Phân lập và định danh một số nấm mốc sinh độc tố trong không khó môi trường lao động

Khoa Công nghệ Sinh học Lê Thị Hà LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới ThS Vũ Duy Thanh KS Lê Anh Thư, Phòng Giám sát Phân Tích Mơi Trường Lao Động, Trạm Quan Trắc Phân tích mơi trường lao động tận tình hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu hồn thành khố luận Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể khoa học Phịng Giám sát Phân tích mơi trường lao động, Trạm quan trắc phân tích mơi trường lao động trực thuộc Viện nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Bảo hộ lao động tạo điều kiện cho thực khố luận Nhân dịp tơi xin cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội giúp đỡ q trình học tập trang bị cho tơi kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học Cuối tơi muốn bày tỏ lịng cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, tạo điều kiện vật chất tinh thần cho thời gian qua Hà Nội, ngày tháng năm Sinh Viên Lê Thị Hà Khoa Công nghệ Sinh học Lê Thị Hà DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT SA Sabouraud Dextrose Agar CAM Coconut Agar Medium ADM Aspergillus Differentiation Medium Base A fumigatus Aspergillus fumigatus A flavus Aspergillus flavus A niger Aspergillus niger A aureus Aspergillus aureus A nidulans Aspergillus nidulans A versicoler Aspergillus versicolor A terreus Aspergillus terreus A keratitis Aspergillus keratitis CFU Colony Forming Unit ACGIH American conference of gov-ernmental industrial hygienists DD Môi trường dinh dưỡng ppb Parts per billion RCS Rich Communication Service SAS Surface air system FS209E Federal Standard 209E ISO International Organization for Standardization CEN/TC 243 Tiêu chuẩn phòng ODTS Hội chứng độc hại bụi hữu GMP Good Manufacturing Practices WHO World Health Organization TVKHK Tổng vi khuẩn hiếu khí Khoa Cơng nghệ Sinh học Lê Thị Hà DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Tên bảng Trang Kết lấy mẫu tổng số nấm mốc 25 Bảng Nghiên cứu theo dõi hình thái đại thể chủng Bảng nấm A5.2 môi trường dinh dưỡng khác 31 SA, CAM, PDA, Czapek Nghiên cứu theo dõi hình thái đại thể chủng Bảng nấm A9 môi trường dinh dưỡng khác 33 SA, CAM, PDA, Czapek Nghiên cứu theo dõi hình thái đại thể chủng Bảng nấm A14 môi trường dinh dưỡng khác 35 SA, CAM, PDA, Czapek Nghiên cứu theo dõi hình thái đại thể chủng Bảng nấm A6 môi trường dinh dưỡng khác 37 SA, CAM, PDA, Czapek Nghiên cứu theo dõi hình thái đại thể chủng Bảng nấm A5 môi trường dinh dưỡng khác 39 SA, CAM, PDA, Czapek Nghiên cứu theo dõi hình thái đại thể chủng Bảng nấm A5 môi trường dinh dưỡng khác 51 SA, CAM, PDA, Czapek Thống kê số khuẩn lạc chủng nấm mốc Bảng khơng khí mơi trường lao động phân lập 53 Khoa Công nghệ Sinh học Lê Thị Hà DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình thiết bị lấy mẫu khơng khí Spin Air Hình trường lấy mẫu 25 Hình chủng A5.2 mơi trường SA 27 Hình chủng A9 mơi trường SA 28 Hình chủng A14 mơi trường SA 28 Hình chủng A5 mơi trường SA 29 Hình chủng A6 mơi trường SA 29 Hình chủng A11 mơi trường SA Hình chủng A15 mơi trường SA Hình 10 vi thể A5.2 soi vật kính 4X 41 Hình 11 quan sinh sản A5.2 soi vật kính 40X 41 Hình 12 vi thể A9 soi vật kính 4X 42 Hình 13 quan sinh sản A9 soi vật kính 40X 42 Hình 14 vi thể A14 soi vật kính 4X 43 Hình 15 quan sinh sản A14 soi vật kính 40X 43 Hình 16 trình tự gen mẫu A14 45 Hình 17 so sánh trình tự gen mẫu A14 với Genbank 46 Hình 18 trình tự gen mẫu A5.2 47 Hình 19 so sánh trình tự gen mẫu A5.2 với Genbank 48 Hình 20 trình tự gen mẫu A9 49 Hình 21 so sánh trình tự gen mẫu A9 