An Giang, ngày 30 tháng 05 năm 2023 Sinh viên thực hiện Trang 6 TÓM TẮT Nghiên cứu đƣợc thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn dòng nấm men có hoạt tính lên men cao, để lên men
GIỚI THIỆU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Nấm men đóng vai trò rất quan trọng trong đời sống và hiện diện trong các quá trình chế biến thực phẩm, điển hình nhƣ lên men bánh mì, cơm rƣợu, rƣợu vang, nước trái cây lên men Trong những năm qua, men thương mại là loại thường sử dụng trong sản xuất rượu vang do nhu cầu của quy mô sản xuất công nghiệp Tuy nhiên, men thương mại có thể làm giảm các đặc trưng của các sản phẩm lên men từ những nguồn nguyên liệu ở những vùng khác nhau
Do đó, ngày càng có nhiều nhà sản xuất trở lại với phương pháp lên men truyền thống, sử dụng các dòng men địa phương Các loài và chủng nấm men tự nhiên với các đặc tính khác nhau sẽ tạo thành các chất dễ bay hơi có thành phần và tỷ lệ khác nhau từ đó ảnh hưởng đến nồng độ cồn và hương vị của các sản phẩm lên men (Xu và cs., 2011)
Hồng quân (Flacourtia jangomas (Lour.) Raeush) đƣợc biết đến trong việc điều trị dạ dày và tiêu hóa, làm dịu cơn khát, hữu ích trong việc giải khát, hạ sốt, chống oxy hóa và các hoạt động gây độc tế bào Quả Hồng quân có vị ngọt, chua, hơi chát, nhƣng rất thơm ngon Ngoài ra, quả Hồng quân là một loại trái cây làm se, chống viêm, khử trùng, kháng khuẩn và đƣợc sử dụng để chữa các bệnh nhƣ tiêu chảy, hen suyễn, vàng da (Jeyachandran & Mahesh,
2007), điều trị các bệnh liên quan đến gan, buồn nôn và bệnh tiểu đường (Sarker và cs., 2011) Qua đó, cho thấy quả Hồng quân rất giàu chất dinh dƣỡng và tốt cho sức khỏe Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về quả này còn khá ít, quả chỉ thường sử dụng để ăn trực tiếp hoặc ngâm rượu Vì vậy, để tận dụng nguồn nông sản này, góp phần nâng cao giá trị kinh tế và đáp ứng nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng thì việc nghiên cứu đưa loại trái cây này vào chế biến các sản phẩm thực phẩm là vấn đề cấp thiết Do vậy, nghiên cứu này tập trung vào việc “Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men dịch quả Hồng quân (Flacourtia jangomas (Lour.) Raeush)” đƣợc thu nhận tại vùng bảy núi An Giang.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men dịch quả Hồng quân (Flacourtia jangomas (Lour.) Raeusch).
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Quả Hồng quân (Flacourtia jangomas (Lour.) Raeusch) đƣợc thu thập tại các khu vực huyện Tịnh Biên, Tri Tôn, tỉnh An Giang
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
− Phân lập và định danh sơ bộ một số nấm men từ dịch lên men nước Hồng quân
− Tuyển chọn các dòng nấm men lên men sinh khí CO 2 trong ống Durham
− Khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn.
NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI
– Đóng góp về mặt khoa học: kết quả nghiên cứu có thể là cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về khả năng khác từ quả Hồng quân, cung cấp kiến thức và những bài học kinh nghiệm trong các giáo trình, bài giảng, sử dụng nấm men được phân lập tự nhiên để lên men nước quả Hồng quân
– Đóng góp về mặt thực tiễn: đa dạng hóa các sản phẩm, nâng cao giá trị kinh tế của quả Hồng quân
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
2.1.1 Những nghiên cứu trong nước
Theo kết quả tìm kiếm các bài báo nghiên cứu trong nước, chưa có bài báo nào nói về phân lập nấm men có khả năng lên men trong dịch quả Hồng quân (Flacourtia jangomas (Lour.) Raeusch) Nên em liệt kê một số bài báo có liên quan về phân lập nấm men trong các loại trái cây khác nhau nhƣ: khóm, bần chua, cam sành, dâu,
