Nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lựcNghiên cứu quá trình phát sinh hình thái và sinh trưởng in vitro của một số cây trồng có giá trị kinh tế dưới điều kiện mô phỏng không trọng lực
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÊ THẾ BIÊN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH HÌNH THÁI VÀ SINH TRƯỞNG IN VITRO CỦA MỘT SỐ CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ DƯỚI ĐIỀU KIỆN MƠ PHỎNG KHƠNG TRỌNG LỰC TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 42 02 01 Hà Nội – 2024 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Dương Tấn Nhựt, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên TS Bùi Văn Thế Vinh, Trường Đại học Công nghệ TP.HCM Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Trung Thành Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Huy Hoàng Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Du Sanh Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện họp Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … … phút, ngày … tháng … năm … Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trọng lực lực phổ biến Trái Đất sinh vật sống tiến hóa theo hướng thích nghi phát triển mạnh diện trọng lực Do đó, khơng có ngạc nhiên mơi trường trọng lực bị thay đổi điều kiện siêu trọng lực khơng trọng lực (Microgravity - MG) có tác động đáng kể đến sinh trưởng, phát triển hình thái thực vật Với quan tâm ngày tăng nông nghiệp không gian, nhà khoa học làm việc năm thập kỷ qua để hiểu rõ ảnh hưởng không trọng lực nhiều loại thực vật Khi người khám phá sâu vào vũ trụ, công tác hậu cần toán kinh tế việc vận chuyển thực phẩm đóng gói cho thành viên phi hành đồn ngày trở nên khơng thực tế Bên cạnh đó, chất dinh dưỡng có xu hướng cạn kiệt đáng kể thực phẩm đóng gói bảo quản khơng gian Do đó, thí nghiệm sinh học thực vật không gian cần thiết nhằm cung cấp thực phẩm tươi sống cho phi hành gia phát triển thành hệ thống tái tạo sinh học bền vững hỗ trợ sống để khám phá không gian thời gian dài Trong năm thập kỷ qua, hiểu biết thú vị tiết lộ sinh học thực vật thông qua nghiên cứu chuyến bay tàu vũ trụ quanh quỹ đạo tảng điều kiện mô không trọng lực (Simulated microgravity - SMG) thiết bị Clinostat (2-D 3-D), máy định vị ngẫu nhiên (RPM) mặt đất Ví dụ, ảnh hưởng MG lên thay đổi cấp độ tế bào phân tử dẫn đến thay đổi kiểu hình thực vật thay đổi thành tế bào chu kỳ tế bào làm sáng tỏ chi tiết Quá trình phân chia mạnh mẽ tăng sinh tế bào thực vật quan sát rõ ràng điều kiện MG, phản ứng sinh lý, đặc biệt phân bố/dịch chuyển tế bào sỏi thăng (statolith), trình quang hợp biến dạng hạt tinh bột báo cáo Sự thay đổi sinh hóa cụ thể thay đổi hàm lượng chất diệp lục, thay đổi vị trí hormone thực vật cân nội môi canxi tế bào để đáp ứng không trọng lực ghi nhận rõ ràng Các kiến thức thu thông qua thí nghiệm ứng dụng thành cơng với việc trồng Xà lách Cơ quan hàng không vũ trụ Hoa Kỳ (NASA) Trạm Vũ trụ quốc tế (ISS) để góp phần bổ ích vào chế độ ăn uống phi hành đoàn Bên cạnh đó, kết từ Chương trình Hạt giống khơng gian cho tương lai Châu Á giai đoạn 2010 – 2011 cho thấy việc xử lý hạt giống môi trường không trọng lực đem gieo trồng mặt đất cho thấy hạt giống kích thích nảy mầm nhiều tăng khả tích lũy hợp chất thứ cấp Điều mở tiềm to lớn cho lĩnh vực công nghệ sinh học việc chọn tạo giống sản xuất sinh khối thu nhận