Nghiên ứu xây dựng và ứng dụng thử nghiệm quy trình táh hiết rna virút từ á loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Trang 1 PHẠM TIẾN DŨNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- Phạm Tiến DũngCÔNG NGHỆ SINH HỌC Trang 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- Phạm Tiến DũngNGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG THỬ N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

TS LÊ QUANG HÒA

Hà Nội – Năm 2017

1

M C L C Ụ Ụ

LỜI CẢM ƠN 4

LỜI CAM ĐOAN 5

DANH MỤC CÁC T ẾỪVI T T T 6Ắ M Ở ĐẦU 11

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 13

1.1 Tình hình tiêu th và xu t kh u nhuy n th hai m nh v ụ ấ ẩ ễ ể ả ỏ ở Việt Nam 13

1.2 Tác nhân gây ng c th c ph m ph ộ độ ự ẩ ổ biến: Norovirus và HAV 15

1.2.1 Norovirus 16

1.2.2 Virút viêm gan A 17

1.3 Khó khăn khi phát hiện virút trong th c ph m 18ự ẩ 1.4 Chiến lược phát hi n virút trong th c ph m 19ệ ự ẩ 1.5 Quy trình tách chi t virút t ế ừ thực ph m 19ẩ 1.5.1 Quy trình tách chi t virút t th c ph m b ng cách r a gi c virút

1.5.2 Quy trình tách chi t virút t th c ph m b ng cách x lý proteinase K 23

1.5.3 Quy trình tách chi t tr c ti p virút t th c ph m 24

1.6 Quy trình tinh s ch d ch r a giạ ị ử ải / cô đặc virút ho c RNA sau khi tách ặ chi t 24ế 1.7 Kiểm soát quá trình tách chi t và tinh s ch RNA virút t ế ạ ừ thực ph m 27ẩ 1.8 Các phương pháp phát hiện Norovirus và HAV 28

1.8.1 d ng kính hi n t

1.8.2 K thu t ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 28

1.8.3 K thu t RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 29

1.8.4 K thu t RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) 30

1.9 Phương pháp phát hiện và định lượng HAV và NoV trong nhuy n ễ thể hai mảnh vỏ hiện nay ISO/TS 15216-1:2013 và ISO/TS 15216-2:2013 30

2

1.9.1 Nguyên t c c

1.9.2 Các nghiên c u trên th gi i s d

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Vật liệu nghiên c u 34ứ 2.1.1 Ch ng virút và m u chu n RNA 34

2.1.2 M u nhuy n th hai m nh v 34

2.1.3 M i và m u dò 34

2.1.4 Hóa ch t 34

2.1.5 Thi t b 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Thi t k nghiên c u 35

2.2.2 Ph ng pháp Trizol 37

2.2.3 Ph ng pháp tinh s ch b ng c t silica Purelink RNA mini Kit 38

2.2.4 x lý m u b ng CTAB 39

2.2.5 t t a RNA b ng LiCl 4

2.2.6 tinh s ch b ng bi t silica 41

2.2.7 -time RT-PCR 4

2.2.8 t RNA virút theo ISO/TS 15216-2:2013

2.2.9 Phương pháp nhiễm ch ng Mengovirus, Norovirus và HAV theo ISOủ độ 44

CHƯƠNG III KẾT QU VÀ BÀN LU N 45Ả Ậ 3.1 Hiệu quả tách chi t và tinh s ch RNA Mengovirus cế ạ ủa các phương pháp d a trên Trizol và màng silica 45ự 3.1.1 Hi u qu tách chi t và tinh s ch RNA Mengovirus c a p (Trizol) 46 3.1.2 Hi u qu tách chi t và tinh s ch RNA Mengovirus c a p B (Trizol và tinh s ch b ng Purelink RNA mini Kit) 48

3.1.2 Hi u qu tách chi t và tinh s ch RNA Mengovirus c a p C (Trizol, tinh s ch b ng Purelink RNA mini Kit và k t t a v i LiCl 49)

3

3.1.3 Hi u qu tách chi t và tinh s ch RNA Mengovirus c a p D (Trizol

k t h p v i Purelink RNA mini Kit và x lý v i CTAB) 50

tinh s ch b ng Purelink RNA mini Kit, x lý b ng CTAB và k t t a v i LiCl) 51

3.1.6 T ng h p k t qu tách chi t và tinh sách RNA Mengovirus c

d a trên Trizol và màng silica 53

3.2 Hiệu quả tinh s ch RNA Mengovirus b ng bi t ạ ằ ừ silica 57

cao 57

t hi u qu cao 583.2.3 T r a gi i RNA Mengovirus khi tinh s ch b ng bi t silica 3.3 So sánh hiệu quả tách chi t RNA virút giế ữa phương pháp E và phương

