Sinh học di truyền thực hành sinh học đại cương

KÍNH HIỂN VI, PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VI HỌC, QUAN SÁT TIÊU BẢN• MỤC TIÊU:- Trình bày nguyên lí, cấu tạo, sử dụng và bảo quản kính hiển vi quang học.- Trình bày kĩ thuật làm một số loại

THỰC HÀNH SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

TS Nguyễn Thị Trung Thu

BÀI 1 KÍNH HIỂN VI, PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VI HỌC, QUAN SÁT TIÊU BẢN

• MỤC TIÊU:

- Trình bày nguyên lí, cấu tạo, sử dụng và bảo quản kính hiển vi quang học

- Trình bày kĩ thuật làm một số loại tiêu bản thông dụng

- Trình bày kết quả quan sát trên kính hiển vi một số tiêu bản tế bào Prokaryota và Eukaryota

- Quan sát lạp thể và vị trí trong tế bào thực vật

NỘI DUNG

• 1 LÍ THUYẾT THỰC HÀNH

• 2 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

• 3 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

• 4 BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

1 Lí thuyết thực hành 1.1 Kính hiển vi quang học

1.2 Phương pháp làm tiêu bản giọt ép

Cấu trúc kính hiển vi quang học

Phần quang học

- Gương: ở chân hoặc thân kính, để hứng ánh sáng Hoặc kính hiển

vi hiện đại lấy ánh sáng từ bóng đèn điện

- Tụ quang: hệ thống thấu kính hội tụ ánh sáng.

- Vật kính: độ phóng đại/độ mở (40/0,85) 2 loại:

+ Vật kính thường (độ phóng đại x10, x20, x40, soi môi trường

không khí)

+ Vật kính dầu (độ phóng đại x90, x100, soi môi trường dầu).

- Thị kính: gồm 2 thấu kính, mặt lõm hướng xuống dưới,có độ

phóng đại x10, x15

Độ phóng đại = độ phóng đại vật kính x độ phóng đại thị kính

Video hướng dẫn sử dụng và bảo quản kính hiển vi

https://youtu.be/drO0ebEAcRk

- Quan sát vật kính dầu (x100) thì nhỏ lên tiêu bản 1 giọt dầu Hạ

trực tiếp đầu vật kính vào giọt dầu Soi xong phải lau bằng

khăn mềm, bông thấm dung môi (xylene, toluene)

Bảo quản kính hiển vi

• Thao tác nhẹ nhàng, thận trọng, tránh va chạm

• Giữ kính sạch sẽ

• Lau phần cơ học và quang học bằng khăn riêng thấm cồn

• Không sờ vào các bộ phận quang học

• Dùng xong xếp gọn vào túi ni long, chuông thủy tinh tránh bụi

• Khi di chuyển phải dung 2 tay: 1 tay đỡ, 1 tay cầm cần kính

1.2 Phương pháp làm tiêu bản giọt ép

https://www.youtube.com/watch?v=cDa_YGpIokg

Phương pháp làm tiêu bản giọt ép

• Tiêu bản thông dụng nhất

• Quan sát mẫu vật sống và định hình.

• Cách làm:

- Dùng pipet nhỏ một giọt nước lên giữa phiến kính

- Dùng kim nhọn đặt mẫu vật cần quan sát vào giọt nước

- Đậy lá kính lên sao cho giọt nước choán hết lá kính và không

có bọt khí

2 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

2.1 Dụng cụ

• Kính hiển vi quang học

• Phiến kính, lá kính

• Kim mũi mác, khay men, dao, dao lam,

• Chậu thủy tinh, đũa thủy tinh, ống nghiệm

3 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM3.1 Quan sát tế bào Prokaryota

3.2 Quan sát tế bào Eukaryota

- Quan sát tế bào biểu bì hành

- Quan sát tế bào cà chua ở các vị trí khác nhau: biểu bì, thịt quả, dịch quả

- Quan sát lạp màu (sắc lạp) ở tế bào biểu bì quả ớt, quả cà chua,

củ cà rốt

3.1 Quan sát tế bào Prokaryota

• Tiến hành:

