ĐIỀ U CH Ỉ NH PH Ả N Ứ NG H Ạ N C ỦA ĐẬU TƯƠNG B Ằ NG CÁCH X Ử LÝ MEPIQUAT CHLORIDE Xiyue Wang 1 , Xinyu Zhou 1 , Zhipeng Qu 1 , Chao Yan 1 , Chunmei Ma 1 , Jun Liu 2 và Shoukun Dong 1 Võ Như Cầ m biên d ị ch 1 Cao đẳ ng Nông nghi ệp, Đạ i h ọ c Nông nghi ệp Đông Bắc, Cáp Nhĩ Tân, T rung Qu ố c 2 Phòng thí nghi ệ m H ệ gen ch ức năng và Tin sinh họ c, Vi ệ n Khoa h ọ c Cây tr ồ ng, Vi ệ n Khoa h ọ c Nông nghi ệ p Trung Qu ố c, B ắ c Kinh, Trung Qu ố c Gi ớ i thi ệ u: Đậu tương là cây trồ ng quan tr ọ ng nh ấ t trên th ế gi ớ i và h ạ n hán có th ể ả nh hưởng đế n s ự phát tri ể n c ủ a chúng và cu ối cùng là năng suấ t Ứ ng d ụ ng mepiquat chloride (MC) qua lá có kh ả năng làm giả m b ớ t thi ệ t h ạ i do h ạ n hán gây ra ở th ự c v ậ t; tuy nhiên, cơ chế điều hòa MC đố i v ớ i ph ả n ứ ng h ạ n hán c ủa cây đậu tương vẫn chưa đượ c nghiên c ứ u Phương pháp: Nghiên c ứ u này kh ảo sát cơ chế điề u hòa ứ ng phó v ớ i khô h ạ n c ủ a cây đậu tương bằ ng mepiquat chloride ở hai gi ống đậu tương Heinong 65 (HN65) m ẫ n c ả m và Heinong44 (HN44) ch ị u h ạ n, theo ba k ị ch b ả n x ử lý, bình thườ ng, khô h ạ n và khô h ạ n + Điề u ki ệ n MC K ế t qu ả và th ả o lu ậ n: MC thúc đẩy tích lũy chấ t khô khi b ị h ạ n hán, gi ả m chi ề u cao cây, gi ả m ho ạt độ ng c ủ a enzyme ch ố ng oxy hóa và gi ảm đáng kể hàm lượ ng malondialdehyd Quá trình thu nh ậ n ánh sáng, h ệ th ố ng ả nh I và II b ị ứ c ch ế ; tuy nhiên, s ự tích lũy và điề u hòa l ạ i m ộ t s ố axit amin và flavonoid c ủa MC đã đượ c quan sát Phân tích k ế t h ợp đa omics cho thấ y quá trình chuy ể n hóa axit 2-oxocarboxylic và quá trình sinh t ổ ng h ợ p isoflavone là nh ữ ng quá trình c ốt lõi mà MC điề u ch ỉ nh ph ả n ứ ng h ạ n hán ở đậu tương Cá c gen ứ ng c ử viên như LOC100816177 , SOMT-2 , LOC100784120 , LOC100797504 , LOC100794610 và LOC100819853 được xác đị nh là r ấ t quan tr ọng đố i v ớ i tính kháng h ạ n c ủa đậu tương Cuố i cùng, m ột mô hình đã đượ c xây d ựng để mô t ả m ộ t cách có h ệ th ống cơ chế điề u ti ế t c ủ a ứ ng d ụng MC trên cây đậu tương khi bị khô h ạ n Nghiên c ứ u này l ấp đầ y kho ả ng tr ố ng nghiên c ứ u c ủa MC trong lĩnh vự c kháng b ệ nh đậu tương 1 GI Ớ I THI Ệ U Đậu tương ( Glycine max ) là m ộ t trong nh ữ ng cây tr ồ ng quan tr ọ ng nh ấ t hi ện đang đượ c tr ồng, cũng l à nguyên li ệu thô chính để s ả n xu ấ t d ầ u th ự c v ậ t và protein (Liu và cs, 2020) Đậu tương ch ứ a nhi ề u ch ấ t hóa h ọ c th ự c v