pháp ISO trên các mẫu nhuyễn th hai m nh v ể ả ỏ được nhi m ch ễ ủ động 61

3.3.1 So sánh hiệu su t thu h i RNA Mengovirus c a các mấ ồ ủ ẫu hàu, ngao và vẹm

được nhi m ch ễ ủ động 4 ngưỡng virút 63

3.3.2 So sánh hi u qu tách chi t RNA virút gi

ISO trên m c nhi m ch ng 643.3.3 So sánh hi u qu tách chi t RNA virút gi

ISO trên m c nhi m ch ng 653.3.4 So sánh hi u qu tách chi t RNA virút gi

ISO trên m u v c nhi m ch ng 673.3.5 T ng h p k t qu

RNA t nhuy n th hai m nh v c nhi m ch ng virút 693.4 So sánh hiệu qu tách chiả ết của phương pháp ISO và phương pháp E khi

tách chi t NoV t mế ừ ẫu nhuyễn th hai m nh v t nhiên 71ể ả ỏ ự

3.5 Ứng dụng th nghiử ệm phương pháp E để tách chi t RNA virút t ế ừ nhuyễn

thể 2 m nh v 75ả ỏ

CHƯƠNG IV KẾT LU N VÀ KI N NGH 78Ậ Ế Ị

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

4

L I C Ờ ẢM ƠN

c h t, tôi xin bày t lòng bi c t i TS Lê Quang Hòa, phòng thí nghi m K thu t gen, Trung tâm nghiên c u và phát tri n Công ngh Sinh

Hà N n tình ch b o và ng d n tôi trong su t quá trình nghiên c u và hothành lu

trong quá trình h c t p và nghiên c

phòng thí nghi m vi n Công ngh Sinh h c và Công ngh Th c p

trình thí nghi m

phát triển phương pháp, công cụ phân tích nhanh vi sinh v t gây bậ ệnh và độ ốc t

5

LỜI CAM ĐOAN

dựng và ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ các loại nhuyễn

thể hai mảnh vỏ là trung th c, do tôi th c hi i s ng d n c a TS Lê Quang

c công b trong công trình khoa h c khác

Học viên

m Ti

6

DANH MỤ C CÁC T VI T T T Ừ Ế Ắ

T viừ ết tắt Tên đầy đủ/ thu t ng ậ ữ

CIAA Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1)

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

ISO International Organization for Standardization

RT-LAMP Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification

RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction

RT-qPCR Real time Reverse transcriptase polymerase chain reaction

7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 M t s lô hàng nhuy n th ộ ố ễ ể Việt Nam xu t kh u sang châu Âu b phát hiấ ẩ ị ện

nhiễm Norovirus……… 14

Bảng 1.2 Đệm r a gi i và các ch t thêm ử ả ấ vào để tách chi t virus t m u th c ph m 21 ế ừ ẫ ự ẩ

B ng 1.3 Thu n lả ậ ợi và khó khăn của các phương pháp được s dử ụng để cô đặc hạt

virút……… 23

B ng 1.4 T ng kả ổ ết các phương pháp ly giải virus, cô đặc và tách chi t axit nucleic t ế ừ

nhuyễn th hai m nh v d a trên k thu t RT-PCRể ả ỏ ự ỹ ậ ……… 26

B ng 2.1 Trình t m i và mả ự ồ ẫu dò định lượng Mengovirus, NoV và HAV s d ng ử ụ

Bảng 3.2 K t qu ế ả đánh giá hiệu qu tách chi t và tinh s ch c a ả ế ạ ủ phương pháp B

(Trizol k t h p v i Purelink RNA mini Kit) b ng k thuế ợ ớ ằ ỹ ật RT-qPCR……… 49

Bảng 3.3 K t qu ế ả đánh giá hiệu qu tách chi t và tinh s ch c a ả ế ạ ủ phương pháp C

(Trizol k t h p v i Purelink RNA mini Kit và k t t a RNA b ng LiCl) b ng k thuế ợ ớ ế ủ ằ ằ ỹ ật

RT-qPCR……… 50

Bảng 3.4 K t qu ế ả đánh giá hiệu qu tách chi t và tinh s ch RNA Mengovirus c a ả ế ạ ủ

phương pháp D (Trizol kết h p v i Purelink RNA mini Kit và x lý CTAB) b ng k ợ ớ ử ằ ỹ

thuật RT-qPCR………51

Bảng 3.5 K t qu ế ả đánh giá hiệu qu tách chi t và tinh s ch RNA Mengovirus c a ả ế ạ ủ

phương pháp E (Trizol k t h p v i Purelink RNA mini Kit, x lý v i CTAB r i k t t a ế ợ ớ ử ớ ồ ế ủ