Nguyễn Văn Thành và cs (2013) đã phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men rƣợu vang khóm Trái khóm đƣợc thu hái ngẫu nhiên tại các huyện Gò Quao (Kiên Giang), Vị Thanh và Long Mỹ (Hậu Giang) đã phân lập đƣợc 23 dòng nấm men từ dịch khóm lên men (có và không có bổ sung đường) Cho thấy dòng nấm men VK1 (phân lập từ dịch khóm Vị Thanh lên men tự nhiên) cho lên men rƣợu tốt nhất ở nhiệt độ là 28 - 30 o C và pH ban đầu là 4,5, có thể tạo ra lƣợng rƣợu là 13,26% (v/v) sau 10 ngày Định danh dòng nấm men bằng phương pháp giải trình tự xác định được dòng nấm men VK1 là Saccharomyces cerevisiae Đoàn Văn Thƣợc và Đinh Thị Hồng Duyên (2015) đã định loại và nghiên cứu khả năng lên men rƣợu của chủng nấm men NM2 phân lập từ quả bần chua
(Sonneratia caseolaris) Quả bần chua đƣợc thu hái tại rừng ngập mặn thuộc địa phận xã Diêm Điền, huyện Thái Thụy, tỉnh Thái Bình đã phân lập đƣợc 20 chủng nấm men và chủng nấm men NM2 có khả năng lên men rƣợu mạnh đã đƣợc lựa chọn để nghiên cứu Kết quả định danh loài bằng di truyền phân tử đã cho thấy chủng NM2 thuộc loài Candida tropicalis cho lên men rƣợu tốt nhất ở nhiệt độ là 30 o C và pH ban đầu là 3,5 có thể tạo ra lƣợng rƣợu là 14,9% (v/v) sau 14 ngày
Nguyễn Phúc Trường và Nguyễn Văn Thành (2022) đã phân lập và tuyển chọn nấm men có hoạt tính lên men cao từ quả cam sành Cam sành đƣợc thu hái tại các tỉnh Trà Vinh, V nh Long và thành phố Cần Thơ đã phân lập đƣợc
15 chủng nấm men thuộc 2 giống Saccharomyces và Hanseniaspora Dòng nấm men TVK1 phân lập đƣợc từ dịch quả cam thu ở Trà Vinh thuộc giống
Saccharomyces có hoạt lực lên men cao nhất với các thông số ban đầu: enzyme pectinase 0,15%; 23 o Brix; pH là 4,0 và mật số nấm men 10 7 tế bào/mL, lên men ở 30 o C, sau 8 ngày cho độ cồn cao nhất (13% v/v) Định danh dòng nấm men TVK1 bằng phương pháp giải trình tự DNA đã cho thấy
TVK1 tương đồng 99% với Saccharomyces cerevisiae
Nguyễn Văn Vũ và Nguyễn Văn Thành (2018) đã phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men rƣợu vang dâu Hạ Châu (Baccaurea ramiflora L.) Mẫu dâu phân lập nấm men gồm: dâu bòn bon, dâu Gia Bảo, dâu Xiêm, dâu Hạ Châu được thu hái tại vườn ở Cần Thơ và Hậu Giang, đã phân lập đƣợc 48 dòng nấm men thuộc 3 giống Saccharomyces, Hanseniaspora, và Pichia Rƣợu vang dâu Hạ Châu lên men từ nấm men CB1.1 với dịch phối chế từ các thông số tối ƣu: 24,7 o Brix, pH là 4,2; mật số nấm men 10 7 tế bào/mL và lên men ở nhiệt độ phòng trong 10 ngày cho độ cồn cao nhất (13,76% v/v) Định danh dòng nấm men CB1.1 bằng phương pháp giải trình tự DNA đã cho thấy CB1.1 tương đồng 99% với
2.1.2 Những nghiên cứu ngoài nước
Theo kết quả tìm kiếm các bài báo nghiên cứu ngoài nước, chưa có bài báo nào nói về phân lập nấm men có khả năng lên men trong dịch quả Hồng quân (Flacourtia jangomas (Lour.) Raeusch) Nên em liệt kê một số bài báo có liên quan về phân lập nấm men trong các loại trái cây khác nhau nhƣ: mật mía, chà là, quả sung, cam,
Madina Kechkar và cs (2019) đã phân lập và xác định các chủng nấm men từ mật mía (S1), chà là (S2) và quả sung (S3) để sản xuất ethanol trong điều kiện mô phỏng thủy phân tảo Nguyên liệu được thu mua ở chợ địa phương Sau nghiên cứu đã cho thấy chủng nấm men S1 chịu đƣợc ethanol tới (14% v/v), chủng S2 và S3 có khả năng chịu ethanol rất cao (20% v/v) Các chủng phân lập được định danh bằng phương pháp MALDI-TOF MS, cho thấy các chủng nấm men được nghiên cứu tương đồng 99% với Saccharomyces cerevisiae
Obasi, B.C và cs., (2014) đã phân lập và định danh các chủng nấm men có khả năng lên men từ nước cam 150 quả cam ngọt, chín cỡ trung bình khỏe mạnh và quả bị lỗi (quả bị thối mềm, bề mặt bị hư hỏng như vết thương) được thu mua từ chợ địa phương ở Zaria, bang Kaduna đã phân lập được 98 chủng nấm men từ quả cam bị lỗi và cam lên men tươi, khỏe mạnh Định danh các chủng nấm men bằng cách sử dụng AP120C AUX KIT (bioMèriux, Lyon, Pháp) cho thấy có 51 loài được xác định, đại diện cho 4 chi (32 loài từ nước cam tươi lên men thuộc chi Candida kruesi và Rhodotorula minuta, 19 loài từ nước cam bị lỗi thuộc chi Candida zeylanoides và Candida parapsilosis).