dược chất quý phục vụ cho công nghiệp dược phẩm Tuy nhiên, đa số nghiên cứu kể thực khơng gian địi hỏi trình độ kỹ thuật chuyên môn cao từ nhà khoa học, chế độ kiểm soát nghiêm ngặt sở vật chất đại nên bị giới hạn phạm vi số cường quốc không gian Các quốc gia phát triển Việt Nam chưa có đủ tiềm lực kinh tế trình độ khoa học kỹ thuật để thực nghiên cứu điều kiện Vì vậy, việc lựa chọn giải pháp khả thi thúc đẩy thiết bị mô điều kiện không trọng lực mặt đất xem phù hợp cho việc nghiên cứu chủ động dài hạn bối cảnh khoa học vũ trụ non trẻ nước nhà Đặc biệt, việc nghiên cứu để tìm hiểu trình phát sinh hình thái sinh trưởng thực vật kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào điều kiện mô không trọng lực phương pháp tối ưu cho việc ghi nhận vai trị khơng trọng lực giai đoạn sớm chu trình sống thực vật Từ đó, chọn lọc biến dị cung cấp nguồn nguyên liệu cho chọn tạo giống sản xuất sinh khối thực vật, cung cấp thêm tri thức cho sứ mệnh chinh phục khơng gian lồi người việc tạo hệ thống hỗ trợ sống sinh học bên Trái Đất Đề tài “Nghiên cứu trình phát sinh hình thái sinh trưởng in vitro số trồng có giá trị kinh tế điều kiện mô không trọng lực” hướng nghiên cứu hoàn toàn giới Việt Nam Nghiên cứu thực ba loại trồng đại diện cho nhóm hoa cảnh (Thu hải đường), ăn trái (Dâu tây) dược liệu (Diệp hạ châu đắng) khẳng định có giá trị kinh tế cao kỳ vọng chúng giống trồng có khả đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng, sức khỏe tinh thần cho người sống bên Trái Đất Mục tiêu đề tài Mục tiêu tổng quát Đánh giá ảnh hưởng điều kiện SMG lên trình phát sinh hình thái sinh trưởng in vitro hoa Thu hải đường, Dâu tây Diệp hạ châu đắng Mục tiêu cụ thể Đánh giá ảnh hưởng điều kiện SMG lên đường phát sinh hình thái hoa Thu hải đường, Dâu tây Diệp hạ châu đắng Đánh giá ảnh hưởng điều kiện SMG lên hàm lượng tỷ lệ hormone nội sinh, hoạt tính enzyme kháng oxy hóa, tích lũy hợp chất thứ cấp chuyển hóa lượng q trình phát sinh hính thái hoa Thu hải đường, Dâu tây Diệp hạ châu đắng Nghiện cứu ghi nhận sinh trưởng điều kiện trọng lực thực hoa Thu hải đường, Dâu tây Diệp hạ châu đắng có nguồn gốc ni cấy in vitro điều kiện SMG Những đóng góp luận án Nghiên cứu cho thấy điều kiện SMG tác động lên đường phát sinh hình thái hoa Thu hải đường, Dâu tây Diệp hạ châu đắng theo hướng khác Nghiên cứu cho thấy trình phát sinh hình thái hoa Thu hải đường, Dâu tây Diệp hạ châu đắng có thay đổi sinh hóa để đáp ứng thích nghi với điều kiện trọng lực bị thay đổi Nghiên cứu cho thấy sinh trưởng hoa Thu hải đường, Dâu tây Diệp hạ châu đắng có nguồn gốc ni cấy in vitro điều kiện SMG đưa điều kiện trọng lực thực có ưu việt so với đối chứng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết vấn đề với nội dung liên quan đến: (1) Thực vật trọng lực; (2) Điều kiện không trọng lực thực điều kiện mô không trọng lực; (3) Quá trình phát sinh hình thái thực vật điều kiện MG; (4) Quá trình sinh trưởng thực vật điều kiện MG; (5) Sự thay đổi sinh lý sinh hóa thực vật điều kiện MG; (6) Sơ lược đối tượng thực vật CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG 2.1.1 Đối tượng thực vật Mẫu cuống tháng tuổi hoa Thu hải đường (Begonia tuberous) Dalat Hasfarm (Lâm Đồng, Việt Nam) sử dụng làm nguồn mẫu nuôi ban đầu Mẫu Dâu tây Camarosa (Fragaria × ananassa Duch.) in vitro tuần tuổi xác định tính đa dạng