với Genbank 50 Khoa Công nghệ Sinh học Lê Thị Hà MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU .1 1.1 Nghiên cứu giới nấm mốc khơng khí mơi trường lao động 1.1.1 Ô nhiễm nấm mốc khơng khí mơi trường lao động sở chế biến lương thực 1.1.2 Phương pháp lấy mẫu nấm mốc gây hại khơng khí môi trường lao động 1.1.3 Nguy gây hại cho người lao động chủng nấm mốc có khơng khí 1.2Nghiên cứu Việt Nam nấm mốc khơng khí môi trường lao động 12 1.2.1 Ơ nhiễm nấm mốc khơng khí mơi trường lao động 12 1.2.2 Phương pháp lấy mẫu nấm mốc gây hại khơng khí mơi trường lao động Việt Nam 15 1.2.3 Nguy gây hại cho người lao động chủng nấm mốc có khơng khí 17 PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2Hóa chất thiết bị nghiên cứu 18 2.2.1 Hóa chất 18 Khoa Công nghệ Sinh học 2.2.2 Lê Thị Hà Thiết bị nghiên cứu 19 2.3Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu nấm mốc khơng khí mơi trường lao động 20 2.3.3 Phương pháp xác định tính độc hại nấm mốcError! Bookmark not defined PHẦN 3: KẾT QUẢ 25 3.1Kết lấy mẫu nấm mốc không khí mơi trường lao động 25 3.1.1 Mật độ nấm mốc có mặt khơng khí mơi trường lao động 25 3.1.2 Phân lập nấm mốc gây hại 28 3.2Kết định danh số chủng nấm mốc gây hại có mặt khơng khí mơi trường lao động Error! Bookmark not defined 3.2.1 Xác định đặc điểm sinh học đại thể nấm mốc gây hại Error! Bookmark not defined 3.2.2 Xác định đặc điểm sinh học vi thể nấm mốc gây hại 42 3.2.3 Xác định phương pháp sinh học phân tử 47 3.4 Đề xuất giải pháp phòng chống nấm mốc, giảm thiểu nguy gây hại nấm mốc có mơi trường lao động 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU Việt Nam nước nơng nghiệp điển hình với 70% dân số nông dân, xuất gạo đứng thứ giới (sau Thái Lan Ấn Độ) Sản xuất nông nghiệp lĩnh vực sản xuất quan trọng phát triển Việt Nam Theo thống kê nhất, nước có 197 làng nghề chế biến nông sản thực phẩm Các làng nghề chủ yếu tập trung miền Bắc (134 làng), lại 42 làng nghề miền Trung miền Nam có 21 làng nghề Theo kết khảo sát 52 làng nghề điển hình nước, 46% số làng nghề có mơi trường (khơng khí, nước, đất ba dạng trên) bị ô nhiễm nặng 27% ô nhiễm vừa Hiện nay, ô nhiễm môi trường làng nghề tiếp tục có diễn biến phức tạp Với điều kiện khí hậu nhiệt đới thuận lợi cho nấm mốc phát triển, Việt Nam phát nhiều loại nấm mốc không khí sinh độc tố gây hại, phổ biến thực phẩm Hiện nay, với phát triển công nghiệp, nhiều sở sản xuất chế biến lương thực nhỏ lẻ mọc lên Những sở thường có trang thiết bị lạc hậu tạo sản phẩm khơng hợp vệ sinh an tồn thực phẩm Sự phát triển làng nghề chế biến lương thực, thực phẩm diễn cách tự phát Mở rộng sản xuất tuỳ tiện, khơng có quy hoạch, trình độ cơng nghệ cịn thấp Thêm vào tâm lý thói quen sản xuất quy mơ nhỏ, khép kín, nên hạn chế đầu tư trang thiết bị đổi công nghệ, dẫn đến hiệu sản xuất không cao, tiêu tốn nhiều nguyên nhiên liệu, đồng thời thải môi trường lượng lớn chất thải, đặc biệt nước thải giàu chất hữu Mặt khác, phần lớn làng nghề chế biến nông sản thực phẩm tận thu phế liệu để chăn nuôi Nước thải từ nguồn gây ô nhiễm mơi trường khơng khí nước đáng kể Kết điều tra y tế làng nghề chế biến nông sản, thực phẩm cho thấy rõ ảnh hưởng từ sản xuất nghề tới sức khoẻ người dân Các bệnh phổ biến mà người dân làng nghề mắc phải bệnh phụ khoa phụ nữ (13 - 38%), bệnh đường tiêu hoá (8 - 30%), bệnh viêm da (4,5 - 23%), bệnh đường hô hấp (6 18%), đau mắt (9 - 15%) Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu môi trường sinh hoạt không đảm bảo vệ sinh, nguồn nước khan hiếm, ô nhiễm bụi, vi sinh vật nói chung nấm mốc khơng khí nói riêng tăng cao Những ngun nhân gây bệnh