CÂY HỒNG QUÂN
Hồng quân có tên gọi khác nhƣ bồ quân, bù quân, mùng quân trắng hay mùng quân rừng (danh pháp khoa học: Flacourtia jangomas) là loài cây thuộc họ
Liễu sống trong các rừng mƣa trên núi hoặc ở vùng đất thấp Loài cây này đƣợc trồng nhiều ở Đông Nam Á và Đông Á, ở một số nơi đã trở thành cây hoang dã Cây này có thể có nguồn gốc từ châu Á có khí hậu nhiệt đới nhƣ tại Ấn Độ (Hanelt và cs., 2001; Chandra và cs., 2002)
Flacourtia jangomas cũng thường được gọi là mận cà phê Ấn Độ là một loại quả lạ, bán hoang dã và dùng làm dƣợc liệu bản địa (Dutta và cs., 2017) Cây có một số bộ phận làm thuốc cũng nhƣ giá trị kinh tế và đƣợc trồng chủ yếu để lấy quả ăn đƣợc và gỗ cứng Trái cây có thể ăn chín, ăn sống hoặc dùng để làm mứt và bảo quản (Mitra, 1993; Singh và cs., 1994) Các bộ phận khác nhau của cây cũng đƣợc sử dụng để điều trị bệnh (Jain, 1991)
Hiện tại, cây Hồng quân đƣợc phát triển rộng ở 2 huyện Tịnh Biên và Tri Tôn với diện tích trồng lớn và thường trồng xen dưới tán rừng và vườn đồi ở núi Dài Nhỏ, núi Két, núi Cấm, núi Cô Tô Vì đây là cây dễ trồng vừa chịu hạn, vừa thích nghi trong bóng râm, sau 5 năm sẽ cho trái và có độ tuổi từ 15 năm trở lên Mỗi năm ăn quả Hồng quân 2 vụ, vụ đầu mùa thu hoạch kéo dài 2 tháng, vụ sau chỉ thu hoạch đƣợc 1 tháng và sản lƣợng cũng ít hơn
Bảng 1 Phân loại khoa học của cây Hồng quân
Loài (species) Flacourtia jangomas (Lour.) Rausch
Tên khoa học khác: Flacourtia cataphracta Roxb ex Willd., Stigmarota jangomas Lour (Tripathi và cs., 2018)
Tên thường gọi: Mận Ấn Độ, Mận cà phê Ấn Độ (Tripathi và cs., 2018)
2.2.2 Hình thái và cấu tạo
Cây thuộc loại cây tầm trung, mộc lớn, rụng lá theo mùa, cây cao từ 5 – 10 m, phân nhánh thấp, thân và nhánh già thông thường thì không có gai nhọn, những nhánh non có gai nhọn, cứng, đơn hay chia nhánh, vỏ cây có màu từ nâu nhạt đến nâu đỏ và dễ bong ra thành từng mảng (Lim, 2013)
Lá đơn có hình bầu dục, hình trứng elip, hay hình trứng thuôn dài, kích thước
7 – 14 x 2 – 5 cm, đỉnh lá thuôn nhọn hay tù, bìa lá nguyên hay có răng cƣa thô, màng lá mỏng, nhẵn, không có lông, sáng bóng ở trên, mờ đục ở dưới, lá non có màu hồng nhạt đến màu nâu đỏ (Gupta và cs., 2012; Lim, 2013)
Quả có dạng hình cầu với kích thước từ 1,7 – 2,5 cm, quả khi tươi có màu xanh nhạt, đến khi chín có màu nâu đỏ hay tím, cuối cùng có màu đen nhạt Thịt quả có màu xanh nhạt đến vàng, có từ vị chua đến ngọt, chứa từ 4 – 10 hạt dẹt, cứng, hạt có màu vàng nhạt Quả đƣợc thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 12 trong năm (Gupta và cs., 2012; Lim, 2013)
2.2.3 Tác dụng dƣợc lý của quả Hồng quân
Quả có vị ngọt, chua và hơi chát, có tác dụng làm se niêm mạc dạ dày và ruột, trị tiêu chảy Nó đƣợc sử dụng để điều trị da bệnh, tiêu chảy, đau răng, vàng da hen suyễn và các khối u Quả Hồng quân theo truyền thống đƣợc coi là thuốc trị đái tháo đường Quả chín có hàm lượng chất xơ cao cùng với hàm lƣợng protein tốt, chất béo thấp và lƣợng acid béo không bão hòa đơn cao hơn
5 nhƣ so với acid béo không bão hòa đa Nó chứa đựng một lƣợng β-carotene tiếp theo là Lutein và Zeaxanthin, Retinol và Phylloquinone (vitamin K) rất quan trọng trong điều hòa Hemoglobin và Fibrinogen trong cơ thể con người
Bên cạnh đó, acid ascorbic (vitamin C) và niacin (vitamin B3) cũng hiện tại với số lƣợng đáng kể Quả chín chứa một lƣợng kali có một vai trò nhất định trong việc điều hòa máu áp suất tiếp theo là P và Mg có vai trò trong việc kiểm soát loãng xương Một số thành phần có hoạt tính sinh học trong quả Hồng quân đã đƣợc nghiên cứu cho thấy có các tính chất dƣợc lý khác nhau bao gồm giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn, chống tiêu chảy, kháng virus, chống oxy hóa và chống amylase (Jeyachandran, 2007, Das và cs., 2017)
2.2.4 Các sản phẩm và ứng dụng ngoài đời sống