ậ t, bao g ồ m các h ợ p ch ấ t phenolic và isoflavone Ngoài ra, chúng đượ c coi là m ộ t lo ạ i th ự c ph ẩ m truy ề n th ố ng t ố t cho s ứ c kh ỏ e nh ờ giá tr ị dinh dưỡng cao (Wang và Komatsu, 2017) Hơn nữ a, chúng r ấ t quan tr ọ ng trong s ả n xu ấ t th ức ăn chăn nuôi (Tyczewska và cs , 2016) Năng suấ t và s ản lượng đậ u tương toàn cầ u trên m ỗi ha đã tăng liên tụ c trong th ế k ỷ qua nh ờ nh ữ ng ti ế n b ộ trong canh tác nông nghi ệ p và gi ố ng cây tr ồ ng phù h ợ p v ới các vĩ độ khác nhau (Ainsworth và cs, 2012) Tuy nhiên, v ẫ n còn nhi ề u ph ạm vi để c ả i thi ệ n vi ệ c ch ọ n gi ống đậu tương để tăng năng suấ t c ủa chúng Cho đế n nay, lai t ạ o và ch ọ n gi ố ng phân t ử đã đượ c ti ế n hành như mộ t ph ầ n c ủ a ch ọ n gi ống đậu tương (Cao và cs, 2022) Tuy nhiên, m ộ t s ố y ế u t ố môi trườ ng nh ất đị nh, ch ẳ ng h ạn như hạ n hán, nhi ễ m m ặ n và nhi ệt độ c ực cao, đã đượ c phát hi ệ n là h ạ n ch ế nghiêm tr ọ ng s ự lây lan c ủ a th ự c v ậ t, ảnh hưởng đế n s ự tăng trưở ng và phát tri ể n, đồ ng th ờ i làm gi ả m s ản lượ ng cây tr ồ ng (Zhang và cs, 2022) H ạ n hán là m ộ t trong nh ững căng thẳ ng phi sinh h ọc chính ngăn cả n s ự phát tri ển và năng su ấ t c ủ a cây tr ồ ng và gây nguy hi ể m cho tính b ề n v ữ ng c ủ a s ả n xu ấ t cây tr ồ ng Nó c ả n tr ở s ự phát tri ể n c ủ a th ự c v ậ t b ằng cách làm gián đoạ n dòng ch ả y c ủa nướ c và gi ả m lượng nướ c cung c ấ p (Dubey và cs , 2021) Đáng chú ý, ở c ấp độ t ế bào và sinh v ậ t, th ự c v ật đã phát triể n các ph ả n ứng sinh lý và sinh hóa đố i v ớ i h ạ n hán (Razi và Muneer, 2021) Cây b ị h ạ n hán có lá vàng và quăn hoặ c héo Ngoài ra, h ạ n hán ảnh hưởng đế n hình thái c ủ a r ễ , d ẫn đế n gi ả m chi ề u dài, di ện tích và đườ ng kính c ủ a r ễ (Bashir và cs, 2019) Theo lý thuy ế t sinh lý h ọ c, h ạn hán làm tăng khả năng chố ng oxy hóa, ho ạt độ ng c ủ a enzyme ch ố ng oxy hóa và tích lũy chất điề u ch ỉ nh th ẩ m th ấ u trong th ự c v ậ t (Wang và cs , 2022a) Hơn nữ a, kích thích t ố th ự c v ậ t ảnh hưởng đáng kể đế n ph ả n ứ ng c ủ a th ự c v ậ t đố i v ớ i áp l ự c h ạ n hán Ví d ụ , áp l ự c h ạ n hán d ẫn đế n s ự tích t ụ thườ ng xuyên c ủ a axit abscisic (ABA) (Waadt và cs, 2022) Ngoài ra, khô h ạ n có th ể gây h ạ i cho kh ả năng tổ ng h ợ p oxy c ủ a th ự c v ật, điể n hình là làm gi ả m kh ả năng quang hợp và đặ c tính hu ỳ nh quang c ủ a ch ấ t di ệ p l ụ c (Yang và cs, 2019) Các nghiên c ứ u