Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệm

Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệmĐánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ống nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Linh Chi

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA MÔI TRƯỜNG ĐƠN BƯỚC,

ĐA BƯỚC VỚI NỒNG ĐỘ OXY KHÁC NHAU TỚI SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI VÀ PHÁT SINH CHẤT THẢI

TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

Hà Nội, 2024

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Linh Chi

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA MÔI TRƯỜNG ĐƠN BƯỚC,

ĐA BƯỚC VỚI NỒNG ĐỘ OXY KHÁC NHAU TỚI SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI VÀ PHÁT SINH CHẤT THẢI

TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM

Chuyên ngành: Khoa học Môi trường

Mã số: 9440301.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Ngô Thị Tường Châu

2 GS.TS Nguyễn Đình Tảo

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Linh Chi, nghiên cứu sinh trường Đại học Khoa học Tựnhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Khoa học Môi trường (Mã số:9440301.01), xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn củaPGS.TS Ngô Thị Tường Châu và GS.TS Nguyễn Đình Tảo;

2 Công trình nghiên cứu này không trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam;

3 Các số liệu và thông tin nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực, khách quan và đã được cơ sở nơi nghiên cứu xác nhận và chấp thuận.Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết nêu trên

Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2024

Tác giả luận án

NGUYỄN LINH CHI

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Môi trường, Trường ĐHQGHN và Ban Giám đốc Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông đã cho phép

ĐHKHTN-và tạo điều kiện cho tôi thực hiện thành công luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mạnh Khải- Trưởng Khoa Môi trường, Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN, TS Trần Văn Sơn- Trưởng bộ môn Công nghệ Môi trường Cảm ơn các Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Môi trường, Khoa Môi trường đã tạo điều kiện thuận lợi và đóng góp nhiều ý kiến quý giá trong cả chặng đường dài hình thành và triển khai luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Thị Tường Châu, Khoa Môi trường- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, GS.TS Nguyễn Đình Tảo, Nguyên phó giám đốc Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội- HVQY, Giám đốc Trung tâm HTSS Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông, những người thầy trực tiếp, tận tâm hết lòng hướng dẫn, tạo điều kiện và cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thiện luận án này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến tập thể cán bộ, nhân viên Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông đã tạo điều kiện giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập, thu thập số liệu và hoàn thành luận án.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt trong cuộc sống, học tập và công tác.

Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2024

Tác giả luận án

NGUYỄN LINH CH

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC 1

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ 5

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN 9

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN 11

MỞ ĐẦU 12

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16

1.1 Một số khái niệm và thuật ngữ được sử dụng trong luận án 16

1.2 Khái quát sự phát triển của phôi trong môi trường tự nhiên 18

1.3 Thụ tinh trong ống nghiệm và quá trình phát triển của phôi trong thụ tinh ống nghiệm 24

1.3.1 Quy trình thực hiện IVF 24

1.3.2 Hệ thống nuôi phôi trong thụ tinh ống nghiệm 27

1.3.3 Quá trình phát triển của phôi và các chỉ số đánh giá sự phát triển của phôi trong IVF 28

1.3.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển của phôi trong IVF 33

1.3.4.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng 33

1.3.4.2 Điều kiện nuôi phôi 45

1.4 Sơ lược tình hình nghiên cứu sử dụng môi trường đơn bước/đa bước và nồng độ oxy 5%/20% trong IVF trên thế giới và tại Việt Nam

49 1.4.1 Môi trường đơn bước/đa bước 49

1.4.2 Nồng độ oxy 5% và 20% 51

1.5 Sơ lược về vấn đề phát sinh và quản lý chất thải trong IVF 54

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 57

2.1 Đối tượng nghiên cứu 57

2.1.1 Phôi người 57

2.1.2 Chất thải môi trường nuôi phôi trong IVF 57

2.2 Môi trường nuôi, trang thiết bị, địa điểm và thời gian nghiên cứu 58

2.2.1 Các loại môi trường 58

2.2.2 Trang thiết bị nuôi phôi 59

2.2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 60

2.3 Phương pháp nghiên cứu 60

2.3.1 Tính cỡ mẫu cho nghiên cứu 60

2.3.2 Thiết kế nghiên cứu 61

2.3.3 Phương pháp tạo và nuôi phôi trong phòng labo 64

2.3.4 Phương pháp đánh giá phôi 66

2.3.5 Phương pháp thu và phân tích mẫu chất thải môi trường nuôi phôi trong IVF…… 69

2.3.6 Phương pháp thu thập, quản lý, phân tích và xử lý số liệu 70

2.3.7 Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu 72

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 74

3.1 Ảnh hưởng của môi trường đơn bước và đa bước đến sự phát triển của phôi trong IVF 74

3.1.1 Đánh giá đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 75

3.1.1.1 Phân loại vô sinh của bệnh nhân 77

3.1.1.2 Thời gian vô sinh của bệnh nhân 78

3.1.1.3 Đặc điểm dự trữ buồng trứng của bệnh nhân 80

3.1.1.4 Tỷ lệ thụ tinh 81

3.1.2 Số lượng và chất lượng phôi ngày 3 82

3.1.3 Số lượng và chất lượng phôi nang 85

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ oxy 20% và 5% tới sự phát triển của phôi trong IVF 89

3.2.1 Số lượng và chất lượng phôi ngày 3 89

3.2.2 Số lượng và chất lượng phôi nang 93

3.2.3 Tỷ lệ hình thành phôi nang 95

3.3 Đánh giá hiệu quả đồng thời của môi trường đơn bước và đa bước với các nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi trong IVF 96

3.3.1 Tỷ lệ hình thành phôi nang giữa các nhóm nghiên cứu 96

3.3.2 Kết quả sàng lọc PGT phôi nang 103

3.4 Ảnh hưởng của môi trường đơn và đa bước với các nồng độ oxy khác nhau đến sự phát sinh chất thải trong IVF 110

3.4.1 Thành phần của mẫu thải khi sử dụng môi trường đơn bước trong nuôi phôi trong IVF 110

3.4.2 Thành phần của mẫu thải khi sử dụng môi trường đa bước trong nuôi phôi trong IVF 114

3.4.3 Ảnh hưởng của môi trường đơn bước/đa bước đến thành phần của các chất thải môi trường nuôi phôi 118

3.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ oxy (5% và 20%) đến thành phần của các chất

thải môi trường nuôi phôi 121

3.4.5 Ảnh hưởng của môi trường đơn và đa bước với các nồng độ oxy khác nhau đến thành phần chất thải sau IVF 125

3.5 Những hạn chế của luận án 132

KẾT LUẬN 133

KIẾN NGHỊ 135

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 136

TÀI LIỆU THAM KHẢO 137

PHỤ LỤC 137

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Tiếng Việt

AFC Antral Follicle Count Đếm nang noãn thứ cấp:

Tổng số nang noãn kíchthước từ 2 – 10mm (trungbình) đếm được qua siêu âmđường âm đạo ở cả 2 bênbuồng trứng vào ngày 2-3của vòng kinh

AMH Anti-Mullerian Hormone Hormon kháng ống cận trung

thận, được sản xuất bởi các

tế bào hạt của nang buồngtrứng, cho biết số nang noãnnon hiện có trong buồngtrứng của người phụ nữ

DNA Deoxyribonucleic Axit Vật liệu di truyền của tế bào,

lưu trữ trong các nhiễm sắcthể ở nhân tế bào và ty thể.Ngoại trừ một số tế bào (tinhtrùng, tế bào trứng và hồngcầu), nhân tế bào chứa 23cặp nhiễm sắc thể Mộtnhiễm sắc thể chứa rất nhiềugen