di truyền ổn định qua nhiều lần cấy chuyền môi trường MS Trung tâm Nghiên cứu Đa dạng sinh học Biến đổi khí hậu (Trường Đại học Đà Lạt, Lâm Đồng, Việt Nam) sử dụng làm nguồn mẫu ban đầu Mẫu lóng thân Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum & Thonn.) in vitro tuần tuổi sinh trưởng phát triển tốt ổn định qua nhiều lần cấy chuyền môi trường MS Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên (Lâm Đồng, Việt Nam) sử dụng làm nguồn mẫu ban đầu 2.1.2 Môi trường nuôi cấy Môi trường sử dụng thí nghiệm mơi trường khống MS bổ sung khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng thực vật tùy vào mục đích thí nghiệm, pH điều chỉnh 5,8 hấp tiệt trùng nồi hấp 121°C, 15 psi vịng 20 phút 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất Thiết bị Clinostat 2-D (Advanced Engineering Services Co., Ltd., Nhật Bản) với tốc độ quay rpm lựa chọn cho mục đích SMG Đây tốc độ quay chậm (cổ điển) nhà sinh lý học thực vật sử dụng để nghiên cứu Các dụng cụ hóa chất dùng ni cấy mơ tế bào thường quy 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện SMG lên đường phát sinh hình thái hoa Thu hải đường, Dây tây Diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện SMG lên hàm lượng, tỷ lệ hormone nội sinh, hoạt tính enzyme kháng oxy hóa, tích lũy hợp chất thứ cấp chuyển hóa lượng q trình phát sinh hình thái hoa Thu hải đường, Dây tây Diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro Nội dung 3: Nghiên cứu ghi nhận sinh trưởng điều kiện trọng lực thực hoa Thu hải đường, Dây tây Diệp hạ châu đắng có nguồn gốc ni cấy in vitro điều kiện SMG 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát sinh SE mẫu cấy p-tTCL hoa Thu hải đường nuôi cấy in vitro 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiên SMG lên phát sinh mô sẹo chồi mẫu cấy Dâu tây ni cấy in vitro 2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát sinh mô sẹo rễ bất định mẫu cấy lóng thân Diệp hạ châu đắng ni cấy in vitro 2.3.1.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện SMG lên hàm lượng tỷ lệ hormone nội sinh trình phát sinh SE hoa Thu hải đường, chồi Dâu tây, mô sẹo rễ bất định Diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro 2.3.1.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện SMG lên hoạt tính enzyme kháng oxy hóa q trình phát sinh mơ sẹo Dâu tây, mô sẹo rễ bất định Diệp hạ châu đắng ni cấy in vitro 2.3.1.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện SMG lên tích lũy hợp chất thứ cấp q trình phát sinh mô sẹo rễ bất định Diệp hạ châu đắng ni cấy in vitro 2.3.1.7 Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện SMG lên chuyển hóa lượng (tinh bột đường) trình phát sinh SE hoa Thu hải đường ni cấy in vitro 2.3.1.8 Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ghi nhận sinh trưởng môi trường trọng lực thực chồi Thu hải đường, Dâu tây có nguồn gốc ni cấy in vitro điều kiện SMG 2.3.1.9 Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ghi nhận tăng sinh môi trường trọng lực thực mơ sẹo Diệp hạ châu đắng có nguồn gốc nuôi cấy in vitro điều kiện SMG 2.3.1.10 Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ghi nhận thích nghi vườn ươm Dâu tây nguồn gốc nuôi cấy in vitro điều kiện SMG 2.3.2 Phương pháp giải phẫu hình thái 2.3.3 Phương pháp xử lý thống kê CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát sinh SE mẫu cấy p- tTCL hoa Thu hải đường nuôi cấy in vitro Kết ghi nhận cho thấy điều kiện SMG không ảnh hưởng đến khả tái sinh mẫu cấy với tỷ lệ tái sinh đạt 100% nghiệm thức SMG G sau 30 ngày ni cấy (Hình 3.1A-D) Tuy nhiên, vào ngày ni cấy thứ 14, mẫu cấy nghiệm thức SMG bắt đầu xảy tượng cảm ứng (Hình 3.1B); chưa có tế bào biểu bì mẫu nghiệm thức G có tượng (Hình 3.1A) Hơn nữa, quan sát hình thái cho thấy phát sinh SE từ mô sẹo sinh phôi điều kiện G (Hình 3.1C) xảy với tốc độ chậm so với điều kiện SMG (Hình 3.1D) sau 30 ngày ni cấy Có thể thấy điều kiện SMG rút ngắn thời gian cảm ứng phát sinh SE so với nghiệm thức điều kiện G (khoảng ngày) (Hình 3.1E) Sau tháng ni cấy, kết cho thấy có hai chương trình biệt hóa diễn điều kiện SMG G SE (Hình 3.2A-C) rễ bất định (Hình 3.2.D) Hình 3.1 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên cảm ứng SE mẫu p-tTCL hoa Thu hải đường in vitro sau 30 ngày nuôi cấy A, B: Quá trình tạo SE lớp biểu bì tế bào mẫu p-tTCL sau 15 ngày nuôi cấy (mũi tên cảm ứng tế bào); C, D: Biệt hóa SE từ mơ sẹo sinh phơi sau 30 ngày nuôi cấy; E: Thời gian cảm ứng SE; *Sự khác biệt đáng kể giá trị trung bình theo phép thử Tukey (p < 0,05) Trong đó, SE chủ yếu quan rễ bất định hình thành với số lượng không đáng kể (dữ liệu hiện) Những kết điều kiện SMG không can thiệp đến biệt hóa tế bào mẫu p-tTCL hoa Thu hải đường Hơn nữa, quan sát hình thái mơ học cho thấy điều kiện SMG SE trải qua giai đoạn phát triển điển hình phơi soma tương tự G (Hình 3.2E) Các tác động điều kiện SMG lên phát triển SE đánh giá thông qua khối lượng tươi, khối lượng khô hàm lượng diệp lục tổng (Hình 3.3) Về bản, quan sát hình thái cho thấy khí khổng điều kiện G có hình bầu dục đặc trưng (Hình 3.4.A); khí khổng nghiệm thức SMG có hình elip (thn dài) độ mở khí khổng lớn quan sát (Hình 3.4.B) Dưới điều kiện SMG, khí khổng có chiều dài gấp 1,4 lần so với đối chứng; đó, chiều rộng khí khổng khơng thay đổi điều kiện SMG (Hình 3.4.C) 10 Hình 3.3 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát triển SE mẫu p-tTCL hoa Thu hải đường in vitro sau 1, 2, tháng ni cấy A: Q trình tạo SE điều kiện SMG G sau tháng nuôi cấy; B: Khối lượng tươi khối lượng khô SE; C: Hàm lượng chlorophyll tổng số SE trưởng thành; *Sự khác biệt đáng kể giá trị trung bình theo phép thử Tukey (p < 0.05) 3.2 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát sinh mô sẹo chồi mẫu cấy Dâu tây nuôi cấy in vitro Kết ghi nhận cho thấy, thời gian cảm ứng (2 tuần) hình thái mơ sẹo điều kiện SMG điều kiện G quan sát tương đồng; nhiên, khả tái sinh chồi mẫu cấy Dâu tây in vitro hai điều kiện có khác biệt (Bảng 3.1 Hình 3.5) 11 Hình 3.4 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên hình thái khí khổng SE trưởng thành mẫu p- tTCL hoa Thu hải đường in vitro A: Dưới điều kiện G; B: Dưới điều kiện SMG; C: Chiều dài chiều rộng khí khổng; *Sự khác biệt đáng kể giá trị trung bình theo phép thử Tukey (p < 0.05) Hình 3.5 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát sinh mô sẹo chồi mẫu Dâu tây in vitro sau 2, 3, tuần nuôi cấy Tạo mô sẹo sau tuần (A), tuần (B, C), tuần (D), tuần (E, F) (Thước đo: 0,2 cm); Tái sinh chồi sau tuần (G) điều kiện SMG (Thước đo: 0,5 cm); Tái sinh chồi sau tuần điều kiện G (H) SMG (I) (Thước đo: 0,5 cm); Tái sinh chồi sau tuần điều kiện G (J) SMG (K, L) (Thước đo: 0,5 cm) 