RNA b ng LiCl) b ng k thuằ ằ ỹ ật RT-qPCR……… 52

B ng 3.6 Hi u qu tách chi t và tinh s ch RNA Mengovirus cả ệ ả ế ạ ủa các phương pháp

d a trên Trizol và màng silicaự ………53

8

B ng 3.7 K t qu tả ế ả ối ưu lượng bi t silica s dừ ử ụng để tinh sạch RNA Mengovirus đạt

hiệu qu caoả ……… 58

B ng 3.8 K t qu tả ế ả ối ưu nồng độ ồ c n trong d ch n i khi v i bi t ị ổ ủ ớ ừ silica để tinh s ch ạ

RNA Mengovirus đạt hi u qu caoệ ả ……… 59

B ng 3.9 K t qu tả ế ả ối ưu nhiệt độ ử r a gi i RNA Mengovirus khi tinh s ch b ng bi t ả ạ ằ ừ

silica……… 60

B ng 3.10 nả ồng độ HAV và NoV trong các ngưỡng được nhi m ch ng vào mễ ủ độ ẫu

nhuyễn th hai m nh vể ả ỏ……… 61

B ng 3.11 nả ồng độ phiên b n th gen c a HAV và NoV trong các plasmid d ng ả ể ủ ự

đường chuẩn định lượng RT-qPCR……… 61

B ng 3.12 So sánh hi u su t thu h i RNA Mengovirus c a các m u hàu, ngao và vả ệ ấ ồ ủ ẫ ẹm

được nhi m ch ễ ủ động 4 ngưỡng virút……… 63

B ng 3.13 So sánh hi u qu tách chi t RNA virút gi a pả ệ ả ế ữ hương pháp E và phương

pháp ISO trên mẫu hàu được nhi m ch ễ ủ động……….64

B ng 3.14 So sánh hi u su t thu h i RNA c a Norovirus GI trong mả ệ ấ ồ ủ ẫu hàu được

nhiễm ch ng giủ độ ữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 64

B ng 3.15 So sánh hi u su t thu h i RNA c a Norovirus GII trong mả ệ ấ ồ ủ ẫu hàu được

nhiễm ch ng giủ độ ữa phương pháp E và phương pháp ISO………65

B ng 3.16 So sánh hi u su t thu h i RNA c a HAV trong mả ệ ấ ồ ủ ẫu ngao được nhi m ch ễ ủ

động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 65

B ng 3.17 So sánh hi u su t thu h i RNA c a Norovirus GI trong mả ệ ấ ồ ủ ẫu ngao được

nhiễm ch ng giủ độ ữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 66

B ng 3.18 So sánh hi u su t thu h i RNA c a Norovirus GII trong mả ệ ấ ồ ủ ẫu ngao được

nhiễm ch ng giủ độ ữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 66

B ng 3.19 So sánh hi u su t thu h i RNA c a HAV trong m u vả ệ ấ ồ ủ ẫ ẹm được nhiễm ch ủ

động giữa phương pháp E và phương pháp ISO……….67

B ng 3.20 So sánh hi u su t thu h i RNA c a Norovirus GI trong m u vả ệ ấ ồ ủ ẫ ẹm được

nhiễm ch ng giủ độ ữa phương pháp E và phương pháp ISO……… 68

9

B ng 3.21 So sánh hi u su t thu h i RNA c a Norovirus GII trong m u vả ệ ấ ồ ủ ẫ ẹm được

nhiễm ch ng giủ độ ữa phương pháp E và phương pháp ISO……….68

Bảng 3.22 So sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chi t RNA c a HAV ế ủ

t ừ nhuyễn th hai m nh v ể ả ỏ được nhi m ch ng virútễ ủ độ ………69

Bảng 3.23 So sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết RNA c a NoV ủ

GI t ừ nhuyễn th hai m nh v ể ả ỏ được nhi m ch ng virútễ ủ độ ……… 69

B ng 3.24 So ả sánh phương pháp E và phương pháp ISO khi tách chiết RNA c a NoV ủ

GII t ừ nhuyễn th hai m nh v ể ả ỏ được nhi m ch ng virútễ ủ độ ………70

B ng 3.25 K t qu ả ế ả định lượng NoV GI và NoV GII trong 20 m u nhuy n th hai ẫ ễ ể

m nh v khi tách chi t b ng c ả ỏ ế ằ ả phương pháp ISO và phương pháp E……… 72

Bảng 3.26 Kết quả định lượng các loại virút bằng RT qPCR khi ứng dụng phương

-pháp E để tách chiết 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập tại Việt Nam………76