Hiện nay, Hồng quân chủ yếu trồng lấy quả để ăn, ngâm rượu, làm nước trái cây, si-rô, mứt, dưa chua và được sử dụng trong tương ớt Khi quả hơi chín thì đƣợc sử dụng để làm thạch (Lim, 2013) Ở Bangladesh, quả Hồng quân đã đƣợc chế biến thành các sản phẩm và bày bán trên thị trường như: mứt dẻo, mứt cô đặc, nước ép và nước ép có bổ sung thịt quả (Rahman và cs., 2014).
NẤM MEN
2.3.1 Hình thái và cấu tạo tế bào nấm men
Hình dạng, kích thước tế bào nấm men thay đổi tuỳ loài, giống và điều kiện ngoại cảnh Chúng thường có dạng hình trứng, hình cầu, hình oval ellip, một số có dạng ellip kéo dài, hình tam giác, và một số dạng đặc biệt khác
Saccharomyces thường có dạng hình bầu dục trong môi trường nuôi cấy giàu dinh dƣỡng, trong điều kiện yếm khí có dạng hình tròn, trong điều kiện hiếu khí thì tế bào có hình dài hơn Kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 3 –
5 x 5 – 10 àm Ngoài ra, những nang bào tử của nấm men cũng cú dạng hỡnh cầu với kớch thước từ 2 – 4 àm (Lương Đức Phẩm, 2009)
2.3.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men
Nấm men có cấu tạo đơn bào gồm có: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất, nhân, và các cơ quan khác nhƣ không bào, các giọt mỡ, hạt glycogen… Ở một số nấm men, đặc biệt là nấm men trong sản xuất rƣợu vang, sản xuất bia, vỏ tế bào có khả năng kết dính, vì vậy chúng có thể kết với nhau và lắng xuống phía dưới gọi là men chìm Các chủng này có ý ngh a lớn trong nghề nấu bia và làm rƣợu vang vì làm cho dịch lên men trong, sáng Những nấm men không có khả năng kết lắng gọi là men nổi (Lương Đức Phẩm,
2.3.2 Sinh sản và sinh trưởng của nấm men
Nấm men có hai hình thức sinh sản là sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính:
− Sinh sản hữu tính: Nấm men hình thành bào tử túi ở các chi
Saccharomyces, Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ
− Sinh sản vô tính: Chủ yếu bằng hình thức nảy chồi (diễn ra ở hầu hết các chi nấm men), hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces), bằng bào tử (ở chi Geotrichum, Sporobolomyces, Candida albicans) (Nguyễn Lân
Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ sinh sản cho đến cơ chất dinh dưỡng cần thiết ở trong môi trường giảm tới mức thấp nhất Khi đó sinh trưởng phát triển của chúng chậm dần và ngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần phân chia tiếp, nhưng sự tăng sinh khối không đáng kể (Lương Đức Phẩm, 2009)
Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men được chia làm 4 pha:
– Pha tiềm phát: Đây là giai đoạn nấm men mới được cấy vào môi trường còn chưa sinh sản Vận tốc sinh trưởng coi như bằng không, nấm men còn thích nghi với môi trường mới
– Pha logarit: Trong pha này hầu hết thời gian nấm men sẽ phát triển số lƣợng tế bào theo cấp số nhân với tốc độ sinh trưởng là cực đại
– Pha ổn định: Trong pha này tế bào sống là ổn định và mật độ quần thể là tối đa Cũng có ngh a là số lƣợng tế bào sinh ra bằng số lƣợng tế bào chết đi – Pha suy vong: Các tế bào sống giảm dần và tế bào chết tăng lên, một số tế bào chất bị tự phân do các enzym proteaza nội bào Các tế bào sống trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện dạng hạt
2.3.3 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Oxy: là thành phần quan trọng trong giai đoạn phát triển sinh khối của tế bào nấm men Tuy nhiên nó là nguyên nhân gây hƣ hỏng sản phẩm trong công đoạn tiếp theo Lên men nước trái cây là một quá trình lên men yếm khí, nhƣng lên men trong giai đoạn đầu cần phải cung cấp oxy cho dịch lên men để nấm men sinh trưởng và phát triển (tăng sinh khối) Nhưng oxy chỉ cần thiết ở giai đoạn đầu, khi dịch lên men đã đạt đủ số lƣợng tế bào nấm men, thì ngăn chặn dịch lên men tiếp xúc với oxy để nấm men tiến hành quá trình lên men chuyển hóa đường thành cồn và CO2 (Nguyễn Đình Thưởng, 2000) Đường: là cơ chất của nấm men, được nấm men sử dụng trong quá trình lên men để chuyển hóa thành CO 2 , rượu và các sản phẩm phụ tạo hương vị khác Nấm men có thể sử dụng đường hexose (đường 6 cacbon) như glucose, fructose… và các olygosaccharide nhƣ saccharose, maltose, lactose Nấm men không sử dụng pentose (đường 5 cacbon) và không phân giải các loại đường có trên 18 cacbon do không có hệ enzyme amylase để thủy phân (Nguyễn Đình Thưởng, 2000)
