.

Tổng hợp vật liệu Fe 3 O 4 bọc carbon (Fe@C) và ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học

2.3.1 Tổng hợp vật liệu Fe@C

Hình 2.5 Sơ đồ tổng hợp vật liệu Fe@C

- Cân các muối (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O, Fe@Cl3.6H2O, glucose theo tỷ lệ khối lượng và pha dung dịch NaOH 10 %

- Các muối được trộn theo đúng tỷ lệ mol Fe 2+ : Fe 3+ = 2:1 (trên bảng 2.1) theo phương trình phản ứng (PT 2.1, PT 2.2) trong cốc 500 mL Hỗn hợp được hòa tan khi đặt lên máy khuấy từ, gia nhiệt cho phản ứng lên đến 80 o C Dùng nhiệt kế xác định nhiệt độ của dung dịch, khi dung dịch đạt 80 o C, nhỏ từ từ dung dịch NaOH 10 % vào hỗn hợp hai muối, khuấy trộn với tốc độ ổn định cho đến khi pH đạt 9 hoặc 10 thì ngưng lại và tiếp tục khuấy trộn và gia nhiệt cho phản ứng ở 80 o C trong 2 h để phản ứng hoàn toàn

11,89 g Fe@Cl 3 6H 2 O và 8.63 g (NH 4 )Fe(SO 4 ) 2 6H 2 O

Dung dịch NaOH 10% dư pH =9-10

Kết tủa màu đen glucose

Kết tủa sau thủy nhiệt

Khuấy và thủy nhiệt 160 o C và 8 h Để nguội đến nhiệt độ phòng 1 h Lọc, rửa bằng nước và sấy 24 h

Quy trình tổng hợp hạt sắt từ được mô tả theo các phương trình phản ứng:

Fe 2+ + 2 Fe 3+ + 8 OH - ® Fe3O4 + 4 H2O (PT 2.2)

- Thu sản phẩm, khi kết thúc bước 2, dùng nam châm hút các hạt nano Fe3O4 lại, gạn bỏ nước trong, tháo bỏ nam châm; thêm nước cất vào rồi đem siêu âm Lại dùng nam châm hút giữ các hạt nano Fe3O4 lại, gạn bỏ nước trong đi, tháo bỏ nam châm; thêm nước cất rồi đem siêu âm Lặp lại quy trình đến khi pH của nước trong đạt pH từ 7-7,5 thì kết thúc

- Từ các hạt nano Fe3O4 đã tổng hợp được ở bước trên, tùy vào loại mẫu cần tổng hợp (bảng 2.1) chuẩn bị lượng glucose khác nhau Sau khi cân lượng glucose cần dùng, thêm nước cất để hòa tan glucose, cho vào cốc đang chứa hạt nano Fe3O4 Hỗn hợp được khuấy trộn rồi đem siêu âm trong vòng 20 phút và theo các bước dưới đây: (1) Hỗn hợp thu được trộn với glucose theo tỷ lệ như trong bảng 2.1 Sau đó đem siêu âm hỗn hợp rồi cho vào autoclave để thủy nhiệt hỗn hợp ở nhiệt độ 160 o C trong 8h; (2) Để nguội autoclave về nhiệt độ phòng, tháo hỗn hợp ra Dùng nam châm kích thước dài x rỗng x cao (10x5x2 cm) hút các hạt nano Fe3O4 bọc carbon (Fe@C), bỏ nước trong Sau đó rửa hỗn hợp thu được sau khi thủy nhiệt về môi trường trung tính; đem sấy ở nhiệt độ 80 o C trong 24 h; (3) Thu được chất rắn màu đen, nghiền mịn thu được hạt nano Fe@C Các mẫu sau khi điều chế được đem phân tích XRD, SEM, TEM, VSM, IR để xác định cấu trúc của vật liệu

Bảng 2.1 Thành phần chế tạo mẫu

Ký hiệu Mẫu Fe@Cl 3 6H 2 O

2.3.2 Chế tạo cảm biến phát hiện hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) trên cơ sở vật liệu Fe@C

2.3.2.1 Chế tạo cảm biến phát hiện H 2 O 2 trên cơ sở vật liệu Fe@C

Lấy 1 mL dung dịch đệm axetat (pH4) cho vào ống eppendorf 1,5 mL; lấy vào đó

20 àl dung dịch xỳc tỏc Fe@C (2 mg.mL -1 ); 20 àL dung dịch TMB (20 mg.mL -1 ); 100 àL