- Nhỏ 1 giọt nước cất lên lam kính

- Lấy một khuôn bèo hoa dâu, đặt úp lên giọt nước trên phiếnkính

- Dùng kim mũi mác ấn nhẹ vài lần, bỏ bèo hoa dâu

- Đậy lá kính lên phần dịch rong và quan sát

Video quan sát tế bào biểu bì hành và cà chua

https://youtu.be/jEddsrQuH2w

3.2 Quan sát tế bào Eukaryota

3.2.1 Quan sát tế bào biểu bì hành

• Làm tiêu bản giọt ép:

- Dùng kim mũi mác tách bỏ lớp vỏ khô, bóc lấy lớp vỏ lụa (5x5 mm)

- Đặt miếng bóc được (úp mặt bóc xuống dưới) lên phiến kính

- Nhỏ 1 giọt dung dịch Lugol, đậy kín rồi quan sát

• Quan sát:

- Quan sát ở vật kính x10: tế bào hình chữ nhật xếp xít nhau,

thành tế bào, nhân (bắt màu đậm), tế bào chất, không bào

- Quan sát ở vật kính lớn hơn: x40

3.2.2 Quan sát tế bào cà chua ở các vị trí khác nhau

3.2.3 Quan sát lạp màu (sắc lạp) ở tế bào biểu bì

quả ớt, quả cà chua, củ cà rốt

• Làm tiêu bản giọt ép:

- Chọn quả ớt/cà chua/cà rốt tươi

- Bóc vỏ ngoài, dung dao cắt một lớp mỏng mô quả rồi đặt vào giọt nước đã nhỏ sẵ trên phiến kính và quan sát.

• Quan sát: vật kính x10, x40

• Nhận xét:

- Hình dạng tế bào của quả ớt/cà chua/cà rốt

- Hình dạng và màu sắc của lạp màu trong tế bào quả ớt/cà chua/cà rốt

4 BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

4.1 Báo cáo kết quả trên kính hiển vi

• Làm được tiêu bản tế bào

• Chỉ được các lạp màu

4.2 Báo cáo bằng bài viết

• Trình bày cách sử dụng và bảo quản kính hiển vi

• Trình bày các bước của làm tiêu bản giọt ép

• Vẽ các tế bào và lạp màu quan sát được.

• Nhận xét sự khác nhau về hình dạng tế bào, các lạp màu

• Tại sao có sự khác nhau về hình dạng tế bào ở các vị trí khác nhau của quả?

BÀI 2 NHÂN TẾ BÀO

• Mục tiêu:

- Quan sát tính đa dạng hình thái nhân tế bào máu ở người.

- Phân biệt được các bạch cầu máu người.

- Làm tiêu bản máu ếch, quan sát tế bào bạch cầu, tiểu cầu.

NỘI DUNG

• 1 LÍ THUYẾT THỰC HÀNH

• 2 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

• 3 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

• 4 BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

1 LÍ THUYẾT THỰC HÀNH 1.1 Nhân tế bào

1.2 Tế bào bạch cầu máu người

1.3 Phương pháp làm tiêu bản vết bôi và dấu quét

• Nhân hình cầu, elip, phân thùy

• Có 1 nhân, hai hoặc nhiều nhân hoặc không có nhân

2 Tế bào bạch cầu máu người

• Tế bào hoàn chỉnh, 6.200-7.000 tế bào/mm3

• Hình dạng thay đổi tùy thuộc vị trí long mạch

• Chức năng: tham gia vào hệ thống miễn dịch

Phân loại

bạch cầu

• Bạch cầu không hạt:

- Bạch cầu lympho: hình cầu, nhân lớn chiếm gần hết khối tế bào chất

- Bạch cầu mono: kích thước lớn, nhân lớn, nằm lệch một phía, bất màu tím

nhẹ

• Bạch cầu có hạt:

- Bạch cầu trung tính: hình cầu, kích thước không lớn, nhân phân thùy (2-5

thùy), bắt màu hồng, tế bào chất có nhiều hạt không bắt màu.