Hàm lượng đường thấp sẽ không cung cấp đủ cơ chất cho nấm men sử dụng Khi đó, hiệu suất lên men không cao và không đạt đƣợc mục đích của quá trình lên men Tuy nhiên, hàm lượng đường quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu, dẫn tới làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Do vậy, hiệu
9 quả lên men cũng không được đảm bảo (Nguyễn Đình Thưởng, 2000)
Nhiệt độ: Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ phát triển tối ƣu Đây là nhiệt độ mà vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và hoạt động mạnh mẽ nhất Nhiệt độ tối ưu của nấm men Saccharomyces nằm trong khoảng 28 – 32 o C Ở nhiệt độ cao hơn, hoạt tính của nấm men giảm Đồng thời, nhiệt độ cao cũng tạo điều kiện nhiễm tạp các vi sinh vật khác vào quá trình lên men Ở nhiệt độ 35 – 38 o C, nấm men hoang dại phát triển nhanh gấp 6 – 8 lần so với Saccharomyces
(Nguyễn Đình Thưởng, 2000) pH môi trường: Nồng độ ion H + trong môi trường có ảnh hưởng lớn tới hoạt động của nấm men Sự có mặt của ion H + có khả năng làm thay đổi điện tích của các chất trong vỏ tế bào Điều này dẫn đến làm làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng Khi đó, sự sinh trưởng, phát triển của nấm men bị tác động và do đó ảnh hưởng tới chiều hướng của quá trình lên men (Nguyễn Đình Thưởng, 2000) Đối với quá trình lên men, pH tối ƣu là 4,5 – 5,0 Nếu tăng độ pH, quá trình lên men sẽ dễ bị nhiễm khuẩn hơn Bên cạnh đó, lên men ở pH cao sẽ sinh ra nhiều sản phẩm phụ hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men tạo rƣợu Quá trình lên men diễn ra ở pH thấp hơn 4,2 sẽ làm giảm hoạt động của nấm men Tuy nhiên, ở điều kiện pH này, các tạp khuẩn hầu nhƣ không phát triển Do vậy, tùy thuộc vào mục đích của quá trình lên men mà có thể điều chỉnh pH cho phù hợp (Nguyễn Đình Thưởng, 2000) Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men một loại axit không gây ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men Thực tế người ta sử dụng axit citric và NaHCO3 để điều chỉnh pH (Nguyễn Đình Thưởng, 2000) Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung: Vi sinh vật để sinh trưởng và phát cần có hai nguồn dinh dƣỡng chính: đó là dinh dƣỡng cacbon và dinh dƣỡng nitơ Nếu thiếu nitơ, nấm men sẽ phát triển chậm, dẫn đến thời gian lên men kéo dài, hiệu suất lên men giảm Để nấm men sinh trưởng và phát triển tốt, lượng nitơ hòa tan trong môi trường lên men phải nằm trong khoảng 0,35 – 0,4 g/L Trong trường hợp môi trường lên men không đủ hàm lượng nitơ yêu cầu, cần bổ sung thêm các hợp chất chứa nitơ (Trần Thị Thanh, 2001)
Ngoài ra, để sinh trưởng và phát triển tốt, nấm men cũng cần được cung cấp đủ các nguyên tố khoáng và vi lƣợng Đây là các nguyên tố tham gia vào cấu trúc tế bào nấm men và là thành phần của các enzyme, chất kích thích sinh trưởng giúp nấm men phát triển (Trần Thị Thanh, 2001)
Nồng độ cồn và CO 2 : Có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và khả năng lên men của nấm men Sự sinh trưởng của nấm men bị kìm hãm khi nồng độ cồn trong môi trường lên men là 1% (v/v), từ 4 – 6% (v/v) có ảnh hưởng xấu Đa số nấm men sinh trưởng được ở môi trường có nồng độ cồn là 12 – 14% (v/v), chỉ có một số ít lên men đƣợc ở nồng độ cồn cao từ 17 – 20% (v/v) Khí CO 2 ức chế sự lên men nhưng việc thoát khí CO 2 sẽ làm cho môi trường lên men luôn chuyển động, kéo dài trạng thái lơ lửng của tế bào nấm men nên có thể làm tăng quá trình lên men (Nguyễn Đình Thưởng, 2000)