Bảng 3.27 Phân tích kết quả sử dụng phương pháp E định lượng RNA của HAV và

NoV trong 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập tại Việt Nam………77

10

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THI

Hình 1.1 Một số món ăn làm từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ……… 13

Hình 1.2 Norovirus……… 17

Hình 1.3 Virút viêm gan A……… … 18

Hình 1.4 Quy trình phân tích các lo i m u theo tiêu chu ạ ẫ ẩn ISO………24

Hình 1.6 Mengovirus……… 27

Hình 2.1 Thi t k nghiên c u xây d ế ế ứ ựng phương pháp mớ ự i d a trên Trizol và màng silica tách chi t và tinh s ế ạch RNA virút đạt hiệ u qu ả cao……… …35

Hình 2.2 S phân pha và k t t ự ế ủa RNA trong phương pháp Trizol……… …38

Hình 2.3 Quy trình tinh s ch RNA b ng c ạ ằ ột silica……… …39

Hình 3.1: Các bướ c chính trong quy trình tách chi t RNA virút t m u nhuy n th hai m nh ế ừ ẫ ễ ể ả v ỏ sau khi đã xây dựng xong……… …55

Hình 3.2 Đồ th ị so sánh lượ ng Norovirus GI phát hi ện đượ c gi ữa phương pháp ISO và phương pháp E trong các mẫ u nhuy n thể ễ hai m nh v t nhiên ả ỏ ự ……… 73

Hình 3.3 Đồ th ị so sánh lượ ng Norovirus GII phát hi ện đượ c gi ữa phương pháp ISO và phương pháp E trong các mẫ u nhuy n thể ễ hai m nh v t nhiên ả ỏ ự ……… …74

Hình 4.1 H c viên Ph ọ ạ m Ti ến Dũng quan sát TS Elisabetta Suffredini làm thí nghi m ệ … 80

D li u g Châu Âu cho th y r ng nhuy n th hai m nh v s ng (LBM

12 Nghiên cứu xây dựng và ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ

các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ

13

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở Việt Nam

Hình 1.1 Một số món ăn làm từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ

14

[6]Nor

Norovirusvirút c

Bảng 1.1 M t s lô hàng nhuy n th ộ ố ễ ể Việt Nam xu t kh u sang châu Âu b ấ ẩ ị

phát hi n nhi m Norovirus ệ ễSTT M t hàng nhiặNorovirus ễm Nƣớkhẩu c nhập Ngày l y m u ẫ ấ Ngày thông báo Mã trích d n ẫ

1 N Tây Ban Nha 12/01/2014 07/02/2014 2014.0186

2 Ngao n u ín ch nh B 27/02/2014 13/03/2014 2014.ALZ

3 Ngao chl nh Tây Ban Nha 12/03/2014 01/04/2014 2014.AOH

4 Ngao nguyên li u nh Tây Ban Nha 28/03/2014 24/04/2014 2014.0558

5 Ngao trbi Tây Ban Nha 27/06/2014 14/07/2014 2014.BDO

6 nguyên con Ý 18/08/2014 26/08/2014 2014.BJO

7 Ngao trl nh Tây Ban Nha 19/02/2015 12/03/2015 2015.AKZ

8 nguyên v Ý 24/03/2015 02/04/2015 2015.0424

Ngu n: CEERAM ồ

i tác, gây m t uy tín trên th ng nhuy n th

n Norovirus trong nhuy n th hi

nhuy n th

1.2 Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến: Norovirus và HAV

Trên th gi i, vi m b o ch ng v sinh an toàn th c ph m là m t tr

th c ph m gây ra b i virút, nhi u g i nguyên nhân do vi khu n (30%) vàsinh trùng (3%) Nghiên c u v nhóm các virút gây ô nhi m ngu c có kh

i Trong s các virút này, Norovirus (NoV) và Hepatitis A virus (HAV) là hai

virút gây b nh ph bi n, chi m t l l

nh t nhóm th y h i s n [18] Nhuy n th hai m nh v có th s c c vù

m u phân tr em b viêm d dày ru t t i vi n Nhi TW có 180 m

Norovirus [19]

1.2.2 Virút viêm gan A

Trong các vi sinh v t gây b nh th c ph m, các virút là m t trong nh ng tác nhân

gây b ng g p nh t Theo các s li u th ng kê M , các virút là nguyên nhân

ng h p ng c th c phCampylobacter ch gây ra l t 9,7% và 14,2% các v ng c 13 c tính t

ph bi n nh t n u xét v s ng v d ch và s i b m c  6 Hai lo i virút

18

sau khi tiêu th các lo i ngao b nhi m  8

Hình 1.3 Virút viêm gan A

1.3 Khó khăn khi phát hiện virút trong thực phẩm

Phát hi n virút trong th c ph m là m t nhi m v r

y u sau: virút không th ng bên ngoài v t ch nên không th s d

i v i vi khu n, n virút trong th c ph

t n t i nhi u ch t c ch ph n ng PCR trong th c ph m Trong vi c phát hi n virút trong nhuy n th hai m nh v nói riêng, t n t i m t lo i polysaccharide là glycogen có