H2O2 (nồng độ thay đổi từ 0.01 mM đến 1 mM) Hỗn hợp được khuấy trộn bằng máy votex trong 10 giây rồi ủ ở nhiệt độ 40 o C trong 30 phút; Để nguội về nhiệt độ phòng và đem đo phổ UV-Vis Trên phổ UV-Vis, pic hấp thụ tại bước sóng 652 nm được dùng làm tín hiệu để đánh giá và xử lý số liệu Để tối ưu hóa điều kiện phản ứng, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như pH, nhiệt độ, nồng độ của xúc tác Quy trình thực nghiệm giống như trên chỉ thay đổi điều kiện hoặc nồng độ của các tác nhân khi khảo sát phản ứng

2.3.2.2 Chế tạo cảm biến xác định nồng độ glucose trên cơ sở vật liệu Fe@C

Cho 100 μL dung dịch đệm PBS (0,01 M); 100 μL dung dịch glucose (nồng độ khác nhau) và 50 μL GOx (2 mg/mL) vào ống eppendorf Hỗn hợp được lắc đều rồi ủ ở nhiệt độ 40 o C trong 30 phút Sau đó, cho thêm 20 μL dung dịch Fe@C (2 mg/mL) ; 20 μL dung dịch TMB (20 mg/mL) và 1 mL dung dịch đệm axetat (pH4) vào ống eppendorf tương ứng Cuối cùng, hỗn hợp được ủ trong 40 o C trong 30 phút rồi chuyển đến cuvet để đo phổ UV-Vis

2.3.2.3 Ứng dụng vật liệu Fe@C trong chế tạo cảm biến xác định glucose trong dung dịch và mẫu thực a) Xác định glucose trong dung dịch

Dung dịch glucose truyền tĩnh mạch 5 %: tức có nồng độ glucose là khoảng 277 mM Dung dịch này được pha loãng với các tỷ lệ 1:100; 1:200 và 1:300 và dùng như mẫu glucose để chạy cảm biến Dung dịch glucose pha sẵn ở nồng độ 0,55 mM được dùng làm mẫu so sánh Kết quả đo được nằm trong vùng tuyến tính nên tính được nồng độ glucose trong mẫu 4 dựa theo mẫu chuẩn S1:

As1/Cs1= Amẫu/Cmẫu (CT 2.2) Kết quả tính toán nồng độ glucose trong các mẫu đo, suy ra nồng độ trong mẫu gốc theo kết quả đo đạc Từ đó tính toán sai số so với trong mẫu gốc theo công thức: Sai số

(%) = (277- Co đo được)*100/277 (CT 2.3) b) Xác định glucose trong huyết thanh mẫu máu:

Mẫu máu thực được cung cấp bởi một Trung tâm Y tế trên địa bàn Hà Nội (được sự đồng ý của Trung tâm, không được cung cấp danh tính mẫu, chỉ được cho thông số nồng độ glucose trong mẫu): mẫu đã được ly tâm tách hết hồng cầu, bạch cầu, các đại phân tử thu được dung dịch serum (huyết thanh) Trong nghiên cứu mẫu được sử dụng trực tiếp như dung dịch chứa glucose Mẫu được bảo quan trong ống eppendorf tránh ánh nắng chiếu trực tiếp, thời gian sử dụng mẫu để phân tích không quá 4h kể từ thời điểm lấy mẫu Để xác định nồng độ glucose trong các mẫu huyết thanh thu được bằng phương pháp so sánh [71] Phương pháp này sử dụng hệ cảm biến để tiến hai thí nghiệm với mẫu thử lần lượt là: mẫu chuẩn (standard) là dung dịch chuẩn đã xác định nồng độ glucose và mẫu phân tích (sample) là mẫu huyết tương cần phân tích Sau khi kết thúc các phản ứng, các mẫu thử được đo độ quang hấp thụ ở bước sóng 652 nm trên máy UV-Vis Từ các số liệu thu được qua đo UV-Vis, nồng độ glucose trong mẫu máu được xác định như sau:

𝐴 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 × [𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛] (𝑚𝑀) (CT 2.4) Trong đó: Asample là độ quang hấp thụ tại 652 nm của mẫu thử là dung dịch cần phân tích; Astandard là độ quang hấp thụ tại 652 nm của mẫu thử là dung dịch chuẩn