Số lượng tế bào nấm men: Lượng nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men Nếu số lƣợng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra hiệu quả và hiệu suất thu hồi cao, chất lƣợng sản phẩm tốt Nếu số lƣợng tế bào nấm men cho vào quá ít thì tốc độ lên men chậm Sinh khối tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ dinh dƣỡng cho nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ dần chết và làm cho sản phẩm có mùi lạ, đồng thời cũng làm phí một lƣợng nấm men đáng kể (Trần Thị Thanh, 2001)
2.3.4 Những đặc điểm nấm men cần tuyển chọn
ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ
2.4.1 Các phương pháp ly trích DNA
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lƣợng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Mối quan tâm hàng đầu của các k thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ) Các nucleic acid cần đƣợc tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease - RNase) (Mariyam Dairawan và cs., 2020)
2.4.1.2 Các phương pháp ly trích
Tách chiết cột là phương pháp cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch DNA cao Nguyên tắc tách chiết cột Silica dựa trên hoạt động của muối Chaptropic (bao gồm Guanidine HCl, Guanidine thiocyanate, Urea, và Lithium perchlorate) sẽ làm mất ổn định liên kết Hydro, lực Van Der Walls và tương tác kị nước tạo điều kiện để chuyển acid nucleic lên màng Silica Sau đó tiến hành rửa các thành phần tạp nhiễm còn sót lại trên màng và ly tâm làm khô cột Cuối cùng thu nhận acid nucleic tinh sạch nhằm mục đích sử dụng tiếp theo hoặc lưu trữ ở - 20 o C Quy trình chung thường thực hiện như sau:
− Ly giải tế bào: Tùy thuộc vào thành phần và tính chất của mẫu tách chiết khác nhau và mục tiêu tách chiết DNA hay RNA mà sử dụng các loại đệm ly giải phù hợp với mẫu tách chiết Sau đó bổ sung Proteinase K và ủ ở 72 oC nhằm hỗ trợ phá màng tế bào và tách acid nucleic ra khỏi thành phần Protein của tế bào (Woodard D và cs., 1993)
− Quá trình gắn: Sau quá trình tách acid nucleic hỗn hợp sau ly giải đƣợc chuyển lên cột Silica Lúc này, các muối Chaotropic nồng độ cao hỗ trợ quá trình gắn acid nucleic lên màng Các thành phần tạp nhiễm khác không thể gắn lên màng nên được loại bỏ thông qua bước ly tâm Trong quá trình này Ethanol nồng độ cao thường được bổ sung để hỗ trợ quá trình gắn tế bào đạt chất lƣợng tốt hơn (Woodard D và cs., 1993)
− Quá trình rửa: Sau khi gắn acid nucleic lên màng tiến hành bước rửa giúp loại bỏ các thành phần không sạch nhằm thu nhận acid nucleic tinh sạch Thông thường có hai lần rửa trong đó dung dịch rửa lần một thường có một lƣợng nhỏ muối Chaotropic nhằm loại bỏ Protein và các chất màu Tiếp đó
15 sẽ là bước rửa Ethanol 70% để loại bỏ muối và các thành phần còn sót lại
− Làm khô cột: Sau bước rửa bằng Ethanol, hầu hết các quy trình đều có một bước ly tâm để là làm khô cột Việc này giúp loại bỏ Ethanol còn sót lại và cần thiết để quá trình rửa giải đƣợc tốt hơn (Woodard D và cs., 1993)
− Quá trình rửa giải (Elution): Bước cuối cùng của quy trình là giải phóng các DNA hoặc RNA khỏi màng Silica Dung dịch ly giải EB đƣợc bổ sung giúp thu nhận acid nucleic tinh sạch và bảo quản ở - 20 o C phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo (Woodard D và cs., 1993)
Năm 1953, Grassmann và Deffner phát hiện rằng phenol là chất thích hợp để chiết xuất protein từ dung dịch nước Kirby (1956), báo cáo Phenol ở các điều kiện pH khác nhau cho phép phân tách DNA và RNA ra khỏi protein Ngay sau đó, 1957, Kirby tìm thấy rằng sự có mặt của muối anion (ví dụ p – aminosalicylate và Natri benzoate) giúp tăng lƣợng DNA và RNA trong quá trình tách chiết / ly trích Ngày nay, phương pháp Kirby tiếp tục được sử dụng với sự bổ sung một số chất hỗ trợ khác nhƣ chất tẩy rửa anion SDS, Chloroform và Isoamyl alcohol Phương pháp tách chiết / ly trích DNA bằng Phenol – Chloroform đƣợc giới thiệu vào năm 1998 bởi Barker và cộng sự (Elkins K và cs., 2013)