19

tách chi t RNA d n s c ch c a ph n ng RT-PCR khi phát hi n virút u

1.4 Chiến lƣợc phát hiện virút trong thực phẩm

1) tách chi t virút, 2) tinh s ch RNA virút và 3) phát hi

s ch Trong quá trình tách chi t virút, h t virút c tách t matrix th c ph m, sau ra

c k t t a xu ng th tích nh và cu i cùng là lo i b các thành ph

polysaccharide, protein và lipid gây c ch kh n RNA [18, 44, 4

ng r t th p trong th c ph m i v i nhuy n th hai m nh v , m c nhi m t p thôn

ng t 102 n 104 phiên b n th gen c a virút trên 1 gam ng tiêu hóa [12, 32, 33]

hi n K t qu âm tính gi là do s c ch trong ph n ng phát hi

ki m ch ng âm và ki m ch

1.5 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm

trình này có th c chia làm 3 cách ti p c n chính: 1) r a gi i virút

d ng; và 3) tách chi t tr c ti p ti p virút bao g m c quá trình r a gi

c quy trình trong này tài c s d ng

1.5.1 Quy trình tách chi t virút t th c ph m b ng cách r a gi i và c virút

d i v i các lo i th c ph m ch a nhi u carbohydrate, nhi u ch t béo, protein và

gi i phóng virút ra kh i b m t th c ph ng ki m cho phép h t virút tác

c s d r a gi i HAV t rau di p và dâu tây [4] hay

gi i NoV và HAV t hàu [34]

protein l n c a d ch chi t th t bò khi n cho NoV b k t t l i cùng v i PEG [29]

NoV và RoV t qu n 7; 3,5 và 5,7 l n Tuy nhiên quá trình phát hi

c ch [27, 47, 58]

th c ph m d ng l ng giàu carbohydrate b i kh phá v các liên k t pectin trong

21

B ng 1.2 ả Đệm r a gi i và các chử ả ất thêm vào để tách chi t virus t m u th c ph m [53] ế ừ ẫ ự ẩ

Thành phần/ Điều kiện Chi ti t ế Chức năng

mà không b k t t a cùng v i các thành ph n h [36] Trong nhuy n th

hi n NoV t các toàn b hay ch ph n ng tiêu hóa c a nhuy n th M t

16] Trong khi nghiên c u khác l i thông báo kh 3

phiên b n NoV trong 1,25 g ng tiêu hóa c a hàu [51] Cách ti p c c

d ch ra m c nhi m t p c a AdV và NoV lo i v m Ma r c và hàu Ph

22

virút c a HAV và NoV t nhuy n th hai m nh v và các ngu n th c ph m giàu

tâm cho k t qu hi u su t thu h i th i 0,1% NoV và 2,5% HAV khi tácchi t virút t dâu tây và qu mâm xôi [45] Trong quá trình ly tâm, h t virút s c

b t ti n, v lo i b các thành ph n c a m u kh i d ch r a gi i và k t t

phân t Màng l c trang b l màng cho phép d ch l ng và nh ng phân t nh (50

virút c gi l i trên màng l c [32]

pháp siêu ly tâm, d ch r a gi i virút ph i c c làm s

c phân tách kh i h t virút Hi u su t thu h i có th ng cách x lý

l c v i bovine serum albumin (BSA) ho c siêu âm [50] Hi u su t thu h i c

pháp k t t a PEG v i 23% Tuy nhiên, trong nghiên c u khác khi tách chi t NoV t

Cô đặc mi n d ch: trong k ễ ị thu t này, bi t c bao b c b i kháng nguyên có

kh n v i h t virút i v i NoV, kháng nguyên có th là histo-bloodgrouantigens (HBGA) nhóm A, B và H ho c porcine gastric mucin - m t lo i protein trong

d dày l n ch c pH th p [53] i v i HAV, kháng nguyên có th là kháng th

-2F2 [4]

virút khi n vi c lo i b ch t c ch PCR không m

ph m này l i th t nhi u trong nghiên c u khác [40] Hi u qu c

pháp siêu ly tâm vì i cao v thi t b

B ng 1.3 Thu n lả ậ ợi và khó khăn của các phương pháp đượ ử ụng để cô đặc s d c h vir ạt út

Phương pháp cô đặc Ưu điểm Nhược điểm

v virút gi i phóng axít nucleic [43]