12 Bảng 3.1 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát sinh mô sẹo chồi mẫu Dâu tây in vitro sau 2, 3, tuần nuôi cấy Thời gian nuôi cấy tuần tuần tuần tuần Chỉ tiêu G SMG G SMG G SMG G SMG Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo (%) 25,00 53,33 46,33 66,33 62,00 57,00 62,67 56,67 Tỷ lệ mẫu không cảm ứng ±2,89d* ±1,45bc ± 1,45c ± 1,45a ±2,89ab ±1,53abc ± 2,19ab ± 3,48abc (%) 75,00 46,67 53,67 Tỷ lệ tái sinh chồi (%) ± 2,89a ± 1,45b ± 1,45b 27,00 25,00 23,67 16,00 7,00 ± 1,53c ± 2,89c ± 0,67cd ± 1,00d ± 1,54e Khối lượng tươi (mg) -** - - 6,67 13,00 19,33 21,33 36,33 Khối lượng khô (mg) 90,86 117,49 114,34 ± 0.89d ± 0,00c ± 1,20b ± 1,76b ± 2,33a ± 3,88e ± 2,18d ± 5,00d 10,92 13,83 13,61 158,85 149,69 194,20 183,25 223,25 ± 0,43e ± 0,30d ± 0,36d ± 4,47c ± 3,67c ± 4,51b ± 3,94b ± 6,58a 17,69 17,65 20,85 19,48 24,97 ± 0,48c ± 0,05c ± 0,85b ± 0,42bc ± 0,19a *Các chữ khác (a, b,…) hàng thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nghiệm thức theo phép thử Tukey Giá trị thể bảng là giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn); ** Không ghi nhận số liệu 3.3 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát sinh mô sẹo rễ bất định mẫu cấy lóng thân Diệp hạ châu đắng ni cấy in vitro Kết ghi nhận cho thấy, thời gian cảm ứng mơ sẹo mẫu lóng thân Diệp hạ châu đắng điều kiện SMG G có khơng có khác biệt Tuy nhiên, tỷ lệ cảm ứng mơ sẹo hình thành rễ bất định cho thấy khác biệt điều kiện nuôi cấy (Bảng 3.2) Sau tuần nuôi cấy, tỷ lệ cảm ứng mơ sẹo điều kiện SMG cịn 34,33% tỷ lệ hình thành rễ bất định tăng lên 65,67% Dưới điều kiện G, khơng ghi nhận hình thành rễ bất định sau tuần nuôi cấy (Bảng 3.2 Hình 3.6) Hình 3.6 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát sinh mô sẹo rễ bất định mẫu lóng thân Diệp hạ châu đắng in vitro sau 2, tuần nuôi cấy A: Mô sẹo điều kiện G sau tuần nuôi cấy; B: Mẫu mô sẹo điều kiện SMG sau tuần nuôi cấy; C, D, E: Rễ bất định điều kiện SMG sau 2, tuần nuôi cấy (Thước đo A,B: 0,5 cm; C,D,E: cm) 13 Bảng 3.2 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên phát sinh mô sẹo rễ bất định mẫu lóng thân Diệp hạ châu đắng in vitro sau 2, tuần nuôi cấy Thời gian nuôi cấy tuần tuần tuần Chỉ tiêu theo dõi G SMG G SMG G SMG Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo (%) 100,00 90,33 100,00 62,67 100,00 34,33 ± 0,00a* ± 0,67b ± 0,00a ± 1,76b ± 0,00a ± 1,20c Tỷ lệ hình thành rễ bất định -** 6,67 37,33 65,67 (%) ± 0,67c - ± 1,76b - ± 1,20a Khối lượng tươi (mg) 263,00 541,00 291,00 598,67 313,33 792,00 ± 3,79f ± 3,21c ± 1,53e ± 4,33b ± 2,03d ± 1,73a Khối lượng khô (mg) 24,67 53,83 29,00 59,89 30.07 79,17 ± 0,67e ± 0,41c ± 0,45d ± 0,43b ± 0,25d ± 0,27a *Các chữ khác (a, b,…) hàng thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nghiệm thức theo phép thử Tukey Giá trị thể bảng là giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn); ** Không ghi nhận số liệu 3.4 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên hàm lượng hormone nội sinh trình phát sinh SE hoa Thu hải đường, chồi Dâu tây, mô sẹo rễ bất định Diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro Đối với hoa Thu hải đường, khác biệt đáng kể giai đoạn SE mẫu p-tTCL (Hình 3.7) Hình 3.7 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên thay đổi hàm lượng hormone nội sinh SE mẫu cấy p-tTCL hoa Thu hải đường