Trang 1 PHẠM TIẾN DŨNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- Phạm Tiến DũngCÔNG NGHỆ SINH HỌC Trang 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- Phạm Tiến DũngNGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG THỬ N
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHẠM TIẾN DŨNG Phạm Tiến Dũng CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT RNA VI RÚT TỪ CÁC LOẠI NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHỐ 2015B Hà Nội– Năm 2017 1708330013177918cb706-70e7-441f-9bab-1763def1ac30 170833001317645fad9ac-00ba-4208-a707-7c09f23b0a1e 170833001317667e6fc34-5529-4d31-9783-ab8947c51fe3 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Phạm Tiến Dũng NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT RNA VI RÚT TỪ CÁC LOẠI NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS LÊ QUANG HÒA Hà Nội – Năm 2017 Luc Phm T MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC T Ừ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 11 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 13 1.1 Tình hình tiêu thụ xuất nhuyễn thể hai mảnh vỏ Việt Nam 13 1.2 Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến: Norovirus HAV 15 1.2.1 Norovirus 16 1.2.2 Virút viêm gan A 17 1.3 Khó khăn phát virút thực phẩm 18 1.4 Chiến lƣợc phát virút thực phẩm 19 1.5 Quy trình tách chi ết virút từ thực phẩ m 19 1.5.1 Quy trình tách chit virút t thc phm bng cách ra gic virút 1.5.2 Quy trình tách chit virút t thc phm bng cách x lý proteinase K 23 1.5.3 Quy trình tách chit trc tip virút t thc ph m 24 1.6 Quy trình tinh d ịch rửa giải / cô đặc virút RNA sau tách chiết 24 1.7 Kiểm soát trình tách chiết tinh RNA virút từ thực phẩm 27 1.8 Các phƣơng pháp phát Norovirus HAV 28 1.8.1 dng kính hin t 1.8.2 K thut ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 28 1.8.3 K thut RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 29 1.8.4 K thut RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) 30 1.9 Phƣơng pháp phát định lƣợng HAV NoV nhuy ễn thể hai mảnh vỏ ISO/TS 15216-1:2013 ISO/TS 15216-2:2013 30 Luc Phm T 1.9.1 Nguyên tc c 1.9.2 Các nghiên cu th gii s d CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 34 2.1 Vật liệu nghiên u 34 2.1.1 Chng virút m u chun RNA 34 2.1.2 Mu nhuyn th hai mnh v 34 2.1.3 Mi mu dò 34 2.1.4 Hóa cht 34 2.1.5 Thit b 35 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Thit k nghiên cu 35 2.2.2 Phng pháp Trizol 37 2.2.3 Phng pháp tinh sch bng ct silica Purelink RNA mini Kit 38 2.2.4 x lý mu bng CTAB 39 2.2.5 t ta RNA bng LiCl 2.2.6 tinh s ch bng bi t silica 41 2.2.7 -time RT-PCR 2.2.8 t RNA virút theo ISO/TS 15216-2:2013 2.2.9 Phương pháp nhiễm chủ động Mengovirus, Norovirus HAV theo ISO 44 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45 3.1 Hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phƣơng pháp dựa Trizol màng silica 45 3.1.1 Hiu qu tách chit tinh sch RNA Mengovirus ca p (Trizol) 46 3.1.2 Hiu qu tách chit tinh sch RNA Mengovirus ca p B (Trizol tinh sch bng Purelink RNA mini Kit) 48 3.1.2 Hiu qu tách chit tinh sch RNA Mengovirus ca p C (Trizol, tinh sch bng Purelink RNA mini Kit kt t a vi LiCl) 49 Luc Phm T 3.1.3 Hiu qu tách chit tinh sch RNA Mengovirus ca p D (Trizol kt hp vi Purelink RNA mini Kit x lý vi CTAB) 50 3.1.3 Hiu qu tách chit tinh sch RNA Mengovirus cT tinh sch bng Purelink RNA mini Kit, x lý bng CTAB kt t a vi LiCl) 51 3.1.6 Tng hp k t qu tách chit tinh sách RNA Mengovirus c da Trizol màng silica 53 3.2 Hiệu tinh RNA Mengovirus bi từ silica 57 3.2.1 Tng bi t silica s d tinh s cao 57 3.2.2 T cn dch ni vi bi t tinh sc t hi u qu cao 58 3.2.3 T ra gii RNA Mengovirus tinh sch bng bi t silica 3.3 So sánh hiệu tách chiết RNA virút phƣơng pháp E phƣơng pháp ISO mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ đƣợc nhiễ m chủ động 61 3.3.1 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Mengovirus m ẫu hàu, ngao vẹm nhiễm chủ động ngưỡng virút 63 3.3.2 So sánh hiu qu tách chit RNA virút gi ISO m c nhim ch ng 64 3.3.3 So sánh hiu qu tách chit RNA virút gi ISO mc nhim ch ng 65 3.3.4 So sánh hiu qu tách chit RNA virút gi ISO mu vc nhim ch ng 67 3.3.5 Tng hp kt qu RNA t nhuyn th hai mnh v c nhi m ch ng virút 69 3.4 So sánh hiệu tách chiết phƣơng pháp ISO phƣơng pháp E tách chiết NoV từ mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên 71 3.5 Ứng dụng thử nghiệm phƣơng pháp E để tách chiết RNA virút t nhuyễn thể mảnh vỏ 75 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 Luc Phm T LỜI CẢM ƠN c ht, tơi xin bày t lịng bi c ti TS Lê Quang Hòa, phòng thí nghim K thut gen, Trung tâm nghiên cu phát trin Công ngh Sinh hc, vin Công ngh Sinh hc Công ngh Thc phi hc Bách Hà Nn tình ch bo ng d n tơi sut trình nghiên c u ho thành lu trân tr ng c y, cô Vi q trình hc tp nghiên