Như vậy với phương pháp này có thể xác đinh được nồng độ glucose trong mẫu thử, đồng thời có thể so sánh nhanh nồng độ glucose trong mẫu thử với mẫu chuẩn qua độ quang hấp thụ tại 652 nm Do vậy nồng độ glucose trong mẫu chuẩn thường được chọn là nồng độ glucose cao nhất có thể đạt được trong máu của người không bị bênh, cụ thể là 5,55 mM

Tuy nhiên để phù hợp với giới hạn đo của thiết bị nghiên cứu, mẫu thử và mẫu chuẩn sẽ được đồng thời pha loãng 10 lần Như vậy, trong nghiên cứu này, nồng độ glucose trong mẫu thực được xác định như sau:

2.4 Tổng hợp vật liệu FeOOH/ chấm carbon lượng tử pha tạp nitơ (FN-CQDs) ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học

2.4.1 Tổng hợp vật liệu FN-CQDs

Hình 2.6 Sơ đồ tổng hợp vật liệu FN-CQDs

Vật liệu FN-CQDs được tổng hợp theo quy trình sau: Chuẩn bị hạt nano sắt từ: hạt nano sắt từ (Fe3O4) được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa bằng cách cho 3,39 g

(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O và 4,69 g Fe@Cl3.6H2O trộn lẫn và hòa tan hoàn toàn vào 50mL nước cất Dung dịch sau khi hòa tan được khuấy và gia nhiệt tới 40 o C trên máy khuấy từ có gia nhiệt Tiếp theo, thêm từ từ dung dịch NH3 10% vào dung dịch đang được khuấy ở trên cho tới khi pH = 8,5 thì dừng lại Khi đó, các hạt nano Fe3O4 được hình thành dưới dạng kết tủa màu đen ở trong bình phản ứng Sau khi các hạt nano sắt từ được hình thành, vẫn duy trì khuấy và bảo ôn nhiệt ở 40 o C trong 30 phút, rồi thu các hạt Fe3O4 bằng nam châm vĩnh cửu và rửa sản phẩm 5 – 7 lần cho tới khi nước rửa có pH = 7; tiếp đến, hòa tan

8g chitosan trong 400 mL axit axetic 1% tới khi thu được dung dịch chitosan dạng keo, nhớt Sau đó, trộn lẫn lượng nano sắt từ tổng hợp được từ bước trên vào dung dịch chitosan, khuấy đều đến khi thu được dung dịch đồng nhất Chuyển dung dịch trên vào ống teflon, đưa vào bình phản ứng thủy nhiệt (autoclave) và thủy nhiệt 8 giờ tại 180 o C trong tủ sấy

Kết thúc quá trình thủy nhiệt, bình phản ứng được lấy ra và làm nguội ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp thu được sau thủy nhiệt đem li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 20

4,69 g Fe@Cl 3 6H 2 O và 3,39 g (NH 4 )Fe(SO 4 ) 2 6H 2 O

Dung dịch NH 3 10% dư pH =8-9

Dung dịch sau thủy nhiệt

Dung dịch FeOOH/ chấm lượng tử pha tạp nito (FN-CQDs)

Khuấy và gia nhiệt pứ 40 o C

Lọc rửa bằng nước đến pH=7

Khuấy và thủy nhiệt 180 o C và 8 h Để nguội đến nhiệt độ phòng 1 h ly tâm để loại bỏ hạt kích thước lớn và chỉnh pH= 7-8

Khảo sát hoạt tính của các nanozyme (Fe@C, FN-CQDs)

Việc nghiên cứu động học enzym cho chúng ta biết được cơ chế phân tử các sự tác động, quan hệ về mặt lượng của quá trình enzym, đồng thời đánh giá được khả năng và điều kiện hoạt động của enzym

Do có tính xúc tác tương tự enzym HRP (như đã nêu ở trên) các vật liệu như Fe@C, FN-CQDs này có cơ chế hoạt động tương tự như HRP Điều này dẫn đến việc cần nghiên cứu động học enzym của Fe@C, FN-CQDs để so sánh khả năng xúc tác của vật liệu với HRP cũng như các vật liệu khác Hằng số động học enzym, hay hằng số Michaelis - Menten, ký hiệu Km, chính là giá trị cần tìm trong quá trình nghiên cứu động học, đặc trưng cho mỗi enzym và ái lực của enzym với cơ chất Để xác định hằng số động học Km trong phản ứng giữa TMB và H2O2, giữ nguyên nồng độ H2O2, thay đổi nồng độ TMB, ta thu được Km với TMB Ngược lại, giữ nguyên nồng độ TMB, thay đổi nồng độ H2O2, ta thu được Km với H2O2 Từ đó ta có thể xây dựng được đồ thị theo phương trình Michaelis–Menten hoặc phương trình Lineweaver-Burk (phương trình Michaelis-Menten nghịch đảo) Tuy nhiên, phương trình Linewearver-Burk có thể quy về phương trình tuyến tính, dễ dàng xác định được hằng số Km nên thường được sử dụng nhiều:

Với v là vận tốc ban đầu của phản ứng (được xác định từ nồng độ TMB đã bị oxi hóa và thời gian phản ứng), Vmax là vận tốc lớn nhất của phản ứng, [C] là nồng độ chất thay đổi và Km là hằng số Michaelis Phương trình trên có thể coi là phương trình tuyến tính có dạng y = a + bx, với hệ số a = 1/Vmax và b = Km/Vmax Hằng số Km càng có giá trị nhỏ dẫn đến ái lực của xúc tác với chất nền càng cao [72, 73] Do vậy Km càng nhỏ thì khả năng xúc tác của vật liệu giống nanozyme càng tốt.

Các phương pháp xử lý số liệu

2.6.1 Độ nhạy Đối với cảm biến tuyến tính, giữa biến thiên đầu ra Δs và biến thiên đầu vào Δm có sự liên hệ tuyến tính: Δs = S.Δm (CT 2.6)

Trong đó: Đại lượng S xác định bởi biểu thức, được gọi là độ nhạy của cảm biến Trường hợp tổng quát, biểu thức xác định độ nhạy S của cảm biến xung quanh giá trị mi của đại lượng đo xác định bởi tỷ số giữa biến thiên Δs của đại lượng đầu ra và biến thiên Δm tương ứng của đại lượng đo ở đầu vào quanh giá trị đó Để phép đo đạt độ chính xác cao, khi thiết kế và sử dụng cảm biến cần làm sao cho độ nhạy S của nó không đổi, nghĩa là ít phụ thuộc nhất vào các yếu tố sau:

- Giá trị của đại lượng cần đo m và tần số thay đổi của nó

- Ảnh hưởng của các đại lượng vật lý khác (không phải là đại lượng đo) của môi trường xung quanh Thông thường nhà sản xuất cung cấp giá trị của độ nhạy S tương ứng với những điều kiện làm việc nhất định của cảm biến

2.6.2 Độ chọn lọc (độ đặc hiệu) Độ đặc hiệu của một xét nghiệm là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trường hợp không bị bệnh Độ đặc hiệu được tính theo công thức sau: Độ đặc hiệu = Số trường hợp âm tính thật/(số trường hợp âm tính thật + số trường hợp dương tính giả) (CT.2.7) Đối với một xét nghiệm để xác định xem ai mắc bệnh nào đó, độ đặc hiệu 100% có nghĩa là toàn bộ những người khỏe mạnh (không mắc bệnh) được xác định là khỏe mạnh

Một mình độ đặc hiệu không cho chúng ta biết toàn bộ về xét nghiệm bởi vì 100% độ đặc hiệu có thể có được một cách thông thường bằng việc gán cho toàn bộ các trường hợp kết quả xét nghiệm âm tính Chính vì vậy, chúng ta cần phải biết thêm về độ nhạy của xét nghiệm

2.6.3 Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện (hay còn gọi là limit of detection – LOD) là giới hạn dưới về nồng độ mà cảm biến có thể nhận biết được sự có mặt của chất cần phân tích với mẫu trắng (mẫu không có mặt chất cần phân tích hoặc chất cạnh tranh) Thông thường LOD được tính theo công thức [2]:

Trong đó : ALOD – tín hiệu mẫu ứng với nồng độ thấp nhất mà cảm biến có thể phát hiện (LOD); 𝑨̅ 𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘 : tín hiệu trung bình của mấu trắng; và ϭBlank là sai số tuyệt đối của mẫu trắng Sai số này được tính theo công thức:

Với : N- số thí nghiệm với mẫu trắng, để có ý nghĩa thống kê tốt thì N phải lớn (thường N>5); 𝐴 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘(𝑖) – là tín hiệu mẫu trắng thứ 1 Với giá trị ALOD tính toán được, nội suy hoặc ngoại suy từ đường chuẩn ta tính toán được giá trị LOD.