Tách chiết / ly trích bằng Phenol là phương pháp ly trích ra đời sớm nhất, vẫn được sử dụng trong các phòng thí nghiệm và được xem là phương pháp ly trích cơ bản thích hợp cho nhiều đối tƣợng mẫu
Nguyên tắc: Phenol là chất biến tính protein mạnh đóng vai trò phá hủy các protein màng, enzyme phân hủy DNA, RNA Phenol không hòa tan acid nucleic, khi xử lý với hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein… Sau khi ly tâm, mẫu xử lý sẽ phân tách thành hai lớp: Lớp dưới là phenol, lớp trên là nước chứa DNA và RNA, phần protein bị biến tính sẽ nằm ở bề mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ DNA trong phần dịch nổi ở trên sẽ đƣợc tách chiết bằng cách tủa với Isopropanol có bổ sung chất trợ tủa (Sodium acetat) Muối dƣ thừa đƣợc rửa sạch với Ethanol 70% Ly tâm, hong khô bằng nhiệt để loại bỏ Ethanol Sau đó DNA đƣợc hòa tan với đệm TE hoặc nước cất vô trùng
Việc sử dụng Guanidinium isothiocyanate trong chiết xuất RNA lần đầu tiên được đề cập bởi Ulrich và cs., 1977 Phương pháp này tốn nhiều công sức Do đó, nó đã được thay thế bằng kỹ thuật một bước, được gọi là tách chiết / ly trích Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform bởi Chomczynski và Sacchi năm 1987 Nguyên tắc của kỹ thuật một bước này là RNA được tách
16 khỏi DNA sau khi chiết xuất bằng dung dịch axit bao gồm Guanidinium thiocyanat, Natri axetat, Phenol và Chloroform Trong điều kiện axit, RNA tổng số sẽ vẫn ở trong pha nước phía trên của toàn bộ hỗn hợp, trong khi DNA và protein vẫn ở trong pha giữa hoặc pha hữu cơ thấp hơn Việc thu hồi RNA tổng số sau đó đƣợc thực hiện bằng cách kết tủa với Isopropanol (Elkins K,
Phương pháp Phenol – Chloroform là tiêu chuẩn vàng cho tách chiết / ly trích DNA Nó có thể đƣợc sử dụng để tách chiết DNA từ máu, nuôi cấy huyền phù hoặc đồng nhất mô Nó cung cấp năng suất cao và tương đối rẻ Tuy nhiên, bản chất độc hại của Phenol và Chloroform đòi hỏi phải sử dụng tủ hút và là hạn chế lớn của phương pháp này Các mẫu DNA tách chiết có độ tinh khiết cao hơn so với các phương pháp thông thường nhưng thấp hơn so với các mẫu thu được bằng phương pháp cột (Dhaliwal A, 2013)
2.4.2 PCR trong định danh vi sinh vật
Phương pháp PCR do Karl Mullis và cs phát minh vào năm 1985, là một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử Đây là một k thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống Hiện nay, PCR đã trở thành một k thuật thông dụng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dƣợc để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen (Trương Bích Như, 2017)
PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này đƣợc kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược (Trương Bích Như,
2.4.3 Xây dựng cây phát sinh loài
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thời gian: từ tháng 2 – 5 năm 2023 Địa điểm: được thực hiện tại khu thí nghiệm – trung tâm của Trường Đại học
Quả Hồng quân sẽ đƣợc thu thập tại các khu vực thuộc huyện Tịnh Biên, Tri Tôn, tỉnh An Giang, đảm bảo tươi và không dập nát hay thối hỏng Sau khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm, quả Hồng quân đƣợc chọn lựa sơ bộ và đem đi rửa sạch, để ráo nước và đem đi cắt lát mỏng, tiến hành lên men nước Hồng quân
3.1.3 Dụng cụ nghiên cứu Ống nghiệm có nắp Ống đong
Micropipette: 100 μL, 1000 μL Đầu col tương ứng
Bình định mức: 100 mL, 500 mL
Bình tam giác: 250 mL, 500 mL, 1000 mL, 2000 mL
Cùng với một số dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm
Máy đo quang phổ UV – vis
Kính hiển vi quang học
Cùng một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm
3.1.5 Hóa chất, môi trường nghiên cứu
Và một số hóa chất khác
Bảng 2 Thành phần môi trường thạch PDA
Thành phần hóa chất Hàm lƣợng (g/L)
Nước cất vừa đủ 1000 mL