in vitro A: Hàm lượng AUX; B: Hàm lượng KIN, 2iP, ZEA; C: Hàm lượng GA3; D: Hàm lượng ABA; *Sự khác biệt đáng kể giá trị trung bình theo phép thử Tukey (p < 0.05) Đối với Dâu tây, mẫu chồi có nguồn gốc điều kiện SMG ghi nhận hàm lượng GA3, ABA, KIN cao so với điều kiện G sau tuần ni cấy; đó, hàm lượng AUX, ZEA lại cho kết ngược lại (Hình 14 3.8) Hàm lượng 2iP khác biệt điều kiện ni cấy (Hình 3.8) Hình 3.8 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên thay đổi hàm lượng hormone nội sinh chồi mẫu cấy Dâu tây in vitro sau tuần nuôi cấy; *Sự khác biệt đáng kể giá trị trung bình theo phép thử Tukey (p < 0.05) Đối với Diệp hạ châu đắng, mơ sẹo có nguồn gốc điều kiện SMG ghi nhận hàm lượng GA3, AUX, ABA cao so với điều kiện G; đó, hàm lượng KIN lại cho kết ngược lại (Bảng 3.3) Bảng 3.3 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên hàm lượng hormone nội sinh mô sẹo rễ bất định Diệp hạ châu đắng sau tuần nuôi cấy Nghiệm thức GA3 AUX ABA ZEA KIN 2iP G Mô sẹo 28,00 2,12 0,88 0,19 0,23 0,032 ± 0,130b ± 0,017b ± 0,003c ± 0,006a ± 0,009a ± 0,001a SMG Mô sẹo 29,62 3,24 1,81 0,18 0,17 0,028 Rễ ± 0,064a ± 0,052a ± 0,018a ± 0,006a ± 0,006b ± 0,001a 27,62 2,06 1,74 0,17 0,17 0,27 ± 0,064b ± 0,009b ± 0,009b ± 0,001a ± 0,011b ± 0,001a *Các chữ khác (a, b,…) hàng thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nghiệm thức theo phép thử Tukey Giá trị thể bảng là giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn) 3.5 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên hoạt tính enzyme kháng oxy hóa q trình phát sinh mô sẹo Dâu tây, mô sẹo rễ bất định Diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro Trên Dây tây, hoạt tính enzyme kháng oxy hóa (APX, CAT), hoạt tính bắt gốc tự DPPH hàm lượng phenolic có khác biệt điều kiện nuôi cấy sau 2, 3, tuần (Bảng 3.4) Trên Diệp hạ châu đắng, hoạt tính enzyme kháng oxy hóa SOD, APX, CAT hàm lượng phenolic ghi nhận có khác biệt điều kiện SMG G sau 2, tuần nuôi cấy (Bảng 3.5) 15 Bảng 3.4 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên hoạt tính enzyme kháng oxy hóa mô sẹo Dâu tây sau 2, 3, tuần nuôi cấy Thời gian nuôi cấy tuần tuần tuần tuần Chỉ tiêu theo dõi G SMG G SMG G SMG G SMG CAT (U/g) 96,82 107,69 121,13 137,67 140,05 156,73 163,42 ± 167,90 ± ± 0,929f ±1,227e ±2,147d ± 0,633c ±2,887c ±0,829b 0,229ab 0,241a APX (U/g) 0,11 0,16 ± 0,18 ± 0,22 0,15 ± 0,17 ± 0,12 ± 0,11 ± ± 0,006e 0,007bc 0,003b ±0,007a 0,003cd 0,003b 0,007de 0,006e DPPH (% RSA) 6,61 8,20 ± 7,56 ± 8,69 ± 8,06± 11,42 ± 9,53 ± 13,38 ± ± 0,208f 0,062de 0,026e 0,174d 0,050de 0,136b 0,136c 0,15a Phenolic (mg GAE /100 g 124,57 81,84 ± 131,38 96,05 ± 171,72 148,69 161,88 ± 155,38 ± chất khô) ± 2,378d 2,436f ±0,882d 1,443e ±0,667a ± 2,273c 1,167b 2,315bc *Các chữ khác (a, b,…) hàng thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nghiệm thức theo phép thử Tukey Giá trị thể bảng là giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn) Bảng 3.5 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên hoạt tính emzyme kháng oxy hóa mơ sẹo rễ bất định Diệp hạ châu đắng sau 2, tuần nuôi cấy Thời gian nuôi cấy tuần tuần tuần G SMG G SMG G SMG Chỉ tiêu theo dõi Mô sẹo Mô sẹo Rễ Mô sẹo Mô sẹo Rễ Mô sẹo Mô sẹo Rễ SOD (U/g) 22,28 51,23 75,79 31,18 60,90 90,42 44,72 71,38 121,39 ± 0,36i ±0,48f ± 0,20c ± 0,52h ± 0,61e ± 0,36b ± 0,71g ±0,83d ±0,41a CAT (U/g) 174,95 181,05 227,70 215,81 222,80 303,70 236,46 243,29 344,79 ± 1,37f ± 0,74f ± 0,70d ± 1,19e ± 1,5de ± 3,18b ± 1,77c ± 1,15c ± 1,21a APX (U/g) 0,28 0,24 0,63 0,35 0,32 0,67 0,43± 0,44 0,95± ±0,012ef ± 0,003f ± 0,023b ±0,015de ± 0,012ef ±0,023b 0,023cd ±0,009c 0,015a Phenolic (mg 50,91 56,47 81,40 71,56 77,19 97,33± 92,31 99,24 126,24 GAE/100 g CK) ± 0,607f ±0,364f ±0,549d ± 0,820e ± 1,025de 0,884bc ±0,787c ±0,549b ±2,728a *Các chữ khác (a, b,…) hàng thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nghiệm thức theo phép thử Tukey Giá trị thể bảng là giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn) 3.6 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên tích lũy hợp chất thứ cấp q trình phát sinh mơ sẹo rễ bất định Diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro Các hợp chất thứ cấp định dược tính Diệp hạ châu đắng rutin, quercetin flavonoid với vai trò biết đến ngăn ngừa tế bào ung thư hypophyllanthin, phyllanthin lignan có chức bảo vệ gan Kết phân tích HPLC cho thấy hàm lượng flanovoid (rutin quercetin), lignan (hypophyllanthin phyllanthin) có khác biệt điều kiện SMG G (Bảng 3.6) 16 Bảng 3.6 Sự tích lũy hợp chất thứ cấp mô sẹo rễ bất định Diệp hạ châu đắng sau tuần nuôi cấy điều kiện SMG Flavonoid Lignan Nghiệm thức (μg/1 g chất tươi) (μg/1 g chất tươi) Rutin Quercetin Hypophyllanthin Phyllanthin G Mô sẹo -** 9,61 17,29 11,53 ± 0,024a ± 0,008b ± 0,005b SMG Mô sẹo 1,79 3,25 29,06 16,01 Rễ ± 0,047a* ± 0,007b ± 0,039a ± 0,041a 1,19 9,54 9,03 - ± 0,007b ± 0,066a ± 0,043c *Các chữ khác (a, b,…) cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nghiệm thức theo phép thử Tukey; ** Không ghi nhận số liệu Giá trị thể bảng là giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn) 3.7 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên chuyển hóa lượng (tinh bột đường) q trình phát sinh SE hoa Thu hải đường nuôi cấy in vitro Trong tháng trình nuôi cấy, tương ứng với giai đoạn cảm ứng SE, thay đổi tinh bột lượng đường điều kiện G SMG ghi lại hiển thị Hình 3.9 Hình 3.9 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên hàm lượng tinh bột đường tổng số giai đoạn cảm ứng SE hoa Thu hải đường nuôi cấy in vitro Kết cho thấy hàm lượng tinh bột tổng nghiệm thức SMG đạt cực đại vào ngày nuôi cấy cuối tháng thứ (Bảng 3.7) SE hình cầu biệt hóa thành hình tim hình ngư lơi Sau đó, hàm lượng tinh bột tổng nghiệm thức SMG giảm sau tháng nuôi cấy trùng với thời điểm trưởng thành SE 17 Bảng 3.7 Ảnh hưởng điều kiện SMG lên hàm lượng tinh bột đường SE hoa Thu hải đường sau 1, 2, tháng nuôi cấy Thời gian tháng tháng tháng tháng nuôi cấy Hàm G SMG G SMG G SMG G SMG lượng Tinh bột 29,37 34,06 38,28 39,91 38,13 35,06 30,02 35,91 (% w/w ± 0,14g* ± 0,44e ± 0,09b ± 0,03a ± 0,06b ± 0,04d ± 0,03f ±0,10c DW) Đường 103,01 88,74 84,67 68,19 124,43 153,61 105,67 150,00 (mg/g ± 0,07e ± 0,34f ± 0,23g ± 0,21h ± 0,65c ± 0,30a ± 0,31d ± 0,36b DW) *Các chữ khác (a, b,…) dòng thể khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nghiệm thức theo phép thử Tukey Giá trị thể bảng là giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn) 3.8 Nghiên cứu ghi nhận sinh trưởng môi trường trọng lực thực chồi Thu hải đường, Dâu tây có nguồn gốc nuôi cấy in vitro điều kiện SMG 3.8.1 Nghiên cứu ghi nhận sinh trưởng môi trường trọng lực thực chồi Thu hải