c phịng thí nghim vin Cơng ngh Sinh h c Công ngh Thc p bn sinh viên, h c viên i hc Bách khoa Hà N tơi trình thí nghim Bên c TS E Superiore di tơi q trình thc hin lu c bit xin chân thành c Khoa Hc Công Ngh p kinh p cho nhim v Ngh a Vit Nam Cng hòa Ý v phát tri ển phương pháp, công cụ phân tích nhanh vi sinh v ật gây bệnh độc tố sản phẩm thủy sản - tơi có th hồn c nghiên cu Cui cùng, xin chân thành ci thân, b , tu ki tơi hồn thành lu Tơi xin trân trng c Học viên Phạm Tiến Dũng Luc Phm T LỜI CAM ĐOAN ng s li c công b dựng ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ loại nhuyễn thể hai mảnh vỏlà trung thc, th c hi i s ng dn ca TS Lê Quang c cơng b cơng trình khoa hc khác Học viên Phạm Tiến Dũng Luc DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ/ thuật ng ữ AdV Adenovirus BSA bovine serum albumin CIAA Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EtOH Ethanol G Genogroup HAV Hepatitis A virus ISO International Organization for Standardization LBM Live bivalve molluscs LiCl Lithium chloride NoV Norovirus ORF Open reading frame RNA Ribonucleic acid RoV Rotavirus RT-LAMP Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction RT-qPCR Real time Reverse transcriptase polymerase chain reaction Phm T Luc DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số lô hàng nhuyễn thể Việt Nam xuất sang châu Âu b ị phát nhiễm Norovirus……………………………………………………………………… 14 Bảng 1.2 Đệm rửa giải chất thêm vào để tách chiết virus từ mẫu thực phẩm 21 Bảng 1.3 Thuận lợi khó khăn phương pháp đượ c sử dụng để cô đặc hạt virút…………………………………………………………………………………… 23 Bảng 1.4 Tổng kết phương pháp ly giải virus, cô đặc tách chiết axit nucleic từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa kỹ thuật RT-PCR………………………………… 26 Bảng 2.1 Trình tự mồi m ẫu dò định lượng Mengovirus, NoV HAV s dụng phản ứng RT-qPCR………………………………………………………………42 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng Mengovirus, NoV HAV 42 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR định lượng Mengovirus, NoV HAV 43 Bảng 3.1 Kết đánh giá hiệu qu ả tách chiết tinh phương pháp A (Trizol) kỹ thuật RT-qPCR……………………………………………………….47 Bảng 3.2 Kết đánh giá hiệu qu ả tách chiết tinh phương pháp B (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit) kỹ thuật RT-qPCR……………… 49 Bảng 3.3 Kết đánh giá hiệu qu ả tách chiết tinh phương pháp C (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit kết tủa RNA bằ ng LiCl) kỹ thu ật RT-qPCR……………………………………………………………………………… 50 Bảng 3.4 K ết đánh giá hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp D (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit xử lý CTAB) kỹ thuật RT-qPCR…………………………………………………………………………51 Bảng 3.5 K ết đánh giá hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp E (Trizol k ết hợ p với Purelink RNA mini Kit, xử lý với CTAB kết t RNA LiCl) kỹ thuật RT-qPCR…………………………………………… 52 Bảng 3.6 Hiệu qu ả tách chiết tinh s ạch RNA Mengovirus phương pháp dựa Trizol màng silica…………………………………………………………53 Phm T Luc Bảng 3.7 K ết tối ưu lượng bi t silica sử dụng để tinh RNA Mengovirus đạt hiệu cao…………………………………………………………………………… 58 Bảng 3.8 Kết qu ả tối ưu nồng độ cồn dịch n ổi ủ với bi từ silica để tinh RNA Mengovirus đạt hiệu cao…………………………………………………… 59 Bảng 3.9 Kết tối ưu nhiệt độ rửa giải RNA Mengovirus tinh bi từ silica…………………………………………………………………………………… 60 Bảng 3.10 nồng độ HAV NoV ngưỡng nhiễm chủ động vào m ẫu nhuyễn thể hai m ảnh vỏ……………………………………………………………… 61 Bảng 3.11 n ồng độ phiên th ể gen củ a HAV NoV plasmid dựng đường chuẩn định lượng RT-qPCR………………………………………………… 61 Bảng 3.12 So sánh hi ệu suất thu hồi RNA Mengovirus m ẫu hàu, ngao vẹm nhiễm chủ động ngưỡng virút……………………………………………… 63 Bảng 3.13 So sánh hiệu tách chi ết RNA virút phương pháp E phương pháp ISO mẫu hàu nhiễm chủ động……………………………………….64 Bảng 3.14 So sánh hi ệu su ất thu h ồi RNA Norovirus GI m ẫu hàu nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO……………………… 64 Bảng 3.15 So sánh hi ệu suất thu hồi RNA Norovirus GII m ẫu hàu nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO…………………………65 Bảng 3.16 So sánh hi ệu suất thu hồi RNA HAV mẫu ngao nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO…………………………………… 65 Bảng 3.17 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Norovirus GI mẫu ngao nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO……………………… 66 Bảng 3.18 So sánh hi ệu suất thu h ồi RNA Norovirus GII m ẫu ngao nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO……………………… 66 Bảng 3.19 So sánh hi ệu suất thu hồi RNA HAV m ẫu vẹm nhi ễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO…………………………………….67 Bảng 3.20 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Norovirus GI m ẫu vẹm nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO……………………… 68 Phm T