cho người chất lượng nông sản thực phẩm khơng đảm bảo quan tâm nghiên cứu tìm giải pháp giảm thiểu Tuy nhiên, đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Việt Nam điều kiện tối ưu để vi sinh vật, nấm mốc dễ dàng phát triển gây hại đến đối tượng thường xuyên tiếp xúc (người sản xuất, người lao động người tiêu dùng) Ảnh hưởng nấm mốc khơng khí làng nghề chế biến lương thực đến người lao động cộng đồng chưa nghiên cứu chuyên sâu Xuất phát từ vấn đề trên, đồng thời tham gia nghiên cứu đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu phân lập định danh phương pháp sinh học phân tử số nấm mốc gây hại khơng khí mơi trường lao động” Trạm Quan trắc Phân tích Mơi trường Lao động - Viện Nghiên cứu Khoa học Kỹ thuật Bảo hộ Lao động, đồng ý hướng dẫn Th.s Vũ Duy Thanh, tiến hành đề tài:“Phân lập định danh số nấm mốc sinh độc tố khơng khí mơi trường lao động” Mục tiêu nghiên cứu: - Xác định đặc điểm sinh học mức độ nguy hại số chủng nấm mốc có mặt khơng khí mơi trường lao động Nội dung nghiên cứu: - Xác định đặc điểm sinh học số chủng nấm mốc sinh độc tố có khơng khí mơi trường lao động - Xác định nguy cơ, rủi ro nấm mốc sinh độc tố có khơng khí người lao động cộng đồng PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Nghiên cứu giới nấm mốc khơng khí mơi trường lao động 1.1.1 Ơ nhiễm nấm mốc khơng khí mơi trường lao động sở chế biến lương thực Thế giới quan tâm nhiều đến tồn phát tán vi sinh vật khơng khí, mơi trường khơng khí môi trường dinh dưỡng, vi sinh vật khơng thể sinh trưởng được, khơng mà mơi trường khơng khí khơng nhiễm Sự tồn phân tán vi sinh vật không khí hiểm họa tiềm tàng gây loại bệnh, có bệnh hiểm nghèo, tạo đà bùng phát dịch bệnh Viện Nghiên cứu quốc gia sức khỏe an toàn lao động Mỹ (NIOSH) đưa phương pháp lấy mẫu bioaerosol cho vùng khơng khí nhà (indoor air) từ năm 1998 (Method NIOSH) Quan trắc vi khuẩn nấm mốc khơng khí khơng đánh giá chất lượng mơi trường khơng khí khu vực mà cịn phát sớm nguồn gốc có nguy nhiễm bệnh, nhằm phòng chống gây bệnh vi sinh vật gây nguy ngộ độc thực phẩm phát tán vi khuẩn, nấm nấm mốc khơng khí Ở Thái Lan, vào năm 1976 nhóm nghiên cứu Shank cho thấy mẫu lương thực thực phẩm bị mốc 50-60% có Aflatoxin Đồng thời nhóm tác giả cịn tiến hành lấy mẫu lương thực thực phẩm gia đình thấy 30-50% số mẫu có độc tố Aflatoxin Năm 2004, nghiên cứu Ablas K cộng cho thấy nhiễm Aflatoxin ngô nấm A Flavus gây nên vấn đề quan trọng vùng trồng ngô đồng Missisipi Mỹ Trong năm nghiên cứu từ 2000 đến Hình 11: quan sinh sản A5.2 soi vật kính 40X Đối với mẫu A9 kích thước khuẩn lạc lớn dẫn đến có khả kích thước bào tử lớn, dễ quan sát vi thể soi trực tiếp kính hiển vi quang học vật kính 4X Nghiêm cứu sử dụng phương pháp cắt thạch 40x Kết quan sát cho thấy quan sinh sản A9 có đầu nhiều, mọc từ chất, dạng hình cầu, tỏa tia, sau xé rách, màu đen nâu Cuống nhẵn màu nâu, bào tử hình trịn màu đen Theo kết quan sát vi thể trên, nhận thấy A9 có đặc điểm gần trùng khớp với mô tả TS Đặng Vũ Hồng Miên “Hệ nấm mốc Việt Nam”, kết định danh sơ mẫu A9 Aspergillusniger Hình 12: vi thể A9 soi vật kính 4X 44 Hình 13: quan sinh sản A9 soi vật kính 40X Mẫu A14 kích thước khuẩn lạc nhỏ, bề mặt khuẩn lạc mịn, dày nên khó quan sát vi thể soi trực tiếp kính hiển vi quang học Lựa chọn phương pháp cắt thạch để quan sát mẫu vật kính 40X Kết thu sợi nấm dinh dưỡng nhẵn, có phân nhánh, màu xanh đen, mọc từ môi trường Cuống phân nhánh tạo nhiều nhánh bên Bào tử hình cầu, dạng chuỗi Qua kết quan sát vi thể trên, thấy A14 có đặc điểm gần trùng khớp với mơ tả TS Đặng Vũ Hồng Miên “Hệ nấm mốc Việt Nam”, kết định danh