v ề h ạn hán đã tiến xa hơn m ức độ sinh lý h ọ c và hi ệ n bao g ồ m vi ệ c ki ể m tra k ỹ lưỡng các cơ chế phân t ử Trong nghiên c ứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã phát hiệ n ra m ộ t h ệ th ố ng ch ố ng h ạ n t ậ p trung vào con đường đường phân, chu trình axit tricarboxylic (TCA) và con đườ ng pentose phosphate, cũng như các gen ứ ng c ử viên ti ềm năng cho kh ả năng chố ng h ạ n (Wang và cs, 2022b) Hi ểu được cơ chế c ủ a h ạ n hán có th ể cho phép các nhà nghiên c ứ u c ả i thi ệ n kh ả năng chố ng h ạ n c ủ a th ự c v ậ t b ằ ng cách s ử d ụ ng các k ỹ thu ậ t nh ất đị nh, bao g ồ m công ngh ệ ch ỉ nh s ử a gen và lai t ạ o Tuy nhiên, vi ệ c ch ọ n gi ố ng có s ức đề kháng cao thường đòi hỏ i th ờ i gian dài và t ố n kém Hi ệ n t ạ i, m ộ t s ố hóa ch ấ t ngo ạ i sinh, ch ẳ ng h ạn như melatonin, thường đượ c s ử d ụng để tăng cườ ng s ự phát tri ể n c ủ a cây tr ồ ng và kh ả năng chố ng ch ịu căng t h ẳ ng (Tiwari và cs, 2021) Mepiquat chloride (MC), m ộ t ch ấ t ứ c ch ế tăng trưở ng th ự c v ậ t n ội sinh, thườ ng đượ c s ử d ụ ng trong bông v ả i Vi ệ c làm ch ậ m ho ạt độ ng c ủ a gibberellin (GA) liên quan đế n s ự kéo dài t ế bào s ẽ ngăn chặ n vi ệ c kích ho ạt các đườ ng truy ề n tín hi ệ u, ứ c ch ế s ự phát tri ển sinh dưỡ ng và phá v ỡ cân b ằ ng n ộ i môi GA b ằ ng cách kích ho ạt các gen đặ c hi ệ u t ạ i v ị trí, cu ố i cùng d ẫn đế n cây lùn (Tung và cs, 2020) Ngoài ra, nghiên c ứu trướ c đây của chúng tôi đã chứ ng minh r ằng MC ngăn chặ n s ự phát tri ể n c ủa đậu tương bằ ng cách ngăn chặ n vi ệ c s ả n xu ấ t GA, zeatin, brassinolide và các hormone th ự c v ậ t khác, cũng như các gen liên quan đế n quá trình xây d ự ng và truy ề n tín hi ệ u c ủ a thành t ế bào; hơn nữ a, chúng tôi phát hi ệ n ra r ằ ng MC có th ể ch ịu đượ c h ạ n hán Vi ệ c s ử d ụ ng MC trong các trườ ng h ợp nước điể n hình d ẫn đế n s ự tích t ụ m ột lượng đáng kể flavonoid và tăng lượ ng ABA ở m ức độ n ộ i ti ế t t ố (Wang và cs, 2022c) Ngoài ra, m ộ t s ố nghiên c ứ u ti ế t l ộ r ằ ng MC c ả i thi ệ n kh ả năng chố ng l ại căng thẳ ng Ví d ụ , Liu và cs (2018) phát hi ệ n ra r ằ ng vi ệ c s ử d ụ ng MC có th ể c ả i thi ệ n ch ức năng trao đổ i ch ấ t sinh lý c ủ a th ự c v ậ t b ằng cách tăng hàm lượ ng ch ấ t di ệ p l ục và protein hòa tan trong lá hướng dương, tăng tích lũy axit amin tự do, gi ả m s ả n xu ấ t malondialdehyd (MDA) và tăng cườ ng ho ạt độ ng c ủ a catalase (CAT), men