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ một số nấm men từ dịch lên men nước Hồng quân
Chọn những dòng nấm men phân lập từ lên men nước quả Hồng quân
3.2.1.2 Cách thực hiện thí nghiệm
− Xử lý nguyên liệu, rửa sạch quả Hồng quân để loại bỏ tạp chất bên ngoài và để ráo nước
− Cân 250g Hồng quân đem đi cắt lát mỏng, bổ sung đường đạt độ 21 o Brix để lên men Khuấy đều và tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, các chủng nấm men có sẵn trong dịch quả sẽ phát triển để sẵn sàng phân
− Chuẩn bị môi trường phân lập : PDA trong đ a Petri
− Hút 0,1 mL dịch quả cấy trải trên môi trường PDA
− Đem đ a ủ ở 30 o C trong 48 giờ Sau khi ủ, chọn những khuẩn lạc rời điển hình cấy ria sang môi trường PDA Quan sát bằng mắt thường, nhận diện khuẩn lạc đơn lẻ, trắng đục hoặc trắng trong tiếp tục cấy truyền Sau đó quan sát dưới kính hiển vi để xác định độ ròng (Guimarães T M và cs., 2006; Maragatham và cs., 2011)
− Tiến hành trữ giống ở 4 o C và định danh sơ bộ một số nấm men vừa phân lập đƣợc theo khóa phân loại của Nguyễn Đức Lƣợng (2006)
+ Màu sắc: trắng đục, trắng trong
+ Các đặc điểm khuẩn lạc: rìa nguyên, bìa nguyên, bề mặt hơi sần, nhô cao + Đường kính khuẩn lạc: 1 – 3 mm
+ Hình dạng tế bào: hình cầu, hình oval, hình tròn, elip
3.2.2 Thí nghiệm 2: Tuyển chọn các dòng nấm men lên men sinh khí CO 2 trong ống Durham
Xác định dòng nấm men có hoạt lực lên men sinh khí CO 2 cao nhất
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 chủng nấm men đã phân lập từ thí nghiệm 1 đƣợc ký hiệu là M1, M2, M3, M4, M5
Nhân tố 2: đường được ký hiệu (Glucose = G và Saccharose = S)
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần: 5 x 2 x 3 = 30 (đơn vị thí nghiệm)
3.2.2.3 Cách thực hiện thí nghiệm
– Giống nấm men phân lập đƣợc ở thí nghiệm 1 đem tăng sinh trong 100 mL môi trường PDB (đã khử trùng ở 115 o C trong 10 phút), lắc và ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng
− Lấy 1 mL dung dịch nấm men cho vào ống nghiệm có chứa 9 mL dung dịch đường Saccharose
− Với đường Glucose, cũng lấy 1 mL dung dịch nấm men cho vào ống
21 nghiệm có chứa 9 mL dung dịch đường Glucose
− Khả năng lên men của nấm men là đo chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống Durham úp ngƣợc tại các thời điểm 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 và
24 giờ ủ Dòng nấm men có hoạt tính cao là dòng nấm men có chiều cao cột khí CO 2 sinh ra nhanh và cao nhất (Nguyễn Văn Thành và cs., 2013)
− Chiều cao cột khí ống Durham tại các thời điểm
− Độ Brix trước và sau khi lên men
3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn
3.2.3.1 Mục đích nghiên cứu Đánh giá khả năng lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn trong dịch quả Hồng quân
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 chủng nấm men đã tuyển chọn từ thí nghiệm 2
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần: 3 x 3 = 9 (đơn vị thí nghiệm)
3.2.3.3 Cách thực hiện thí nghiệm
– Giống nấm men đã tuyển chọn ở thí nghiệm 2 đem tăng sinh trong 100 mL môi trường PDB, lắc và ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng
– Chuẩn bị bình lên men
– Bổ sung đường vào dịch quả Hồng quân để đạt 21 o Brix, pH = 4,5
– Hút 2,5 mL dung dịch nấm men với mật số 10 7 tế bào/mL cho vào bình lên men có chứa dịch nước Hồng quân, lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng
– Độ cồn sau khi chƣng cất
– Độ Brix trước và sau khi lên men
– Độ pH trước và sau khi lên men
Định danh dòng nấm men tuyển chọn
Dòng nấm men sau khi đƣợc tuyển chọn sẽ đƣợc đem đi giải trình tự ở Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa với quy trình thực hiện được tham khảo ở phần phụ lục D
THỐNG KÊ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
Kết quả từ các thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel và phần mềm IBM SPSS Statistic 20 Các giá trị trung bình đƣợc so sánh bằng kiểm định Duncan