sơ mẫu A14 Trichodermma Hình 14: vi thể A14 soi vật kính 4X 45 Hình 15: quan sinh sản A14 soi vật kính 40X 46 3.Xác định phương pháp sinh học phân tử Định danh phương pháp quan sát đại thể quan sát vi thể đãđịnh danh chủng nấm mốc có mặt khơng khí mơi trường lao động sở chế biến lương thực Để khẳng định xác chủng nấm mốc dùng phương pháp sinh học phân tử có độ xác cao Để có kết xác, mang mẫu phân tích PHỊNG XÉT NGHIỆM CT.TNHH DV VÀ TM NAM KHOA Trong nghiên cứu thực giải trình tự gen chủng nấm mốc phân lập khơng khí mơi trường lao động công ty liên doanh Việt-Pháp sản xuất thức ăn gia súc Proconco, nhà máy Đình Vũ Hải Phịng Kết giải trình tự gen trình bày 47
MẫuA14 Hình 16: trình tự gen mẫu A14 Trichoderma koningiopsis strain CCF3813 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: FJ430784.1Length: 1140Number of Matches: Related Information Range 1: to 742GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1371 bits(742) 0.0 742/742(100%) 0/742(0%) Plus/Minus Query CGGTGGCCAGCCAGACGGGGCTCTCACCCTCTGTGGCGTCCCGTTCCAGGGAACTCGGGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 742 CGGTGGCCAGCCAGACGGGGCTCTCACCCTCTGTGGCGTCCCGTTCCAGGGAACTCGGGC 683 48 Query CGGTGGCCAGCCAGACGGGGCTCTCACCCTCTGTGGCGTCCCGTTCCAGGGAACTCGGGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 742 CGGTGGCCAGCCAGACGGGGCTCTCACCCTCTGTGGCGTCCCGTTCCAGGGAACTCGGGC 683Query GGCACCTCACCAAAAGCATCCTCTACAAATTACAACTCGGACCCTAGGGGCCAGATTTCA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 682 GGCACCTCACCAAAAGCATCCTCTACAAATTACAACTCGGACCCTAGGGGCCAGATTTCA 623 Query 121 AATTTGAGCTGTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGGGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTC 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 622 AATTTGAGCTGTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGGGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTC 563 Query 181 CTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATT 240 Sbjct 562 CTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATT 503 Query 241 TCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCAAA 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 502 TCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCAAA 443 Query 301 CTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGGATCCCGTC 360 Sbjct 442 CTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGGATCCCGTC 383 Query 361 TTAGGGGTTCCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGC 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 382 TTAGGGGTTCCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGC 323 Query 421 TCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGA 480 Sbjct 322 TCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGA 263 Query 481 TTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 262 Query 541 TTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCC 203 AGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGT 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 202 AGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGT 143 Query 601 AAGAAATAACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTCCCTCCGGCGGGCGC 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 142 Query 661 AAGAAATAACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTCCCTCCGGCGGGCGC 83 CTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTATG 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82 CTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTATG Query 721 GTTCACATTGGGTTTGGGAGTT 23 742 |||||||||||||||||||||| Sbjct 22 GTTCACATTGGGTTTGGGAGTT Hình 17: so sánh trình tự gen mẫu A14 với Genbank 49 Kết định danh phương pháp sinh học phân tử cho thấy mẫu A14 có độ tương đồng 100% so với chủng nấmTrichoderma koningiopsis Kết hợp với so sánh đặc điểm hình thái khẳng định chủng nấm Trichoderma koningiopsis