b ả o v ệ peroxidase (POD) và superoxide dismutase (SOD) Luo và cs (2010) đã chứ ng minh r ằ ng x ử lý MC điề u ch ỉnh đáng kể kh ả năng chị u l ạ nh và tăng trưở ng c ủ a ớ t ng ọ t, b ằ ng ch ứ ng là s ự gia tăng hoạt độ ng SOD và CAT, tăng các hợ p ch ất điề u ch ỉ nh th ẩ m th ấu như proline và đường hòa tan trong lá, và tích lũy thêm ABA, làm gi ả m thi ệ t h ạ i do ứ ng su ấ t nhi ệt độ th ấp gây ra Tuy nhiên, cơ chế phân t ử ti ềm năng c ủ a vi ệc điề u ch ỉ nh MC đố i v ớ i ph ả n ứ ng h ạ n hán c ủa đậu tương v ẫn chưa đượ c bi ế t Trong nghiên c ứu này, tác độ ng c ủa MC đố i v ớ i s ự tăng trưở ng và sinh lý c ủa cây đậ u tương khi bị khô h ạn đã đượ c báo cáo m ộ t cách có h ệ th ố ng b ằ ng cách áp d ụ ng MC cho lá và mô ph ỏ ng h ạ n hán b ằ ng Polyethylene Glycol (PEG- 6000) Cơ chế phân t ử c ủ a MC điề u ch ỉ nh ph ả n ứ ng c ủa đậu tương đố i v ớ i h ạn hán đã được phân tích sâu hơn, giúp lấ p đầ y kho ả ng tr ố ng nghiên c ứ u c ủa MC trong lĩnh vự c ch ố ng ch ịu căng thẳ ng c ủa đậ u tương và đặ t n ề n t ả ng cho vi ệc thúc đẩ y MC trong s ả n xu ất đậu tương 2 V Ậ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 1 V ậ t li ệ u thí nghi ệ m và thi ế t k ế thí nghi ệ m Hai gi ố ng Heinong 65 (HN65) nh ạ y c ả m và Heinong 44 (HN44) ch ị u h ạn đượ c ch ọ n làm v ậ t li ệ u thí nghi ệ m vì kh ả năng chị u h ạ n khác bi ệ t ở giai đoạ n cây con (Wang và cs, 2022d) Phương pháp canh tác trên cát đượ c s ử d ụ ng cho thí nghi ệ m Tám h ạt đượ c gieo m ỗ i ch ậ u và t ỉa thưa thành ba cây con mỗ i ch ậ u khi lá th ậ t phát tri ển đầy đủ Chúng đượ c tướ i m ộ t l ầ n m ỗ i ngày b ằng nướ c c ất (500mL) cho đế n khi lá th ậ t phát tri ển đầy đủ , và sau đó bằ ng dung d ịch dinh dưỡ ng Hoagland (500mL) m ộ t l ầ n m ỗi ngày cho đế n khi lá th ậ t n ở ra hoàn toàn Các nghi ệ m th ức sau đây đượ c áp d ụ ng khi đậu tương đạt đế n giai đoạ n cây con (V3): Nghi ệ m th ức 1 (điề u ki ện bình thường), điề u ki ện nước bình thườ ng đượ c duy trì b ằ ng cách b ổ sung 500mL dung d ịch dinh dưỡ ng Hoagland hàng ngày Nghi ệ m th ứ c 2 (h ạn hán), điề u ki ện nước bình thường được duy trì trong 3 ngày đầ u tiên, và nghi ệ m th ứ c h ạn hán đượ c áp d ụng sau đó Dung dịch dinh dưỡ ng Hoagland (500mL) ch ứ a 15% PEG- 6000 đượ c s ử d ụ ng m ộ t l ầ n m ỗ i ngày trong 4 ngày ti ế p theo Nghi ệ m th ứ c 3 (h ạ n + MC): Dung d ịch MC (100 mg/L) phun đều lên các lá cho đến khi lá ướ t hoàn toàn nhưng không