EdB Expanded Blastocyst Phôi nang đã dãn rộng hoàn

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Tiếng Việt

toàn

acid

Axit etylendiamintetraaxetic [CH N(CH CO H) ]₂N(CH₂CO₂H)₂]₂ ₂N(CH₂CO₂H)₂]₂ ₂N(CH₂CO₂H)₂]₂ ₂N(CH₂CO₂H)₂]₂ ₂N(CH₂CO₂H)₂]₂

EEB Early Expanding Blastocyst Phôi nang đang dãn rộngEIA Enzyme Immunoassay Loại xét nghiệm được tiến

hành dựa vào ứng dụng tínhđặc hiệu của các kháng thể

và độ nhạy của các xétnghiệm enzyme Dựa vào xétnghiệm phân tích hóa sinh,các bác sĩ có thể phát hiện vàđịnh lượng được các phân tửkháng thể, protein, peptide,hormone

eSET elective Single Embryo

Hiệp hội sinh sản và phôi học người của Châu Âu

colony- stimulating factor

Nhân tố kích thích hoạt hóabạch cầu đa nhân trung tính-đại thực bào

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Tiếng Việt

ICSI Intra-Cytoplasmic Sperm

là 7,20, MOPS là chất đệmcho nhiều hệ thống sinh học

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-

piperazineethanesulfonic

Là hệ đệm được sử dụngrộng rãi trong nuôi cấy tếbào, chủ yếu là duy trì độ pHsinh lý tốt khi thay đổi về

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Tiếng Việt

nồng độ carbon dioxide,dung dịch chứa HEPES cần

sử dụng trong bóng để ngănchặn quá trình oxy hóa.HSA Human Serum Albumin Albumin huyết thanh người

được sản xuất trong tế bàogan người và là thành phầnprotein chiếm ưu thế nhấttrong máu, chiếm khoảng50% tổng số protein huyếtthanh

PGT Preimplantation Genetic

Testing for aneuploidy

Xét nghiệm sàng lọc ditruyền tiền làm tổ nhằm pháthiện các bất thường lệch bộinhiễm sắc thể của phôi

VINAGOFPA Vietnam Gynaecology and

Obstetrics Association

Hội Phụ sản khoa và sinh đẻ

có kế hoạch của Việt nam

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN

Bảng 1.1 Thành phần chính của một số môi trường nuôi phôi 34

Bảng 1.2 Nồng độ các chất dinh dưỡng trong vòi trứng và tử cung 37

Bảng 1.3 Tỷ lệ phôi phát triển lên ngày 3 khi nuôi phôi 52

Bảng 1.4 Tỷ lệ phôi phát triển lên ngày 5 khi nuôi phôi ở 53

Bảng 2.1 Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi ngày 3 67

Bảng 2.2 Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi nang (phôi ngày 5) 68

Bảng 2.3 Phân loại phôi nang theo Gardner (1999) 69

Bảng 3.1 Loại vô sinh của các bệnh nhân ở 4 nhóm nghiên cứu 78

Bảng 3.2 Thời gian vô sinh của các bệnh nhân ở bốn nhóm nghiên cứu 78

Bảng 3.3 Đặc điểm dự trữ buồng trứng của các bệnh nhân 4 nhóm 80

Bảng 3.4 Đặc điểm kích thích buồng trứng của các bệnh nhân 81

Bảng 3.5 Tỷ lệ (%) các loại phôi ngày 3 ở các nhóm nghiên cứu nuôi ở môi trường đơn bước và đa bước 82

Bảng 3.6 Số lượng và chất lượng phôi ngày 3 của các nhóm nghiên cứu được nuôi ở môi trường đơn bước và đa bước 84

Bảng 3.7 Số lượng và chất lượng phôi nang của các nhóm nghiên cứu nuôi ở môi trường đơn bước và đa bước 85

Bảng 3.8 Tỷ lệ hình thành phôi nang của các nhóm nghiên cứu nuôi ở môi trường đơn bước và đa bước 87

Bảng 3.9 Số lượng và chất lượng phôi ngày 3 của các nhóm nghiên cứu nuôi ở nồng độ oxy 5% và 20% 90

Bảng 3.10 Tỷ lệ (%) các loại phôi ngày 3 của các nhóm nghiên cứu nuôi ở nồng độ oxy 5% và 20% 91

Bảng 3.11 Số lượng và chất lượng phôi nang của các nhóm nghiên cứu nuôi ở nồng độ oxy 5% và 20% 93

Bảng 3.12 Tỷ lệ hình thành phôi nang của các nhóm nghiên cứu nuôi ở nồng

độ oxy 5% và 20% 95

Bảng 3.13 Tỷ lệ hình thành phôi nang giữa 4 nhóm nghiên cứu 97

Bảng 3.14 Kết quả sàng lọc PGT phôi nang 104

Bảng 3.15 So sánh sự bất thường nhiễm sắc thể giữa các cặp nhóm 106

Bảng 3.16 Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi ngày 3 khi sử dụng môi trường đơn bước 110

Bảng 3.17 Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi nang khi sử dụng môi trường đơn bước 112

Bảng 3.18 Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi ngày 3 khi sử dụng môi trường đa bước 114

Bảng 3.19 Thành phần của mẫu thải ra sau nuôi phôi nang khi sử dụng môi trường đa bước 116

Bảng 3.20 Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 3 ngày của 118

Bảng 3.21 Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 5 ngày của 120

Bảng 3.22 Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 3 ngày của các nhóm nghiên cứu nuôi ở cùng môi trường nuôi 122

Bảng 3.23 Thành phần của các chất thải sau nuôi phôi 5 ngày của các nhóm nghiên cứu 123

Bảng 3.24 : So sánh thành phần các mẫu chất thải sau nuôi phôi 3 ngày 125

Bảng 3.25 So sánh thành phần của các mẫu chất thải 127

Bảng 3.26: Sự khác nhau giữa hướng dẫn phân loại chất thải y tế theo thông tư 20/2021/TT-BYT và thông tư liên tịch 58/2015/TTLT-BYT-BTNMT 129

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN

Hình 1.1 Sự phân chia của phôi trong 3 ngày đầu sau thụ tinh 21

Hình 1.2 Phôi nang (hình chụp tại TTHTSS 16A) 22

Hình 1.3 Sơ đồ sự phát triển của phôi tiền làm tổ 23

Hình 1.4 Hệ thống nuôi phôi trong phòng Labo 27

Hình 1.5 Quan điểm về phân loại phôi 31

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 63

Hình 3.1 Hình ảnh phôi ngày 3 ở các nhóm nghiên cứu 83

Hình 3.2 Hình ảnh phôi nang) của các nhóm nghiên cứu 92

Hình 3.3 Biểu đồ Histogram về tỷ lệ phôi tốt và trung bình của phôi nang ngày 5 (bước rộng là 10%) 99

Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện số lượng phôi trung bình của mỗi chu kỳ trong các giai đoạn phôi phát triển 100

Hình 3.5 Tỷ lệ loại phôi ngày 3 và ngày 5 của nhóm nghiên cứu I và II 101

Hình 3.6 Tỷ lệ loại phôi ngày 3 và ngày 5 của nhóm nghiên cứu III và IV 102

Hình 3.7 Biểu đồ Histogram về phân bố tỷ lệ phôi bất thường ở 4 nhóm 105

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của nghiên cứu

Theo báo cáo mới nhất của Tổ chức Y tế thế giới WHO năm 2023, trênthế giới cứ 6 người trưởng thành có 1 người vô sinh Tại Việt Nam, cókhoảng 7,7% cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vô sinh, hiếm muộn và tỷ

lệ này đang tiếp tục gia tăng, do đó các nghiên cứu khoa học trong hỗ trợ sinhsản cần được đẩy mạnh Thực chất, để đạt được một chu kỳ thành công trong

kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố,trong đó môi trường nuôi phôi và nồng độ oxy là 2 yếu tố ảnh hưởng trực tiếpđến sự phát triển của phôi và đang gây nhiều tranh luận [10, 15, 36, 50, 88,89]