- Bạch cầu ưa acid: ít, nhân phân 2 thùy, bắt màu đỏ tươi, tế bào chất có

nhiều hạt bắt màu đỏ.

- Bạch cầu ưa base: chiếm ít nhất, nhân uốn dạng chữ S, tế bào chất có nhiều

hạt bắt màu xanh, nhân bắt màu xanh tím

1.3 Phương pháp làm tiêu bản soi kính hiển vi 1.3.1 Phương pháp làm tiêu bản vết bôi

1.3.2 Phương pháp làm tiêu bản dấu quét

1.3.1 Phương pháp làm tiêu bản vết bôi

• Quan sát vi sinh vật và máu.

- Đưa nhanh qua ngọn lửa đèn cồn.

- Ngâm tiêu bản trong dung dịch định hình (cồn ethylic ) 30s – 1 phút, đổ cồn thừa, hong khô.

• Nhuộm (đơn, kép): xanhmethylen, đỏ fucxin, tím gencian

- Nhỏ thuốc nhuộm trực tiếp (phủ kín tiêu bản).

- Giữ thuốc nhuộm trong khoảng thời gian nhất định (1-15’).

- Rửa qua nước, hong khô ở nhiệt độ phòng

Video làm tiêu bản máu

https://youtu.be/o4Op09fbsZ8

1.3.2 Phương pháp làm tiêu bản dấu quét

• Sử dụng nghiên cứu về máu

• Nhỏ giọt máu lên phiến kính

• Dùng ngón cái và trỏ cầm lá kính nghiên 40-450, để chất lỏng dàn đều mép lá kính

• Đẩy lá kính trượt đi một đoạn trên phiến kính

• Hong khô ở nhiệt độ phòng

• Cố định: (như nhuộm tiêu bản vết bôi)

2 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT2.1 Dụng cụ

3 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 3.1 Quan sát tế bào bạch cầu máu người

3.2 Quan sát tế bào máu ếch

3.1 Quan sát tế bào bạch cầu máu người

3.2 Quan sát tế bào Eukaryota

3.2.1 Quan sát tế bào máu ếch

• Làm tiêu bản vết bôi và dấu quét

- Lấy một giọt máu ếch, để khô.

- Định hình bằng cồn ethylic 30s.

- Nhuộm tiêu bản bằng xanhmethylen (hematoxylin-eosin) trong 7-8 phút.

- Rửa nhẹ cho sạch thuốc bằng nước cất.

- Để khô ở nhiệt độ phòng và quan sát.

• Quan sát:

- Quan sát ở vật kính x40: tế bào hồng cầu hình elipsoic,

- Thuốc nhuộm xanhmethylen: nhân bắt màu xanh, tế bào chất không màu.

- Thuốc nhuộm Hematoxylin-eosin: nhân bắt màu tím, tế bào chất màu đỏ.

3.2 Quan sát tế bào máu ếch

• Cách làm:

- Nhỏ 1 giọt máu ếch lên phiến kính, làm tiêu bản quét hoặc vết bôi, để khô ở nhiệt độ phòng

- Định hình bằng cồn ethylic 960 trong 30s

- Hong khô ở nhiệt độ phòng

- Nhuộm bằng xanhmethylen hoặc hematocylin trong 7-8 phút

- Rửa nhẹ qua nước, chờ khô

- Quan sát dưới kính hiển vi

• Kết quả:

- Tế bào hồng cầu: hình ovan, nhân bắt màu xanh hoặc đỏ

- Tế bào bạch cầu, tiểu cầu

4 BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

4.1 Báo cáo kết quả trên kính hiển vi

- Chỉ được vị trí các loại tế bào trên tiêu bản máu người

- Tiêu bản máu ếch sạch, nhân bắt màu rõ, tế bào không vỡ

4.2 Báo cáo bằng bài viết

- Trình bày các bước của làm tiêu bản dấu quét

- Vẽ các tế bào quan sát được

- Phân biệt các loại tế bào máu ở người

- Phân biệt tế bào máu người và tế bào máu ếch

Tế bào máu người Tế bào máu ếch

BÀI 3 CHIẾT XUẤT DNA

• Mục tiêu:

- Trình bày nguyên lí chiết xuất DNA từ tế bào

Eukaryota.