nhỏ gi ọt Điề u ki ện nước bình thường đượ c duy trì trong 3 ngày đầu tiên Sau đó, một phương pháp x ử lý căng thẳ ng h ạn hán đã đượ c áp d ụ ng, và trong 4 ngày ti ế p theo, 500mL dung d ịch dinh dưỡ ng ch ứ a 15% PEG- 6000 đượ c s ử d ụ ng m ỗ i ngày m ộ t l ầ n T ấ t c ả các phương pháp x ử lý sau đó đã đượ c l ấ y m ẫu và đo lường Để đả m b ảo đủ v ậ t li ệ u thí nghi ệ m, m ỗ i nghi ệ m th ứ c gi ữ l ạ i 30 ch ậu, duy trì hơn ba lầ n l ặ p l ạ i sinh h ọ c (bao g ồ m c ả phép đo hình thái và sinh lý) Để hi ểu được quy đị nh v ề h ạ n hán c ủ a MC ở c ấp độ phân t ử , phân tích phiên mã và chuy ển hóa đượ c th ự c hi ệ n trong các nghi ệ m th ứ c 2 và 3, bao g ồ m hai nhóm, HN44 h ạ n so v ớ i HN44 h ạ n + MC và HN65 h ạ n so v ớ i HN65 h ạ n + MC (Sau đây gọi là Nhóm HN44 và Nhóm HN65, tương ứ ng) 2 2 Xác đị nh các ch ỉ tiêu hình thái, sinh lý Chi ều cao cây được đo bằng thước mét Đố i v ớ i tr ọng lượ ng khô c ủa lá và thân, cây đượ c c ắ t ở v ế t s ẹ o c ủ a lá m ầm, lá và thân đượ c tách th ủ công và cho vào phong bì gi ấy, sau đó phong bì này được niêm phong Chúng đượ c s ấ y khô trong lò ở 65°C trong 3 ngày và đượ c cân b ằ ng cân Phương pháp axit thiobarbituric đượ c s ử d ụng để xác đị nh n ồng độ MDA Hàm lượ ng pro line được xác đị nh b ằ ng k ỹ thu ậ t axit indenetrione-sulfosalicylic K ỹ thu ậ t nitroblue tetrazolium (NBT) đượ c s ử d ụng để đo hoạt động SOD và guaiacol đượ c s ử d ụng để đo ho ạt độ ng POD Nh ữ ng k ỹ thu ật này đượ c trình bày chi ti ế t trong nghiên c ứu trước đây c ủ a chúng tôi (Dong và cs , 2019) Excel (Microsoft 365MSO) đã đượ c s ử d ụng để v ẽ bi ểu đồ thanh Hàm lượ ng ch ấ t di ệ p l ục tương đối được xác đị nh b ằ ng MultispeQV2 0 2 3 Phương pháp thí nghiệ m phiên mã và chuy ể n hóa T ổ ng c ộng có 12 thư việ n DNA b ổ sung (cDNA) đã đượ c xây d ự ng (bao g ồ m ba l ầ n l ặ p l ạ i nghi ệ m th ứ c 2 và 3) Các thư viện cDNA đã đượ c gi ả i trình t ự trên n ề n t ả ng gi ả i trình t ự Illumina D ữ li ệ u g ốc đượ c l ọ c b ằng fastp 0 19 3 HISAT v2 1 0 đã tạ o m ộ t ch ỉ m ụ c và căn chỉ nh các l ần đọ c s ạ ch theo b ộ gen tham chi ếu DESeq2 v1 22 1 đượ c s ử d ụng để ti ế n hành phân tích bi ể u th ứ c khác bi ệ t gi ữ a hai nhóm và k ỹ thu ậ t Stewamini & Hochberg đượ c áp d ụng để điề u ch ỉ nh giá tr ị P Đố i v ớ i bi ể u th ứ c chênh l ệch đáng kể , giá tr ị P đượ c điề u ch ỉ nh và |log2 thay đổi| đã đượ c s ử d ụng làm tiêu chí |log2 thay đổi| ≥ 1 và FDR