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy, với các điều kiện nuôi phôi khác nhau,đều có thể mang đến thành công trong nuôi phôi ở môi trường nhân tạo, tuynhiên có sự khác nhau về tỷ lệ thành công theo từng giai đoạn phát triển phôi.Một số nghiên cứu này sử dụng số lượng mẫu không quá lớn (dưới 1000mẫu), các nghiên cứu không sử dụng cùng một loại điều kiện để so sánh,không sử dụng cùng hệ thống nuôi và ở các quốc gia khác nhau, vì vậy cáckết quả nghiên cứu đạt được chỉ mang tính chất tham khảo Điều cần thiết làphải có thêm các nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ hơn vấn đề này, đặc biệt lànghiên cứu một cách hệ thống và tổng thể đánh giá kết hợp các điều kiện khácnhau (về môi trường đơn bước/đa bước và nồng độ oxy 5%/20%) đến sự pháttriển phôi trong IVF

Hiện nay, phân loại chất thải đã trở thành một nội dung trọng tâm trongcông tác quản lý chất thải y tế, tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại chưa cónghiên cứu nào về thành phần, tính chất của chất thải được phát sinh trongquá trình thực hiện IVF Việc phân loại đúng chất thải sẽ góp phần giảm thiểu

nguy cơ phát tán vi sinh vật gây bệnh hoặc các tác nhân có độc tính Đồngthời, kết quả nghiên cứu chất thải cũng giúp cho các TTHTSS có phương ánthu gom, vận chuyển và xử lý chất thải sau IVF một cách phù hợp, tuân thủquy định về quản lý chất thải y tế do Bộ Y tế ban hành, cũng như hạn chế tối

đa kinh phí phải chi trả cho các hoạt động này Trên cơ sở đó NCS triển khai

đề tài “Đánh giá hiệu quả của môi trường đơn bước, đa bước với nồng độ oxykhác nhau tới sự phát triển của phôi và phát sinh chất thải trong thụ tinh ốngnghiệm” với các mục tiêu sau:

2 Mục tiêu của luận án

- Mục tiêu tổng quát: Lựa chọn được điều kiện môi trường tối ưu cho sự pháttriển của phôi đồng thời giảm thiểu ảnh hưởng (nếu có) của việc xả chất thảisau khi thực hiện kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

(iv) Đánh giá được ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi với nồng độ oxykhác nhau đến sự phát sinh chất thải trong IVF

3 Nội dung nghiên cứu của luận án

(i) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi (đơn bước và đabước) tới các giai đoạn phát triển của phôi trong IVF

(ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy (5% và 20%) tới sự pháttriển của phôi trong IVF

(iii) Nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của môi trường đơn bước và đabước với các nồng độ oxy khác nhau tới sự phát triển của phôi trongIVF

(iv) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đơn bước và đa bước với cácnồng độ oxy khác nhau đến sự phát sinh chất thải trong IVF

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

- Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án góp phần bổ sung cơ

sở dữ liệu và bằng chứng khoa học về hiệu quả của việc sử dụng các loại môitrường nuôi phôi (đơn bước và đa bước), các nồng độ oxy khác nhau (5% và20%) của tủ nuôi phôi, cũng như hiệu quả đồng thời của việc kết hợp môitrường nuôi (đơn bước và đa bước) với các nồng độ oxy khác nhau tới sự pháttriển của phôi trong IVF Bên cạnh đó, luận án cũng góp phần cung cấp thôngtin ban đầu về đặc điểm của chất thải phát sinh trong quá trình thực hiện IVF

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án góp phần định hướnglựa chọn điều kiện nuôi phôi tối ưu cho từng giai đoạn phát triển của phôi,nhằm cải thiện tỷ lệ thành công trong một chu kỳ IVF Đồng thời, luận án cóthể được sử dụng làm tài liệu tham khảo có giá trị cho các TTHTSS, các công

ty sản xuất môi trường nuôi phôi và hệ thống tủ nuôi phôi trong việc lựachọn và đổi mới, nâng cao sản phẩm chuyên biệt trong việc nuôi phôi lên giaiđoạn phôi nang Ngoài ra, dựa vào kết quả phân tích đặc điểm của chất thảiphát sinh trong IVF, các TTHTSS có thể đề xuất thay đổi phương pháp thugom, lưu giữ, vận chuyển chất thải hiện đang được áp dụng, phù hợp với Quyđịnh về quản lý chất thải y tế trong phạm vi khuôn viên cơ sở y tế do Bộ Y tếmới ban hành (Thông tư số 20/2021/TT-BYT) và hạn chế tối đa kinh phí phảitrả cho các hoạt động này

5 Những đóng góp mới của luận án

(i) Là công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam đánh giá được hiệu quả đồngthời của 2 yếu tố: môi trường nuôi phôi (đơn bước và đa bước) và nồng

độ oxy trong tủ nuôi phôi (5% và 20%), từ đó đã lựa chọn được điềukiện nuôi phôi tối ưu cho sự phát triển của phôi

(ii) Là một trong những công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam đánh giáđược sự phát sinh chất thải trong IVF, đồng thời cung cấp cơ sở khoahọc cho việc phân loại, thu gom chất thải sau IVF tại các TTHTSS

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số khái niệm và thuật ngữ được sử dụng trong luận án

- Vô sinh: theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), vô sinh là tình trạng một cặp

vợ chồng không có thai sau một năm chung sống, giao hợp bình thường,không sử dụng các biện pháp tránh thai Đối với những trường hợp tuổi vợtrên 35 thì thời gian này chỉ khoảng 6 tháng đã được đánh giá là vô sinh

Vô sinh có thể được phân thành hai loại: vô sinh nguyên phát và vô sinhthứ phát [109]

- Môi trường đơn bước: chỉ sử dụng một loại môi trường nuôi phôi trongsuốt quá trình phát triển của phôi

- Môi trường đa bước: thay đổi môi trường nuôi ở ngày 3 trong quá trìnhphát triển của phôi

- Nang noãn: ngay từ khi mới sinh ra, trong buồng trứng bình thường của các

bé gái đã có khoảng 1-2 triệu nang noãn nguyên thủy Nang noãn trải qualần lượt các giai đoạn: sơ cấp, thứ cấp và giai đoạn trưởng thành sẽ giảiphóng noãn bào (phóng noãn) [14]

- Kích thích buồng trứng (kích trứng): là phương pháp sử dụng các loại thuốcnội tiết, có thể ở dạng uống hoặc tiêm, nhằm kích thích những nang noãntại buồng trứng phát triển Sau khi nang đạt đủ kích thước, bệnh nhân sẽđược tiêm thuốc gây phóng noãn [40]

- Chu kỳ IVF: bao gồm các giai đoạn: chuẩn bị, kích trứng, theo dõi nangnoãn, chọc hút trứng, thụ tinh, chuyển phôi, bổ sung nội tiết tố, thử thai vàtheo dõi

- Thụ tinh: là một quá trình trong đó phôi thai được hình thành từ sự hợpnhất giữa giao tử đực (tinh trùng) và giao tử cái (noãn) [16]

- Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF): cho tinh trùng thụ tinh với noãn và nuôithành phôi trong ống nghiệm, sau đó một số phôi sẽ được chuyển trở lạivào tử cung.