24

Hình 1.4 Quy trình phân tích các lo i m u theo tiêu chu n ISOạ ẫ ẩ

1.5.3 Quy trình tách chi t tr c ti p virút t th c ph m

t tr c ti p virút t th c ph m bao g m quá trình

h p ch t ch a thành ph n chính là guanidinium isothiocyanate (GITC) và phenol, ti p

theo là quá trình tinh s ch d ch sau khi tách chi

trong khi ng d ng trong các th c ph m giàu lipid và protein v ng phát hi n là 1-102 NoV trong 10 30 g hamburger, gà tây, th t c u [7] Trong nhuy n th hai m nh

th t, qu mâm xôi, dâu tây, rau di p và bánh mì k p [14] Nghiên c u c a Schwab và

ng c a các ch t c ch lên k t qu phát hi n NoV [21] Tuy nhiên cách p

u qu , vì pha loãng m ng th i s làm gi m n

Trong h u h t các quy trình, quá trình tinh s c th c hi n thông qua vi c

l c ho c x lý v i Freon 113, Vertrel® XF ho c chloroform:butanol Freon 113

virút [37], m c dù v y ch t này l i phá h y t ng Ôzôn và gây ng x

ng thay th , Vertrel® XF

(1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-s d tinh s ch RNA c a NoV t m u phân [8] hay m t s th c ph m giàu

hai m nh v M t l a ch n khác thay th Freon 113 là h n h

tách chi t tr c ti p RNA t nhuy n th hai m nh v và phát hi n NoV [52] Cu i

ch b ng cách l c v i l màng c

26

B ng 1.4 T ng kả ổ ết các phương pháp ly giải virus, cô đặc và tách chi t axit nucleic t ế ừ

nhuyễn th hai m nh v d a trên k thu t RT-PCR [53]ể ả ỏ ự ỹ ậ

Khối lƣợng

nhuyễn thể Ly giải virus Cô đặc virus Khối lƣợng tách chiết Tách chiết Nucleic axit

25g Glycine PEG 0,5g QIAamp (Quiagen)

18g Glycine Siêu ly tâm 1g GuSCN

25g Glycine PEG 0,4g Tri-reagent (Sigma)

1,5g DT CHCl 3-but, Catfloc PEG 1,5g Prot K, CTAB

1,5g DT Gycine-threonine PEG 0,12g GuSCN+QIAamp

1,5g DT Cloroform-but,

Catfloc PEG 1,5g Prot K, CTAB 1,5 g DT PBS pH7.4, CHC13-but, Catfloc Siêu ly tâm 1g QIAamp

1,5g DT Bi Zirconia nc 0,09g RNEasy (Qiagen)

1g DT nc nc Silica & guanidium

10g Glycine PEG 0, 8g RNeasy

25g Threonine PEG nc GuSCN

25g DT Glycine Siêu ly tâm 1, 5g TRIzol (Gibco) +

Boom 2g DT Glycine Siêu ly tâm 0, 1g GuSCN

PEG 8, 3g Guanidium 1,5g DT PEG 1, 5g Nuclisens

25g DT Glycine buffer pH 9.2 PEG 0, 75g Nucleospin RNA (M-N)

25g Glycine CHC13 Siêu ly tâm 1 25g Nucleospin RNA

1.5g DT CHC13-but, Catfloc PEG 0, 07g RNeasy

1g DT PBS Siêu ly tâm nc QIAamp

DT: ng tiêu hóa ố

27

1.7 Kiểm soát quá trình tách chi t và tinh s ch RNA virút t ế ạ ừ thực ph m ẩ

i v i vi c phát hi n virút b ng k thu t sinh h c phân t , vi c s d ng m u

th i gian dài, vì v y c n ph i có m u ki m ch ng quá trình tách chi m b

qu c a quá trình tách chi t virút c a matrix th c ph m b ng cách thêm vào m u m t

c n phát hi n, d dàng nuôi c y và không lây nhi m vào m u th c ph m c n phân tích Murine norovirus 1 (MNV-1), feline calicivirus (FCV), MS2 bacteriophage và

mengovirus (vMC0) là nh ng virút c s d ng ph bi n nh ki m ch ng quátrình trong vi c phát hi n các virút trong th c ph m MNV-1 là Norovirus thu c phân

(Wobus et al., 2006) c s d ng trong phát hi n NoV nhuy n th hai m nh v

và th c ph [30] FCV là virút thu c chi Vesivirus lây b nh

c ng d ng trong phát hi n NoV trong nhuy n th hai m nh v c u

chai và s n ph ng [30] Bacteriophage MS2 thu c chi Levivirus, không gây

c s d ng trong phát hi n HAV qu m c [6]