đường có nguồn gốc ni cấy in vitro điều kiện SMG Sau tháng nuôi cấy điều kiện trọng lực thực, mẫu cấy hoa Thu hải đường có nguồn gốc SMG cho tiêu số chồi (136,67 chồi), khối lượng tươi (4774,67 mg), khối lượng khô (423,33 mg) đạt cao nhất; nhiên, chiều cao chồi (1,13 cm), diện tích (0,90 cm2) hàm lượng chlorophyll tổng (38,37 nmol/cm2) đạt giá trị thấp đáng kể so với điều kiện G (Bảng 3.8) Bảng 3.8 Sự sinh trưởng phát triển chồi hoa Thu hải đường có nguồn gốc điều kiện SMG sau tháng nuôi cấy môi trường trọng lực thực Nghiệm Số chồi Chiều cao Số Diện Hàm lượng Khối lượng Khối thức chồi (cm) chlorophyll tươi (mg) lượng khô tích tổng (mg) (cm2) (nmol/cm2 ) G 67,00± 2,00± 3,33± 2,03± 45,40 4007,67± 327,67± 1,15* 0,06 0,33 0,09 ± 0,12 3,84 0,88 SMG 136,67 1,13± 2,33± 0,90± 38,37 4774,67± 423,33± ± 1,20 0,12 0,33 0,56 ± 0,16 13,84 0,88 *Các giá trị bảng thể giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn) theo phép thử Tukey (p < 0,05) Kết cho thấy hoa Thu hải đường có nguồn gốc từ điều kiện SMG có tiêu chiều cao (12,33 cm), số rễ (8,67 cm), chiều dài rễ (5,33 cm), số (6,67), hàm lượng chlorophyll tổng (47,77 18 nmol/cm2) khối lượng tươi (2212,00 mg), khối lượng khô (217,33 mg) cao đáng kể so sánh với điều kiện G (Bảng 3.9) Bảng 3.9 Sự sinh trưởng phát triển hoa Thu hải đường hoàn chỉnh có nguồn gốc điều kiện SMG sau tháng nuôi cấy môi trường trọng lực thực Chiều Hàm lượng Nghiệm Chiều cao Số rễ dài rễ Số chlorophyll Khối lượng Khối lượng thức (cm) tươi (mg) khô (mg) (cm) tổng (nmol/cm2) G 9,00± 0,58* 6,67± 4,33 ± 4,67± 45,43± 2013,00± 203,33± 0,33 0,33 0,33 0,09 1,15 1,45 SMG 12,33± 0,33 8,67± 5,33 ± 6,67± 47,77± 2212,00± 217,33± 0,33 0,33 0,33 0,09 0,58 0,88 *Các giá trị bảng thể giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn) theo phép thử Tukey (p < 0,05) 3.8.2 Nghiên cứu sinh trưởng môi trường trọng lực thực chồi Dâu tây có nguồn gốc ni cấy in vitro điều kiện SMG Sau tuần nuôi cấy, cụm chồi điều kiện SMG ghi nhận tổng số chồi (5,33 chồi), chiều cao chồi (2,90 cm), khối lượng tươi cụm chồi (464 mg) khối lượng khô cụm chồi (35,67 mg) cao so với cụm chồi điều kiện G (Bảng 3.10) Trong giai đoạn rễ in vitro, sinh trưởng tương đồng với giai đoạn nhân nhanh chồi (Bảng 3.11) Bảng 3.10 Sự sinh trưởng trình nhân nhanh chồi Dâu tây có nguồn gốc điều kiện SMG sau tuần nuôi cấy môi trường trọng lực thực Nghiệm Số chồi Chiều cao Khối lượng Khối CAT APX Phenolic thức chồi (cm) tươi (mg) lượng (U/g) (U/g) (mg khô (mg) GAE/100 g chất khô) G 8,33± 0,67 ± 351,33 26,00 167,85 0,13± 195,18 0,33* 0,03 ±5,78 ±0,58 ±0,26 0,00 ±0,26 SMG 7,33 ±0,33 2,90 ± 464,00 35,67±0,6 174,53 0,46± 153,36 0,12 ±6,66 ±0,05 0,02 ±0,26 *Các giá trị bảng thể giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn) theo phép thử Tukey (p < 0,05); ** Không ghi nhận số liệu Bảng 3.11 Sự sinh trưởng phát triển trình tạo rễ in vitro chồi Dâu tây có nguồn gốc điều kiện SMG sau tuần nuôi cấy môi trường trọng lực thực Nghiệm Chiều cao Số Chiều Số rễ Chiều dài Khối lượng Khối thức (cm) rộng rễ (cm) tươi (mg) lượng khô (cm) (mg) G 0,15* 6,23 ± 6,00 ± 0,00 1,10 ± 0,10 7,33 ± 0,67 4,67 ± 0,33 233,33 ± 26,00 ± 17,64 2,08 SMG 8,33 ± 0,33 6,67 ± 1,70 ± 0,10 9,33 ± 4,33 ± 0,33 653,33 ± 65,67± 0,33 0,67 68,88 3,38 *Các giá trị bảng thể giá trị trung bình ± SE (sai số chuẩn) theo phép thử Tukey (p < 0,05);