- Phôi dâu: là giai đoạn phôi chứa 16-32 tế bào liên kết với nhau thành khốigiống quả dâu, thường là giai đoạn phôi khoảng ngày 3 đến ngày 4

- Phôi nang: là phôi có chứa khối tế bào bên trong (ICM), sau đó tạo thànhphôi thai, thường là giai đoạn phôi nang đến ngày 5 (hoặc ngày 6)

- Phương pháp bơi lên (swim-up): được xây dựng dựa vào nguyên tắc tinhtrùng di động tốt có khả năng di chuyển ra khỏi tinh dịch vào môi trườngnuôi cấy, vì vậy giúp thu được tinh trùng có độ di động cao, loại bỏ đượctinh trùng chết và tinh trùng bất động

- Phương pháp ICSI: là kỹ thuật dùng hệ thống vi thao tác xử lý tiêm tinhtrùng vào bào tương noãn Đây là kỹ thuật cao nhằm hỗ trợ thụ tinh, tăngkhả năng thụ tinh giữa noãn và tinh trùng [16]

- Phương pháp IVF cổ điển: sau khi swim-up trong tủ nuôi CO2 ở nhiệt độ

370C trong khoảng 30 phút, tinh trùng thu được từ nước nổi lên sẽ đượcnuôi với noãn ở phòng labo Mật độ khoảng 100-150 ngàn tinh trùng/2noãn/ một giếng môi trường nuôi [16]

- Biểu đồ Histogram: dữ liệu được biểu thị bằng các cột trên biểu đồ có độcao khác nhau tùy thuộc vào tần suất phạm vi dữ liệu cụ thể xảy ra

- Chất thải nguy hại: bao gồm chất thải lây nhiễm và chất thải nguy hạikhông lây nhiễm (thông tư 20/2021/TT-BYT) [6]

- Chất thải lây nhiễm: bao gồm chất thải lây nhiễm sắc nhọn (kim tiêm, đầusắc nhọn, dao mổ ), chất thải lây nhiễm không sắc nhọn (bông, băng,gạc ) và chất thải có nguy cơ lây nhiễm cao (mẫu bệnh phẩm, dụng cụđựng dính mẫu bệnh phẩm ) (Thông tư 20/2021/TT-BYT) [6]

- Chất thải trong quá trình IVF: bao gồm 2 phần là chất thải lỏng (môi trườngnuôi phôi) và chất thải rắn là vật tư tiêu hao trong Labo (Đĩa 5 giếng, đĩa 4giếng, pippet, đầu côn….)

- Luật bảo vệ môi trường: Luật bảo vệ môi trường là một lĩnh vực pháp luậtgồm tổng hợp các quy phạm pháp luật điều chỉnh các quan hệ xã hội phátsinh trực tiếp trong hoạt động khai thác, quản lý và bảo vệ môi trường

- Phôi bất thường: một tế bào bình thường phải có đủ tổng 46 nhiễm sắc thểnằm trong 23 cặp nhiễm sắc thể, mọi sự sai lệch với trạng thái nhiễm sắcthể này được coi là bất thường về di truyền

- Sàng lọc di truyền phôi: Xét nghiệm sàng lọc di truyền trước chuyển phôi

là xét nghiệm di truyền học được thực hiện trên 3 – 5 tế bào của phôi ngày

5, với mục đích xác định các bất thường về di truyền ở mức độ nhiễm sắcthể, từ đó giúp các chuyên gia lựa chọn phôi có bộ nhiễm sắc thể bìnhthường trước khi tiến hành chuyển phôi

1.2 Khái quát sự phát triển của phôi trong môi trường tự nhiên

Sự hình thành và phát triển của phôi trong tự nhiên được diễn ra nhờcác hormone và các cơ quan bên trong của người phụ nữ Đầu tiên trứng đượcthụ tinh tại vị trí 1/3 ngoài vòi trứng, sau đó hợp tử và phôi được hình thành dichuyển dần xuống và làm tổ trong buồng tử cung Mỗi giai đoạn phát triểnkhác nhau, phôi sẽ được tiếp xúc với hệ môi trường khác nhau (dịch vòitrứng, dịch tử cung) [14]

a) Giai đoạn thụ tinh:

Quá trình thụ tinh bao gồm 4 giai đoạn: (i) chọn tinh trùng cho thụ tinh,(ii) tinh trùng xâm nhập vào noãn, (iii) hòa màng tế bào tinh trùng với tế bàonoãn, và (iv) sát nhập hai tiền nhân đực và cái để tạo nên bộ nhiễm sắc thểlưỡng bội mới của phôi Với cấu trúc của noãn sau phóng noãn, muốn lọt vàobào tương của noãn để kết hợp với noãn tạo ra hợp tử, tinh trùng phải lần lượt

vượt qua 3 chướng ngại vật, từ ngoài vào trong gồm: các lớp tế bào hạt, màngtrong suốt, và màng bào tương của noãn [42].

Chất lượng tinh trùng và chất lượng noãn bình thường là điều kiện tiênquyết để đảm bảo sự thụ tinh Có rất nhiều loại noãn bất thường: bất thườngcấu trúc màng trong suốt làm cho tinh trùng bình thường không thể xâm nhập;bất thường trong bào tương noãn: bào tương chưa trưởng thành, bào tương cókhông bào, lưới nội bào hoặc mật độ hạt cao đều là những nguyên nhân ảnhhưởng đến thụ tinh [8] Tương tự như vậy, tinh trùng dị dạng hoặc khả năngtiến tới của tinh trùng cũng hạn chế hoặc làm tinh trùng không có khả năngthụ tinh tự nhiên với noãn

- Những yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng noãn và tinh trùng:

+ Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng noãn: tuổi mẹ, bất thường về ditruyền, suy tuyến yên, suy buồng trứng, buồng trứng đa nang

+ Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng tinh trùng: (i) suy dinh dưỡng, (ii)nghề nghiệp: làm việc trong môi trường nhiệt độ cao kéo dài làm nhiệt độ bìutăng, thường dẫn tới giảm sinh tinh, tinh trùng thoái hóa nhiều; làm việc tiếpxúc với hóa chất, tia xạ (iii) các bệnh lý của tinh hoàn: viêm, ứ nước, chấnthương (iv) chế độ sinh hoạt: uống rượu bia nhiều, hút thuốc lá nhiều, sinhhoạt tình dục quá nhiều, căng thẳng kéo dài (v) các bệnh lý ảnh hưởng đếntinh hoàn: suy tuyến yên, suy thận mạn, ung thư điều trị tia xạ và (vi) một sốloại thuốc: Depo-provera, Adjudin và Gossypol là các thuốc đình sản nam,các thuốc nội tiết như corticoid hoặc androgens nếu điều trị với liều cao vàthời gian kéo dài có thể ức chế tuyến yên dẫn tới ức chế quá trình sinh tinh vàgây teo tinh hoàn [20]

- Điều kiện cho noãn và tinh trùng gặp nhau để thụ tinh [22]:

+ Các yếu tố tác động đến quá trình di chuyển là dịch ổ bụng, hoạtđộng cơ trơn của ống dẫn trứng và hoạt động của nhung mao ống dẫn trứng

Vòi trứng thông, loa vòi đón được noãn rụng Nhu động vòi trứng sẽ đưanoãn đến 1/3 ngoài vòi trứng để thụ tinh

+ Tinh trùng được xuất tinh trong âm đạo có khả năng ly giải bìnhthường, khả năng tiến tới tốt, vượt qua được chất nhầy cổ tử cung, tiến vàobuồng tử cung để tới 1/3 ngoài của vòi trứng

- Điều kiện thời gian: ở mọi loài động vật, noãn và tinh trùng nói chung

có đời sống rất ngắn Ở người, trong đường sinh dục nữ, tinh trùng có khảnăng sống và duy trì chức năng thụ tinh trong vòng 3–4 ngày Nếu không gặpnoãn, tinh trùng sẽ tự thoái hóa Noãn khi vào vòi trứng thường có khả năngthụ tinh trong vòng 24 giờ Nếu không gặp tinh trùng, noãn sẽ tự thoái hóa