Hình 1.6 Mengovirus

28

c l a ch n làm ch ng quá trình tiêu chu n c a ISO

1.8 Các phương pháp phát hiện Norovirus và HAV

ph bi n

1.8.2 K thu t ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

K thu c phát tri phát hi n tr c ti p các y u t quykháng nguyên trên v capsid c a Norovirus K thu

29

trong b nh vi n v i c m u l n, yêu c nh nhanh; tuy nhiên k t qu âm tính

c kh nh l i b ng k thu t RT-PCR K thu

Norovirus trong các m u th c ph m v ng nh virút

1.8.3 K u t RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) th

K thu t RT-PCR là k thu t phân tích d a trên s khu

thu t này có th kh c ph c h n ch v nh y c

RT-PCR (Reverse Trancription Polymerase Chain Reaction) là k thu c s d ng

-PCR là vùng gen mã hóa RNA-dependent RNA polymerase tro

gen m c tiêu Trong m t nghiên c u so sánh hi u qu c

Norovirus trên m t t p h p g m 244 m u b nh ph m, Rabenau và các c ng s (2003)

c hi l p l i, gi m th i gian phân tích và h n ch hi ng nhi m t

30

tích

1.8.4 K thu t RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)

các k thu t khu ng nhi t axit nucleic hi n có; v i k thu t này, vi c phát

2000, k thu t RT-LAMP s d c tính chuy n v m ch c a enzyme Bst DNA polymerase và 4 c p m i nh n 6 vùng khác nhau trên gen m c tiêu [24] Nh vi c

n hóa và rút ng n th i gian phân tích

1.9 Phương pháp phát hiện và định lượng HAV và NoV trong nhuy n th hai ễ ể

mảnh vỏ hiện nay ISO/TS 15216-1:2013 và ISO/TS 15216-2:2013

Taqman Hi u su t c a toàn b quá trình tách chi t (gi i phóng virút và chi t RNA)

a trên vi c nhi m ch ng m u ki m soát quá trình (m t lo

31

v tiêu chu n ISO, hi u su t thu h t t 1% tr c ch p nh n

Trong nghiên c u c a lisabettaE Suffredini và c ng s (2012), các tác gi

kh o sát m nhi m t p Norovirus trong 70 m u nhuy n th hàu, ngao và v m thu

ng tiêu hóa r l y 1,5 g / m u Sau khi x lý proteinase K 37oC trong 60

phút và b t ho t enzyme 60oC trong 15 phút, m c ly tâm 3000 x g trong 5

thu d ch n i Tinh s ch axit nucleic b ng h th

ch n i sau khi b

b sung bi t silica, sau quá trình r

không có s khác bi nào gi a 2 khu v c l y m u và 3 lo i nhuy n th

m nh v V t l nhi m t p, có t i 51,4% s m u nhi m Norov

nhi m NoV GI, 14,3% ch nhi m NoV GII trong khi ph n l n (34,3%) nhi m c NoV

GI và GII Hi u su t thu h i Mengovirus c a các m ng t 0,46 1,15%

Trong nghiên c u c a Katrine Uhrbrand và c ng s (2010), các tác gi

lý v i proteinase K M u hàu và v c thu th p t ch

2003-2004 s c m l y ph n ng tiêu hóa Sau quá trình x lý, m u nhuy n th

c c t vào -20oC cho t i khi s d c khi ti n hành nhi m ch ng, mnhuy n th c ki m tra âm tính v i Norovirus theo quy trình mô t b i Le Guyader,

2000 và k thu t RT-seminested PCR v i các c p m c hi u theo Nishida, 2003

g m c nhi m ch ng Norovirus GII (t 10-1 n 104 phiên b n th gen) và FCV (100 n 106 phiên b n th gen) cùng m u không nhi m làm ki m ch ng

m l y ph n ng tiêu hóa, sau quá trình x 2 g mlý, c tách chi t l y axit nucleic

n d a trên tiêu chu n ISO/TS 15216 (Anony

x lý proteinase K và s d ng h th ng BioMerieux K t qu cho th y, t t c các m u

u âm tính v i HEV, RV và Salmonella, 12 m u (41%) m g tính v i PCV v i

m nhi m t p là 1,02 92,3 x 102 phiên b n th gen / g DT ( ng tiêu hóa) c a

1,58% ± 1.96 l t v i m u không pha loãng và pha loãng 10 l n cho th y còn t n

t i ch t c ch trong m u RNA sau khi tách chi t và tinh s

Trong nghiên c u c a M.F Varela và c ng s (2015), các m u nhuy n th bao

pháp tiêu chu n ISO/TS 15216-1:2013 K t qu cho th y 30/168 m u (17,9%)

cùng là v m t nhiên (14,3%) và v m nuôi tr ng (12,9%) Các m u thu th p vùng

v i c NoV GI và GII T t 12 m u hàu liên n các v d

NoV v i m c nhi m t p trung bình là 2148 phiên b n th

trong hàu V i hi u su t thu h i th y, m t s

hi n c a nh ng ch t c ch ph n ng PCR có m t trong m c tách chi

tách chi t RNA t nhuy n th hai m nh v t hi u qu cao

34

CHƯƠNG II Ậ V T LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng virút và mẫu chu n RNA ẩ