Mẫu A5.2 Hình 18: trình tự gen mẫu A5.2 Penicillium citrinum genomic DNA sequence contains ITS1, 5.8S rRNA gene,ITS2, 28S rRNA gene, strain DI16-75.ITS2, 28S rRNA gene, strain DI1675 Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1443 bits(781) 0.0 781/781(100%) 0/781(0%) Plus/Minus 50 Query GAAGGAGCTTCACACGGGCGCGGCCACCCCATCCCAGACGGGATTCTCACCCTCTATGAC 60 Sbjct 782 GAAGGAGCTTCACACGGGCGCGGCCACCCCATCCCAGACGGGATTCTCACCCTCTATGAC 723 Query 61 GGCCCGTTCCAGGGCACTTAGATGGGGGCCGTTCCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAAT 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 722 GGCCCGTTCCAGGGCACTTAGATGGGGGCCGTTCCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAAT 663 Query 121 GCGGACCCCGAGGGGGCCAGCTTTCAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT 180 Sbjct 662 GCGGACCCCGAGGGGGCCAGCTTTCAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT 603 Query 181 AGGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 602 AGGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTA 543 Query 241 TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGAGATAATTAAAGGTTGGGGGTCGGCTGGCGCCGG 300 Sbjct 542 TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGAGATAATTAAAGGTTGGGGGTCGGCTGGCGCCGG 483 Query 301 CCGGGCCTACTAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 482 CCGGGCCTACTAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGC 423 Query 361 CGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGCgggggggACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGC 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 422 CGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGCGGGGGGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGC 363 Query 421 TTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAGAGGGCGCAATGT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 362 Query 481 TTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAGAGGGCGCAATGT 303 GCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 302 GCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGC 243 Query 541 TGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTAATTTCG 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 242 TGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTAATTTCG 183 Query 601 TTATAGGTCTCAGACTGCAACTTCAGACAGCGTTCAGGGGGGCCGTCGGCGGGCGCGGGG 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 182 TTATAGGTCTCAGACTGCAACTTCAGACAGCGTTCAGGGGGGCCGTCGGCGGGCGCGGGG 123 Query 661 CCCGCCGAGGCAACATAGGTTCGGGCAACACGGGTGGGAGGTTGGGCCCCGAGGGGCCCG 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct Query 122 721 CCCGCCGAGGCAACATAGGTTCGGGCAACACGGGTGGGAGGTTGGGCCCCGAGGGGCCCG CACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTC Sbjct 62 CACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTC Query 781 C 63 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 781 | Sbjct C 51 Hình 19: so sánh trình tự gen mẫu A5.2 với Genbank Kết định danh phương pháp sinh học phân tử cho thấy mẫu A5.2 có độ tương đồng 100% so với chủng nấm Penicillium citrinum.Kết hợp với kết đặc điểm hình thái có, khẳng định chủng nấm Penicilliumcitrinum.Loài tạo ochratoxin citrinin, độc tố gây hại cho gan thận