- Số lượng tinh trùng trong mỗi lần giao hợp, tinh dịch chứa:

+ Bình thường: tinh dịch trong một lần xuất tinh có thể tích > 1,4 ml,mật độ tinh trùng > 16 triệu/ml, tổng số lượng tinh trùng trong tinh dịch > 39triệu, tỷ lệ tinh trùng di động > 42%, tỷ lệ tinh trùng hình dạng bình thường >4% (WHO, 2021) [103]

+ Tinh dịch không đạt tiêu chuẩn như trên khó có khả năng thụ tinh tựnhiên và cần phải có sự giúp đỡ của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

b) Giai đoạn phôi phân chia:

Khi hợp tử phân chia thành 2 phôi bào vào khoảng 23–26 giờ sau thụtinh, phôi tiến hành hàng loạt quá trình nguyên phân nối tiếp nhau liên tục làmcho số lượng phôi bào tăng lên nhanh chóng (chỉ có nhân đôi rồi phân chianhiễm sắc thể và phân cắt mà không có sự lớn lên) Qua mỗi lần nguyên phân,kích thước mỗi phôi bào sinh ra trở nên nhỏ hơn Vào ngày thứ 2, phôi phânchia thường có khoảng 3, 4 hoặc 5 phôi bào, ngày thứ 3 có khoảng 6–8 phôibào (Hình 1.1) Các phôi bào trong những lần phân chia đầu tiên (phân chia2–4–8 phôi bào) có tính toàn năng, ít có sự khác biệt về hình dạng, hoạt độngsinh học và khả năng phát triển Càng về sau, sự biệt hóa giữa các phôi bào

ngày càng tăng lên Mỗi phôi bào sẽ thiết lập chương trình phát triển để biệthóa các dòng phôi bào đặc hiệu Các phôi bào được tổ chức theo nhóm, mỗinhóm có tốc độ phân cắt riêng để làm cơ sở cho sự hình thành các cơ quansau này Vào khoảng cuối ngày thứ 3 hoặc đầu ngày thứ 4 sau thụ tinh, phôiphân chia 12–32 phôi bào, gọi là phôi dâu Cấu tạo của phôi dâu đã có sự biệthóa phôi bào gồm: một nhóm phôi bào nằm ở vị trí trung tâm có kích thướclớn hơn gọi là đại phôi bào, còn những phôi bào tạo thành một lớp bao quanhphía ngoài có kích thước nhỏ hơn gọi là tiểu phôi bào Những đại phôi bàosau này sẽ tạo phôi và một số bộ phận phụ của phôi như màng ối, túi noãnhoàng, niệu nang Tiểu phôi bào sẽ tạo lá nuôi, sau này sẽ phát triển thành rauthai và màng bọc thai [18, 21].

Hình 1.1 Sự phân chia của phôi trong 3 ngày đầu sau thụ tinh [85]

Sự phân chia phôi xảy ra trong quá trình phôi di chuyển từ vòi trứngđến tử cung Các tế bào hạt vây quanh noãn bị thoái hóa dần dần, màng trongsuốt vẫn tồn tại trong thời gian phân chia phôi đến khi phôi thoát màng rồicuối cùng biến mất

Vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh, phôi dâu đã lọt vào khoang tửcung và bị vùi trong chất dịch do niêm mạc tử cung tiết ra Chất dịch thấmqua màng trong suốt vào các khoang gian bào của đại phôi bào để nuôi phôi

Dần dần các khoang gian bào hợp lại và cuối cùng tạo thành một khoang xengiữa lớp tiểu phôi bào và khối đại phôi bào, khoang này dần dần lớn lên vàgọi là khoang phôi nang hay khoang dưới mầm vì mầm phôi được tạo ra nằmphía trên nó Khối tế bào trung tâm của phôi dâu (các đại phôi bào) bị khoangphôi nang đẩy dần về một cực của phôi và lồi vào khoang dưới mầm được gọi

là cúc phôi (hay còn gọi là nụ phôi hoặc khối tế bào nội phôi- ICM) Cúc phôichính là mầm của phôi và cực đó gọi là cực phôi Còn cực đối lập gọi là cựcđối phôi Nếu ICM phân chia sớm ở giai đoạn này thì sẽ tạo nên thai đôi Tiểuphôi bào của lớp ngoại vi của phôi dâu dẹt lại tạo nên thành của khoang phôinang, phôi ở giai đoạn này giống như một cái túi nên gọi là phôi nang và giaiđoạn phát triển này của phôi gọi là giai đoạn phôi nang [14, 40]

Hình 1.2 Phôi nang (hình chụp tại TTHTSS 16A, độ phóng đại ×400)

c) Sự làm tổ của phôi

Phôi vào khoang tử cung vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh, khi đóphôi ở giai đoạn cuối phôi dâu hoặc đầu phôi nang Niêm mạc tử cung sẽcung cấp cho phôi nguồn dinh dưỡng như oxy và các chất chuyển hóa

Khi phôi vào đến khoang tử cung, phôi vẫn tiếp tục phân chia trongmôi trường dịch tiết của niêm mạc tử cung vài ngày trước khi làm tổ Đếnthời điểm làm tổ, màng nuôi (TE) sẽ tiết ra men tiêu protein làm thủng và tiêudần màng trong suốt, nhờ vậy mà phôi có thể “thoát màng” Môi trường niêmmạc tử cung cũng có men tiêu protein như trên, nhưng cơ chế để giúp phôithoát màng của niêm mạc tử cung vẫn chưa rõ ràng Sau khi thoát màng, phôi

tự vùi mình vào niêm mạc tử cung rồi bám vào đó để phát triển, được nói làphôi làm tổ trong niêm mạc tử cung Phôi làm tổ vào khoảng ngày thứ 6 sauthụ tinh, tương ứng với “cửa sổ làm tổ” của niêm mạc tử cung vào khoảngngày thứ 18 đến ngày thứ 21 của chu kỳ kinh

Hình 1.3 Sơ đồ sự phát triển của phôi tiền làm tổ [14]

Lúc bấy giờ phôi đang ở giai đoạn phôi nang và niêm mạc tử cung đang

ở giai đoạn trước kinh và sẽ tiếp tục phát triển Ở cực phôi, lá nuôi được tạo ra

từ các tiểu phôi bào sẽ bám vào niêm mạc tử cung, vượt qua lớp biểu mô tửcung tiến vào lớp đệm, phá hủy mô tử cung xung quanh để toàn bộ phôi tự vùimình dần vào niêm mạc tử cung Sự phá hủy mô tử cung là do những enzymetiêu protein được tiết ra bởi những tế bào lá nuôi [100]

1.3 Thụ tinh trong ống nghiệm và quá trình phát triển của phôi trong thụ tinh ống nghiệm

1.3.1 Quy trình thực hiện IVF

Quy trình bao gồm kích thích nang noãn, chọc hút noãn, cho tinh trùngthụ tinh với noãn và nuôi thành phôi Sau đó, một số phôi sẽ được chuyển trởlại vào buồng tử cung Quá trình phát triển của phôi và thai sẽ diễn ra hoàntoàn bình thường trong tử cung người mẹ Kỹ thuật này được thực hiện thànhcông trên thế giới lần đầu tiên năm 1978 và thành công lần đầu tiên ở Việtnam năm 1998 [16]

a) Kích thích nang noãn

Mục đích của kích thích nang noãn trong kỹ thuật hỗ trợ sinh sản là cónhiều noãn phát triển và trưởng thành Ưu điểm của kích thích nang noãn làtạo ra nhiều noãn để có nhiều phôi; khi có nhiều phôi có thể dễ chọn lựa đượcmột số phôi tốt nhất cho chuyển phôi Nếu chuyển nhiều hơn một phôi thì tỷ

lệ thành công của kỹ thuật IVF có thể cao hơn Một ưu điểm khác là bác sỹlâm sàng có thể kiểm soát được cả chu kỳ, các trung tâm có thể chọn giờ vàngày lấy noãn Tuy nhiên kích thích nang noãn cũng có những nhược điểm.Các nang noãn trong buồng trứng kích thích có thể trưởng thành không đồngđều, làm chất lượng noãn thu được có thể không bằng noãn của các chu kỳ tựnhiên [16]

b) Chọc hút noãn

Bệnh nhân được gây mê và tiêm thuốc giảm đau Chọc hút noãn đượcthực hiện dưới hướng dẫn của siêu âm đầu dò âm đạo Một cây kim chọc hútdài sẽ được đưa vào âm đạo, đâm xuyên qua cùng đồ để đi đến 2 buồng trứng

và chọc hút các nang noãn bằng máy hoặc bằng tay Dịch chọc hút sẽ đượcsoi dưới kính hiển vi soi nổi để tìm noãn Noãn thu được sẽ ủ ấm trong tủ