- Thực hiện một số thao tác cơ bản

- Tinh chế DNA chiết xuất được.

- Kiểm tra chất lượng DNA mới chiết xuất bằng đo

quang.

NỘI DUNG

• 1 LÍ THUYẾT THỰC HÀNH

• 2 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

• 3 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

• 4 BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

1 LÍ THUYẾT THỰC HÀNH

1 DNA

2 Nguyên lí tách chiết DNA

1 DNA

2 Nguyên lí tách chiết DNA

• Phá hủy lớp màng bao bọc DNA

- Phá hủy nhờ tác nhân vật lí (nghiền với bi thủy tinh, sóng siêu âm…) hoặc hóa học (enzyme).

- Loại bỏ lipid màng nhờ chất tẩy hoặc chất hoạt hóa bề mặt.

• Loại bỏ protein:

- Muối với nồng độ 0,3M hoặc hỗn hợp dung dịch phenol : chloroform

bổ sung vào hỗn dịch làm biến tính và kết tủa protein.

- Tách protein ra bằng lọc hoặc li tâm.

- Có thể sử dụng enzyme proteinase K và Rnase → phân giải protein

và ARN.

• Tách DNA:

- Kết tủa DNA bằng ethanol hoặc isopropanol lạnh.

- Hoặc dùng sắc kí cột (kit thương mại).

TS NGUYỄN THỊ TRUNG THU 42

Kết tủa DNA

Chuẩn bị mẫu

Kết hợp với DNA

Rửa, loại bỏ dung dịch

Hòa tan DNA

Video tách chiết ADN từ hành tây

https://www.youtube.com/watch?v=x4oK9dT0sbc

3.1 Chiết xuất DNA

Chất nhũ hóa (SDS, chất rửa chén độ pha loãng 1/10)

NaCl

A 9 ml 1 ml

• Lọc qua lớp bông mỏng, lấy 5 ml dịch trong thu vào ống nghiệm.

• TN 1d: bổ sung 0,5 ml dung dịch H2O2 dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ tránh tạo bọt, để 5 phút.

• Bổ sung 5 ml ethanol 96 0 lạnh, quan sát hiện tượng kết tủa ADN

trong lớp ethanol lạnh.

• So sánh kết quả tủa ADN

Kết tủa ADN

3.2 Tinh chế DNA

3.2.1 Chuẩn bị

• Dụng cụ:

- 1 phễu thủy tinh, 1 đũa thủy tinh, 1 số tờ giấy lọc, bông thấm

- 1 ống đong 10 ml, ống đong 50 ml, một số ống nghiệm,

- Móc thép hoặc thủy tinh

• Bước 3 Lặp lại bước 2.

• Bước 4 Dùng đũa thủy tinh chuyển ADN sang ống falcon

có 5 ml dung dịch đệm TE, lắc nhẹ

3.3 Bước đầu định tính và định lượng ADN

3.3.1 Chuẩn bị

- Dụng cụ: máy đo UV-VIS, cuvet nhựa/thủy tinh thạch anh

- Hóa chất: dung dịch đệm TE, dung dịch protein Ovalbumin (P)

- Nguyên liệu: mẫu 2a, 2b

- So sánh độ tinh khiết của ADN được chiết xuất

- Tính nồng độ ADN trong các mẫu 2a và 2b 50

4 BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

4.1 Kết quả ADN chiết xuất được.

4.2 Kết quả đo OD ở 230 nm, 260nm, 280nm ở các mẫu 2a, 2b và P.

4.3 Tính tỉ số và kết luận độ tinh khiết của ADN chiết suất được.

4.4 Tính nồng độ ADN chiết xuất (μg/ml)

TS Nguyễn Thị Trung Thu 52