Mẫu A9 Hình 20: trình tự gen mẫu A9 Aspergillus niger strain NJA-1 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 508S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: KJ365316.1Length: 1736Number of Matches: Related Information Range 1: 28 to 824GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1472 bits(797) 0.0 797/797(100%) 0/797(0%) Plus/Minus 52 53 Query CTTAGACGGGGGCCGCACCCAAAGCATCCTCTGCAAATTACAATGCGGACTCCGAAGGAG 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 824 Query 61 CTTAGACGGGGGCCGCACCCAAAGCATCCTCTGCAAATTACAATGCGGACTCCGAAGGAG 765 CCAGCTTTCAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 764 CCAGCTTTCAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTG 705 Query 121 GTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 704 Query 181 GTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGA 645 GGTCAACCTGGAAAGAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 644 GGTCAACCTGGAAAGAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCA 585 Query 241 TGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 584 Query 301 TGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCC 525 GTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 524 GTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGA 465 Query 361 CGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 464 CGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGA 405 Query 421 TGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGAT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 404 TGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGAT 345 Query 481 GCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGAC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 344 GCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGAC 285 Query 541 TGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAG 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 284 TGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAG 225 Query 601 AGGCGcccccccGGCGGCCGACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTACAATAGAC 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 224 AGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTACAATAGAC 165 Query 661 ACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 164 ACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC 105 Query 721 CTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCGGGTTTGACCAACTTTCC 780 Sbjct 104 CTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCGGGTTTGACCAACTTTCC Query 781 GGCTCTGGGGGGTCGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 45 797 ||||||||||||||||| Sbjct 44 GGCTCTGGGGGGTCGTT 28 54 Hình 21: so sánh trình tự gen mẫu A9 với Genbank Kết định danh phương pháp sinh học phân tử cho thấy mẫu Aspergillus A9 có độ tương đồng 100% so với chủng nấm Aspergillus niger Kết hợp với so sánh đặc điểm hình thái khẳng định chủng nấm Aspergillus niger Chủng nấm nguyên nhân phổ biến nhiễm trùng tai nấm, mà gây đau, thính lực tạm thời mát, trường hợp nghiêm trọng, thiệt hại cho ống tai Qua nghiên cứu cho thấy khơng khí mơi trường lao động có chứa nấm mốc gây hại Penicillium Aspergillus Đồng thời với nhận xét trước cho thấy kết tổng nấm mốc thu vượt giới hạn cho phép, dẫn đến người lao động có nguy bị nhiễm nấm mốc gây hại trên, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người lao động 3.3 Đề xuất giải pháp phòng chống nấm mốc, giảm thiểu nguy gây hại nấm mốc có mơi trường lao động Trong khơng khí môi trường lao động nhiều sẵn bào tử nấm mốc, nơi khí hậu nóng ẩm Ở nơi cần mở hộp peptri chứa môi trường dinh dưỡng khử trùng chừng 5-10 phút có hàng chục bào tử nấm khơng khí rơi xuống Những bào tử bay lơ lửng khơng khí rơi vật liệu, thiết bị gặp điều kiện thức ăn, nhiệt độ, độ ẩm khơng khí thích hợp nảy mầm nhanh chóng phát