CO2, 370C khoảng 3–6 giờ trước khi được cấy với tinh trùng hoặc cho thụtinh bằng kỹ thuật ICSI [16]

c) Chuẩn bị tinh trùng

Lấy tinh dịch người chồng bằng cách thủ dâm hoặc sử dụng bao cao suchuyên dụng Tinh dịch sẽ được đánh giá để có kỹ thuật lọc rửa chuẩn bị tinhtrùng thích hợp Kỹ thuật lọc rửa tinh trùng trong labo IVF thường được ápdụng hiện nay là lọc bằng phương pháp “thang nồng độ” (gradient) và quay lytâm để thu được cặn gồm các tinh trùng có chất lượng tốt và sạch nhất, cặnbẩn, tinh trùng chết và lớp tinh tương sẽ được các lớp thang nồng độ giữ lại.Sau đó, lớp cặn thu được sẽ được rửa lại bằng môi trường rửa chuyên biệt đểloại bỏ môi trường thang nồng độ do có ảnh hưởng không tốt đến tinh trùng

và noãn Nếu tinh trùng có chất lượng tốt, có nhiều tinh trùng tiến tới nhanhđạt tiêu chuẩn của WHO (2021) [103], cặn ly tâm sau rửa tinh trùng sẽ được

áp dụng kỹ thuật “bơi lên” (swim-up) Các trường hợp tinh trùng ít, yếu hoặchai vợ chồng vô sinh không rõ nguyên nhân sẽ được chỉ định làm ICSI (tiêmtinh trùng vào bào tương noãn) Một số trường hợp khi xuất tinh không cótinh trùng thì có thể sử dụng các phương pháp thu tinh trùng từ tinh hoàn haymào tinh [13, 93] Chuẩn bị tinh trùng cho các mẫu tinh trùng ít và yếu này cóthể có nhiều cách khác nhau tùy trung tâm

d) Tạo phôi và nuôi phôi

Sau khi chọn lọc được tinh trùng tốt, tinh trùng sẽ được tiêm vào bàotương noãn để tạo thành phôi, sự phát triển của phôi trong IVF tương tự với

sự phát triển của phôi trong tự nhiên (trong tử cung người mẹ) Sáng ngàyhôm sau ngày chọc hút noãn (ngày 1), đánh giá thụ tinh được tiến hành 18–20h sau cấy với tinh trùng trong kỹ thuật IVF cổ điển, 14–16h sau tiêm tinhtrùng vào bào tương noãn Đánh giá thụ tinh bình thường khi thấy hai tiềnnhân Trong trường hợp đa thụ tinh (thụ tinh bất thường) sẽ thấy ba đến bốntiền nhân (do có hơn một tinh trùng xâm nhập vào noãn) Noãn thụ tinh bấtthường cần phải được loại bỏ vì chuyển phôi thụ tinh bất thường sẽ gây chửatrứng hoặc sảy thai.

Hiện nay, các TTHTSS luôn cố gắng nuôi phôi lên phôi nang trước khichuyển phôi vào người mẹ vì nhiều lợi ích mà phôi nang mang lại Theo Deng(2020) nuôi phôi đến giai đoạn phôi nang sẽ gần với sinh lý tự nhiên, hơn khichuyển phôi vào tử cung mẹ, giúp cải thiện tỷ lệ có thai [35] Ngoài ra, chỉnhững phôi khỏe mới sống sót và phát triển đến giai đoạn phôi nang khi nuôitrong ống nghiệm, và do đó giúp lựa chọn được phôi tốt để chuyển phôi, làmtăng khả năng có thai Theo Mangalraj (2009), chuyển phôi ở giai đoạn phôinang làm tăng tỷ lệ làm tổ và tỷ lệ có thai [69] Trên thực tế, nhiều nghiên cứunhận thấy chỉ có 1/3 số phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang Người ta chorằng, ở giai đoạn phân chia sớm, sự phát triển của phôi từ chỗ dựa vào hoạtđộng di truyền của noãn chuyển sang của chính bản thân phôi Giai đoạnchuyển tiếp này hay còn gọi giai đoạn “embryo block” do nhiều phôi ngừngphát triển ở thời điểm này, hay nói cách khác phôi có khả năng phát triển vàlàm tổ tốt hơn khi vượt qua được giai đoạn “ block” này

Do chất lượng phôi tốt hơn, tỷ lệ làm tổ cao hơn nên chuyển phôi ở giaiđoạn phôi nang có thể hạn chế số lượng phôi chuyển Nhờ vậy, nguy cơ đathai cũng được giảm thiểu [69] Đa thai là một rủi ro của y học, ảnh hưởnglớn đến tài chính và tinh thần của bệnh nhân khi giải quyết đa thai Nếu kỹthuật giảm thiểu thai không tốt, bệnh nhân có thể bị sảy thai hoặc con sinh ra

khả năng dị tật sẽ cao hơn Nếu không giảm thiểu được (ở một số nước trênthế giới pháp luật cấm giảm thiểu thai), khả năng sinh con thiếu tháng và pháttriển không bình thường của trẻ sinh ra cũng rất lớn Nuôi phôi đến giai đoạnphôi nang phải trải qua sự chọn lọc của chính các phôi, vì vậy mỗi lần chỉ nênchuyển một phôi nang vào buồng tử cung người mẹ [66].

Hơn nữa, nuôi phôi nang rất cần thiết khi thực hiện kỹ thuật chẩn đoán

di truyền trước làm tổ Nuôi phôi nang giúp sinh thiết được nhiều tế bào hơn

so với giai đoạn phân cắt trong kỹ thuật chẩn đoán và sàng lọc di truyền tiềnlàm tổ Gần đây các phôi nang có chất lượng tốt đóng vai trò quan trọng trongnuôi tế bào gốc (stem cells) của người thông qua sinh thiết các tế bào của nụphôi giúp cho việc điều trị một số bệnh trong y học [17]

1.3.2 Hệ thống nuôi phôi trong thụ tinh ống nghiệm

Hình 1.4 Hệ thống nuôi phôi trong phòng Labo [45]

Hệ thống nuôi phôi bao gồm môi trường nuôi phôi, dụng cụ nuôi, tủnuôi và hệ thống các khí (Hình 1.4) Hệ thống nuôi phôi bao gồm không chỉ

tương tác của phôi với môi trường vật lý xung quanh nó mà còn giữa cácthông số trong labo [45].