- Các m u virút chu n: Mengovirus, Hepatitis A virus, Norovirus GI và GII c cung c p

b i TS Elisabetta Suffredini (Istituto Superiore di Sanità, Rome, C ng hòa Ý)

- Các m u plasmid chu n Hepatitis A virus, Norovirus GI và GII c cung c p b i TS

Elisabetta Suffredini (Istituto Superiore di Sanità, Rome, C ng hòa Ý)

- Trizol Reagent (Invitrogen);

- PureLink® RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific);

- CTAB - Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (Sigma);

- LiCl - Lithium chloride (Sigma);

- H2O không ch a Rnase (Invitrogen);

- Bi t silica (Merck)

- Ultrasens quantitative RT-PCR kit (Life Technologies)

35

2.1.5 Thiết bị

- Máy vortex (Labnet)

- Máy ly tâm Sorvall Legend X1R (Thermo Fisher Scientific)

- B n nhi t (Eppendorf)

- Sonic Vibra-Cell VCX130

- H th ng Real-time PCR Eppendorf Realplex4

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

m c tách chi t RNA ngay Các m u nhuy n th c tách chi t

h i c a Mengovirus

Hình 2.1 Thi t k nghiên c u xây d ng ế ế ứ ự phương pháp ớ ựm i d a trên Trizol và màng silica

tách chi t và tinh s ch RNA virút t hi u qu cao ế ạ đạ ệ ả

36

Phương pháp xử lý m u nhuy n th hai m nh v : Các m u nhuy n th hai ẫ ễ ể ả ỏ

2 ml Chu n b 2 ng eppendorf cho m i m u M u sau khi x c b o qu n

n khi phân tích

ng hóa m u b ng Trizol

c khi cho thêm 1 ml Chloroform H n h c trong 3 phút nhi

ng m i

0,7 ml Isopropanol r i ly tâm 12000 g trong 30 phút Sau quá trình r

ti p t c tách chi t và tinh s ch b ng Purelink RNA Mini Kit (Thermo Fisher

ng d n c a nhà s n xu t u tiên 2,7 ml d

Wash Buffer I và Wash Buffer II, c t tinh s c ly tâm khô màng Sau cùng RNA

37

k t t a RNA D ch n c lo i b hoàn toàn, k t t

c hòa tan trong

thêm s u ch nh Sau quá trình phân pha, d ch n i (200 µl) c k t

b ng cách tr n v i 50 µl c a 10M LiCl H n h o tr n và oC trong trong 20

hoàn toàn, k t t c r a b

2.2.2 Phương pháp Trizol

c thi t k tách chi t l y toàn b RNA t

ng, th c v t hay có ngu n g c vi sinh v t Trizol là dung d ch

g m thành ph n chính là phenol và guanidine isothiocyanate c s d tách chi t RNA Trizol duy trì s nguyên v n c a RNA b i kh c ch hi u qu hotính c a Rnase trong khi phá v t bào và hòa tan các thành ph n c a t bào trong su t

h n h p v i m

n m m t phân cách gi a 2 l p dung d ch, RNA n m pha d ch n i phía trên cùng có

th d dàng l y ra b ng cách hút pipet RNA ti p t c k t t a v i Isopropanol., sau

-38

Hình 2.2 S phân pha và k t tự ế ủa RNA trong phương pháp Trizol

Trong lu n v này, ph ng ph áp c th c hi n nh sau: M u nhuy n th 1 g

100% trong 30s Sau khi t i nhi phòng 5 phút, h n h c b sung 1 m

ml Isopropanol r o tr n Sau khi ly tâm 12000g, 30 phút, d c lo i b K

t c thêm 2 ml EtOH 70%, vortex và ly tâm 12000g, 5 phút, d c lo i b

K t t c hòa tan trong 100 µl H2O

2.2.3 Phương pháp tinh s ch bạ ằng cột silica Purelink RNA mini Kit

ch RNA s d ng c t silica nói chung hay PureLin

n, tin c

ng cao phù h p v i các nghiên c u v sinh h c phân t Khi k t h p v

Trizol có ch a nhi u guanidine isothiocyanate phù h p ngay v i vi c RNA bám lên

ng hóa m u b