triển thành hệ sợi với quan sinh sản mang nhiều bào tử Dựa đặc điểm sinh học nấm mốc, đưa ba ngun tắc để phịng chống nấm mốc khơng khí mơi trường lao động sau: - Tạo điều kiện sinh thái không thuận lợi cho nấm mốc Ví dụ nhiệt độ môi trường cao thấp, độ ẩm không khí q khơ, vượt ngồi phạm vi thuận lợi cho phát triển nấm mốc 55 - Dùng nguyên liệu bền với nấm mốc, khiến cho hệ enzyme nấm mốc phong phú mạnh pphân hủy - Dùng tác nhân vật lý hóa học gây tác động xấu đến hoạt động sống nấm, khiến quan sinh sản quan sinh dưỡng nấm mốc bị ức chế không phát triển bị chết hẳn Dựa nguyên tắc này, có phương pháp giải sau: Lựa chọn vật liệu bền với nấm để dùng kết cấu vật liệu thiết bị Đây phương pháp tốt khơng phải lúc dễ dàng áp dụng Lí vật liệu tốt thường đắt, khiến giá thành sản phẩm trở nên cao; đôi khivật liệu bền với nấm mốc lại không phù hợp với yêu cầu khác mặt kỹ thuật Chống ẩm cho môi trường Theo Gates et al độ ẩm tương đối môi trường khoảng 45% 65% giữ cho nhiều loại vật liệu có vải, sợi, giấy, bơng, máy móc điện tử sau năm tốt, 15% 35% không bị mốc số vật liệu dễ hút nhả ẩm bị cứng giịn Một số biện pháp áp dụng để giảm ẩm như: thơng gió kho tàng, đặt máy diều hòa nhiệt độ, dùng đèn sấy Khống chế nhiệt độ môi trường Trong nhiệt độ môi trường 10oC đa số nấm mốc không phát triển được, 20oC đa số nấm mốc bị hạn chế Giữ môi trường nhiệt độ cao khoảng 40oC trở lên ngăn phát triển đa số loài nấm mốc Nhưng nhiệt độ gây ảnh hưởng đến người lao động họ làm việc thời gian dài, đồng thời để giữ mức nhiệt độ cần khoản chi phí lớn Sử dụng quạt gió Phương pháp dựa ngun lí khơng khí lưu động, dù mơi trường có ẩm giúp cho thoát nước từ vật liệu dễ 56 dàng, vật liệu khơ dỡ bị mốc Nhưng phương pháp khó áp dụng ngành dệt, may.[5] KếT LUậN VÀ KIếN NGHị
Kết luận Đã nghiên cứu lấy mẫu nấm mốc khơng khí mơi trường lao động sở chế biến lương thực phương pháp chủ động Kết xác định tổng nấm có khơng khí vị trí 1: 1730 ± CFU/m3 khơng khí, vị trí 2: 1370 ± 69 CFU/m3 khơng khí, vị trí 3: 1340 ± 67 CFU/m3 khơng khí Đã phân lập định danh nấm mốc khơng khí mơi trường lao động sở chế biến lương thực Kết giải trình tự gen đoạn gen ITF định tên mẫu nấm mốc với độ tương đồng so với Genbank 100%
Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn khuôn khổ luận văn thực định danh hết chủng nấm mốc không khí mơi trường lao động Kiến nghị đề tài tiếp tục nghiên cứu sâu chủng loại nấm mốc có nguy có sinh độc tố định danh chủng nấm mốc sinh độc tố số chất hóa học gây hại.Đánh giá so sánh chủng thu với tiêu chuẩn WHO nước – tổ chức quốc tế Xây dựng sở liệu làm tiền đề đề xuất ngưỡng giới hạn cho phép nấm mốc sinh độc tố khơng khí khu vực làm việc khu vực lân cận 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt: Ths Lê Thị Thu Hằng.(2009) “Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Apergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin kỹ thuật PCR” Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Ths Vũ Duy Thanh (2014) “Nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá có mặt nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động” Luận văn thạc sĩ sinh học Ngô Thị Mai “Sự ô nhiễm vi sinh vật không khí, phương pháp kiểm tra tiêu chuẩn đánh giá” Phân Viện Bảo hộ lao động bảo vệ môi trường miền Nam Ths Nguyễn Thị Bé Út (2013) “Nghiên cứu phân bố số chủng nấm mốc gây hại Đại nội Huế Thánh đại Mỹ Sơn, Quảng Nam” Luận văn thạc sĩ khoa học Đặng Vũ Hồng Miên (2015) “Hệ nấm mốc Việt Nam” NXB Khoa học kỹ thuật Tài liệu tham khảo tiếng Anh: Saudi Journal of Biological Sciences Tập 19, số phát hành 4, tháng 10 năm 2012, trang 405-426 58