Nuôi phôi thành công trong labo phụ thuộc chủ yếu vào quản lý chấtlượng (QC) và đảm bảo chất lượng (QA) Trước hết, bất cứ vật dụng gì mangvào phòng nuôi phôi đều phải đảm bảo không gây độc cho phôi Ngoài ra,việc quản lý các quy trình kỹ thuật trong phòng nuôi và quản lý các nhân viênphòng nuôi phôi cũng như quản lý các trang thiết bị, môi trường nuôi, khôngkhí trong phòng nuôi phôi đều quan trọng nhằm đảm bảo tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệphôi tốt đồng thời hạn chế tối đa các sự cố Hơn nữa, cần đào tạo kiến thứcchuyên môn cho các nhân viên phòng nuôi phôi để tư vấn, cung cấp thông tinđầy đủ cho bệnh nhân Mục đích của hệ thống nuôi phôi là:

- Nâng cao tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt và đáp ứng được nhu cầu củacác cặp vợ chồng vô sinh là có những em bé khỏe mạnh

- Cung cấp thông tin đầy đủ về noãn, tinh trùng, phôi cho bệnh nhân.Bệnh nhân phải có quyền được giải thích, tư vấn về những kỹ thuật áp dụngtrên noãn, tinh trùng, phôi của họ và có quyền tham gia vào các quyết địnhđối với noãn, tinh trùng, phôi của họ

- Tránh nhầm lẫn mẫu noãn, tinh trùng, phôi [71]

Để đạt được mục đích của hệ thống nuôi cần phải có các chính sáchđường lối cụ thể: các luật, các quy định, các pháp chế, các quy trình củaphòng nuôi phôi được tạo thành một hệ thống tài liệu Các tài liệu có thể sửdụng được cho tất cả mọi người và được kiểm soát thông qua các quy trìnhkiểm tra tài liệu

1.3.3 Quá trình phát triển của phôi và các chỉ số đánh giá sự phát triển của phôi trong IVF

Sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương noãn, phôi được hình thành vàphát triển lên giai đoạn phôi phân chia: 2 tế bào, 4 tế bào, 8 tế bào, phôi dâu

và cuối cùng là phát triển thành phôi nang Quá trình phát triển của phôi trongIVF thường kéo dài khoảng 5 ngày, những phôi phát triển chậm có thể kéo dàiđến 6 ngày ở môi trường bên ngoài.

Trong IVF, việc đánh giá chính xác chất lượng phôi là một trong nhữngyếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tỷ lệ thành công Trong các hệ thống phânloại nói chung, đối với phôi giai đoạn phân chia, các chỉ tiêu đánh giá baogồm: số lượng phôi bào, sự phân mảnh, tính đối xứng; có thể ghi nhận thêm

sự hiện diện của hiện tượng đa nhân và trạng thái nén chặt của các phôi bào.Đối với phôi nang, các đặc điểm đánh giá bao gồm: độ nở rộng của khoang,đặc điểm ICM và khối tế bào lá nuôi (trophoblast) [14]

a) Đánh giá phôi giai đoạn phân chia sớm:

Khoảng 16 giờ sau khi thụ tinh, xuất hiện 2 tiền nhân Ở một số bệnhnhân, tiền nhân có thể xuất hiện sớm 12–14 giờ sau khi thụ tinh hoặc xuấthiện muộn sau 20–22 giờ Sự phân chia đầu tiên xảy ra khoảng 20–24 giờ saukhi thụ tinh Bình thường cứ mỗi 24 giờ, phôi có số lượng phôi bào phát triểntăng gấp đôi Vào ngày thứ 2, phôi phát triển bình thường sẽ có 2 đến 4 phôibào và có khoảng 8 phôi bào vào ngày thứ 3 Trong quá trình phát triển phôitrải qua 3 chu kỳ phân chia Thời điểm của 3 chu kỳ phân chia lần lượt là 35,6giờ; 45,7 giờ và 54,3 giờ sau khi thụ tinh Số lượng phôi bào không chẵn cóthể gặp ở phôi phát triển bình thường do phôi bào đang trong giai đoạn phânbào hoặc do sự phân chia của các phôi bào không đồng bộ Cuối ngày thứ 3sau khi phát triển thành 8 phôi bào (rất ít trường hợp phát triển đến 16–32phôi bào) phôi sẽ kết dính và bắt đầu xuất hiện những nang nhỏ vào cuối ngàythứ tư [14]

Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia sớm dựa vào các tiêu chísau: số lượng phôi bào, sự đồng đều về kích thước giữa các phôi bào và cácmảnh vỡ bào tương

- Đánh giá số lượng phôi bào

Giai đoạn phân chia của phôi bắt đầu từ giai đoạn phôi 2 phôi bào đếngiai đoạn nén của phôi dâu gồm 8–16 phôi bào Các nghiên cứu gần đây chothấy bên cạnh thời điểm phân chia, khoảng cách thời gian giữa các lần phânchia cũng rất quan trọng Nếu tất cả các phôi bào phân chia đồng bộ một cáchchính xác, chúng ta chỉ quan sát được các phôi 2, 4, 8 phôi bào Tuy nhiên,trong thực tế, chúng ta thường quan sát thấy các phôi 3, 5, 6, 7 hoặc 9 tế bào,điều này cho thấy sự phát triển không đồng bộ giữa các phôi bào Thời điểmđánh giá phôi được nghiên cứu và thiết lập nhằm đánh giá chính xác tínhđộng học của phôi Số lượng phôi bào là đặc điểm chính, có giá trị tiên lượngcao nhất trong đánh giá chất lượng phôi Phôi chất lượng tốt phải là phôi thểhiện tính động học thích hợp và tính đồng bộ trong các giai đoạn phân chia Ởphôi có sự phát triển bình thường, sự phân chia phôi bào sẽ diễn ra cách nhau18–20 giờ Các phôi phân chia quá chậm hoặc quá nhanh có thể có nhữngkhiếm khuyết ở nhiễm sắc thể hoặc ở quá trình trao đổi chất

Trong đánh giá phôi giai đoạn phân chia, các mốc thời gian quan sát tốtnhất được thông qua trong hội thảo đồng thuận Istanbul (Alpha Scientists inReproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology,2011) như sau: Ngày 1: (26 ± 1) giờ sau ICSI, (28 ± 1) giờ sau IVF: 2 phôibào; Ngày 2: (44 ± 1) giờ, 4 phôi bào; Ngày 3: (68 ± 1) giờ, 8 phôi bào

- Đánh giá độ đặc hiệu về kích thước giữa các phôi bào theo từng giai đoạn

Theo lý thuyết, quá trình nguyên phân sẽ tạo ra 2 phôi bào có kíchthước bằng nhau Kích thước phôi bào trong một phôi phụ thuộc vào số lầnphân chia và độ đồng đều của mỗi lần phân chia Do đó, để đánh giá chấtlượng phôi giai đoạn phân chia một cách chính xác hơn, người ta đưa ra haikhái niệm: phôi “stage specific” và “non-stage specific” Việc phân loại được

thực hiện dựa trên số lượng phôi bào và kích thước phôi bào (Hình 1.5) Theo

đó, phôi có các phôi bào đúng kích thước (stage specific) là:

- Phôi có 2, 4, 8 phôi bào: các phôi bào có kích thước giống nhau

- Phôi 3 có phôi bào: 1 phôi bào to và 2 phôi bào nhỏ

- Phôi 5 có phôi bào: 3 phôi bào to và 2 phôi bào nhỏ

- Phôi 6 có phôi bào: 2 phôi bào to và 4 phôi bào nhỏ

- Phôi 7 có phôi bào: 1 phôi bào to và 6 phôi bào nhỏ

Hình 1.5 Quan điểm về phân loại phôiMàu xanh đậm là các phôi bào đúng kích thước (stage specific), màu xanhnhạt là các phôi bào không đúng kích thước (non stage specific)

(Nguồn: Fernando, 2012) [83]

- Đánh giá độ phân mảnh bào tương

Ở phôi đang phân chia, quá trình nguyên phân thường tạo ra các mảnh

tế bào chất, không chứa nhân được bao quanh bởi một màng plasma, gọi làmảnh vỡ tế bào (fragment) Kích thước và sự phân bố các mảnh vỡ tế bào bêntrong khoảng không gian bao quanh là màng trong suốt (zona pellucida)thường rất khác nhau Người ta thường sử dụng lượng mảnh vỡ tế bào để dựđoán khả năng làm tổ của phôi và sự lệch bội Tuy nhiên, nếu mảnh vỡ tế bàochỉ chiếm ít hơn 10% thể tích toàn bộ phôi thì không ảnh hưởng đến tiềmnăng phát triển của phôi [14]

Mức độ phân mảnh thường được biểu diễn theo tỉ lệ phần trăm trongtổng thể tích tế bào chất và được chia thành 3 cấp độ:

 Phân mảnh thật: xuất hiện tách hẳn ra khỏi phôi bào và hiện diệntrong suốt quá trình phát triển của phôi

 Phân mảnh giả: xuất hiện tạm thời trong giai đoạn phân chia của phôi

và không hiện diện trong quá trình phát triển sau này của phôi

b) Đánh giá chất lượng phôi nang

Thời điểm này phôi tiếp tục phân chia, số lượng các phôi bào tăng dần

và phát triển thành phôi nang Phôi nang phát triển hoàn toàn vào ngày thứ 5

Số lượng phôi bào ở thời điểm này vào khoảng 50 đến 150 phôi bào và baogồm 2 loại:

- Loại phôi bào thứ nhất hình thành ICM sau này sẽ phát triển thànhthai, chiếm khoảng từ 20–30% tổng số phôi bào Ngoài ra kích thước ICM

còn là tiêu chuẩn quan trọng nhất đối với tỉ lệ thành công làm tổ của phôi Đểchi tiết hơn, Gardner và cộng sự (1999) đã phân loại ICM thành 3 loại: loại Akhi các tế bào nhiều, gắn kết chặt chẽ; loại B có một vài tế bào, gắn kết lỏnglẻo; và loại C có rất ít tế bào [44].

- Loại phôi bào thứ hai là tế bào lá nuôi sẽ phát triển thành các phầnphụ của thai Tế bào lá nuôi tạo thành một lớp bao quanh ICM

Ở giữa là khoang phôi chứa đầy dịch do hai loại tế bào này tiết ra đểbảo vệ và nuôi dưỡng thai Vào giai đoạn này, màng trong suốt bị dàn mỏng

ra và bao quanh như một màng mỏng, sau đó màng trong suốt vỡ ra để cácphôi bào thoát ra ngoài màng gọi là hiện tượng phôi thoát màng chuẩn bị cho

sự làm tổ của phôi trong tử cung

1.3.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển của phôi trong IVF 1.3.4.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng

Trước đây, người ta thường sử dụng môi trường nuôi phôi bên ngoàiđến ngày thứ 2 hoặc 3 khi phôi đạt đến giai đoạn 4–8 phôi bào Gần đây,nhiều nghiên cứu hơn về sự trao đổi chất của phôi, nhu cầu cụ thể của phôitừng giai đoạn và phân tích rõ về môi trường ống dẫn trứng và tử cung, cácnhà khoa học đã có thể nuôi phôi đến giai đoạn phôi nang, chọn lựa được phôi

có tiềm năng phát triển và giúp đồng bộ hóa phôi với đường sinh sản ngườiphụ nữ

Các thành phần trong môi trường nuôi phôi (Bảng 1.1) bị ảnh hưởngbởi hai nguyên lý khác nhau cơ bản: (i) tôn trọng sự biến đổi môi trường nuôiphôi tuần tự trong tự nhiên, hoặc (ii) giảm tối đa sự căng thẳng cho tế bào/tiêutốn năng lượng của phôi trong việc thích nghi với sự thay đổi môi trường liêntục Trước năm 2016, đa số các TTHTSS tại Việt Nam đều chỉ sử dụng môitrường nuôi đa bước Hiện nay, các TTHTSS tại Việt Nam và thế giới đang sử

dụng song song cả hai loại môi trường thương mại là môi trường đơn bước và

chloride

Calcium chloride

Monopotassiumphosphate

Sodium citrate Sodium citrate

Magnesium sulphate Magnesium

sulphate

MagnesiumsulphateSodium dihydrogen

phosphate

Sodium dihydrogenphosphate

Chất đệm Sodium bicarbonat Sodium

bicarbonate

Sodium bicarbonate

Sodium lactate Sodium lactate Sodium lactateSodium pyruvate Sodium

pyruvate

Sodium pyruvate

Các đại phân

Hyaluronan,HSA

Hyaluronan,HSA

Môi trường nuôi phôi có thành phần rất phức tạp Những thành phầntrong môi trường nuôi này sẽ hỗ trợ phôi trong quá trình phát triển Một sốthành phần đóng vai trò cung cấp năng lượng, một số thành phần giúp cânbằng nội môi, trong khi đó một số thành phần tạo ra pH tối ưu cho sự pháttriển

a) Nước: Là thành phần cơ bản của bất kỳ loại môi trường nuôi phôi

Nguồn nước và độ tinh khiết của nước có vai trò rất quan trọng, đảm bảo chất

lượng của môi trường [46] Có thể sử dụng nước cất với hệ thống lọc siêusạch hoặc nước cất đã được thương mại Dù sử dụng loại nào, nước trong môitrường nuôi cũng phải đảm bảo các tiêu chuẩn nghiêm ngặt, chẳng hạn đạt cáctiêu chuẩn vô khuẩn của Dược điển Hoa Kỳ (USP)/Châu Âu (EP) dành chonước pha tiêm (USP/EP Certified Water) Nước khi kết hợp với các thànhphần khác cũng cần được kiểm tra chất lượng trước khi dùng trong điều trị[84].

b) Ion và áp suất thẩm thấu: các ion bổ sung trong thành phần nuôi

phôi đầu tiên được mô tả dựa vào môi trường Krebs-Ringer Bicarbonate(KRB) bao gồm Na+, K+, Mg2+, Ca2+, SO42-, PO43- và HCO3- [46] Đây là dungdịch muối ion cơ bản được sử dụng cho đến những năm 1980 Sau đó, các thínghiệm trên chuột sau đó với môi trường dịch vòi trứng (Human tubal fluid –HTF) cho thấy tỉ lệ dư thừa Na+ và K+ gây ức chế sự phát triển của phôi [84].Tiếp theo, những phát hiện về ảnh hưởng của phosphate và glucose trên phôichuột gây ngừng phát triển phôi giai đoạn sớm dẫn đến việc loại bỏ phosphate

ra khỏi môi trường nuôi và bổ sung các acid amin, vitamin, EDTA để loại trừcác ức chế này [46] Mg2+ và Ca2+ đóng vai trò quan trọng trong quá trình néncủa phôi Tuy nhiên, nghiên cứu trên phôi chuột ở giai đoạn 1 đến 2 tế bàocho thấy nồng độ Ca2+ dư thừa làm giảm khả năng phát triển của phôi [61].Ngoài các ion nói trên, HCO3- là ion có vai trò rất lớn được sử dụng trong hệđệm của môi trường nuôi nhằm duy trì độ pH sinh lý cho phôi phát triển [84]

Nồng độ và thành phần các ion khác nhau tùy thuộc vào từng loại môitrường, nồng độ các ion ngoại bào có thể ảnh hưởng đến nồng độ ion nội bào

Do vậy, ion đóng vai trò rất lớn trong việc quyết định áp suất thẩm thấu củamôi trường nuôi Cho đến nay, áp suất thẩm thấu tối ưu của môi trường nuôiphôi người vẫn chưa được khẳng định Áp suất thẩm thấu ở một số môitrường nuôi truyền thống thường được duy trì ở mức 275–295 mOsmols [46]