TÀI LIỆU THAM KHẢO Trang 3 I.KHÁI NIỆM:• Microsatellite là những trình tự đặc biệt của DNA mà có chứa sự lặp lại nối tiếp từ 2 đến 6 bp còn gọi là SSR simple sequence repeats, STR short
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN: KĨ THUẬT DI TRUYỀN Tiểu luận tài TS: Trần Thị Dung Sinh viên thực hiện: Ngô Thị Dung-61203022 Nguyễn Kim Dung-61203023 Nguyễn Hoàng Thêm-61203134 Chủ đề: PHƯƠNG PHÁP SSR NỘI DUNG I KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SSRs II ĐẶC ĐIỂM III CƠ CHẾ ĐỘT BiẾN HÌNH THÀNH MICROSATELLITES IV CÁC LOẠI SSRs V PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MICROSATELLITES (SSRs) Tiểu luận tài VI PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MICROSATELLITES (SSRs) VII NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA MICROSATELLITES VIII ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP MICROSATELLITES IX TÀI LIỆU THAM KHẢO I.KHÁI NIỆM: • Microsatellite trình tự đặc biệt DNA mà có chứa lặp lại nối tiếp từ đến bp gọi SSR (simple sequence repeats), STR (short tandem repeats), VNTR (variable number of tandem repeats) Ví dụ: • GTGTGTGTGTGT • hay (GT)6 CTGCTGCTGCTGCTG • hay (CTG)5 ACTCACTCACTCACTC • hay (ACTC)4 II.ĐẶC ĐIỂM: Microsatellite marker lựa chọn việc lập đồ phân tử, xác định giống trồng, đánh giá nguồn gốc tổ tiên trồng cho mục đích nghiên cứu quần thể trồng tiến hóa • Có tính đa alen biến dị cao • Là marker đồng trội • Phân bố ngẫu nhiên khắp gen sinh vật • Dễ dàng xác định PCR sử dụng primer đặc biệt Tiểu luận tài Một cá thể có locus đồng hợp có số lần lặp lại hai nhiễm sắc thể, cá thể dị hợp có số lần lặp lại khác hai nhiễm sắc thể Những vùng xung quanh locus microsatellite, gọi là vùng hai bên (flanking region) có thể có trình tự Điều quan trọng vùng hai bên có thể dùng như primer phản ứng PCR nó sẽ khuếch đại microsatellite, vùng hai bên bảo tồn giống hay họ • (SSRs khuếch xác định phản ứng dây chuyền polymerase (PCR) q trình, cách sử dụng chuỗi • DNA liên tục bị làm biến tính nhiệt độ cao để tách sợi đơi, sau làm lạnh phép ủ mồi phần mở rộng trình tự nucleotide thơng qua SSRS • Q trình cho kết nhìn thấy gel agarose polyacrylamide , lượng nhỏ DNA cần thiết cho việc khuếch đại theo cách thermocycling tạo gia tăng theo cấp số nhân phân đoạn nhân rộng NGUYÊN LÝ CỦA SSR MARKER • Dựa vào hai đầu (vùng sườn) đoạn lặp lại có trình tự đặc biệt thống chung cho đoạn DNA gen không phân biệt cá thể loài, cá thể loài số lần lặp lại đơn vị lặp lại khác Từ đó, thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân cặp DNA gen chứa trình tự lặp lại Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt giống khác cá thể lồi III CƠ CHẾ ĐỘT BIẾN HÌNH HÀNH MICROSATELLITE Cơ chế đột biến hình thành Microsatellites chưa hiểu biết cách đầy đủ Tuy nhiên có hai giả thuyết nhiều người chấp nhậm 1) trinh bắt chéo lỗi trình giảm phân 2) trình trượt lỗi trình mã Sự trượt lỗi polymerase (Polymerase slippage) -Khi DNA tái bản, enzyme polymerase khơng tìm thấy vị trí cắt bớt đơn vị lặp lại hay thêm vào nhiều đơn vị lặp lại Kết sợi có số lần lặp lại khác với sợi bố mẹ Điều giải thích cho thay đổi nhỏ số lần lặp lại (thêm vào bớt hay nhiều lần lặp lại) -Sự trượt lỗi có thể khuếch đại trình tự lặp lại ngắn thành nhiều lần lặp lại qua hệ kế tiếp -Bên cạnh đó, hiệu hệ thống sửa chữa cho bắp cặp sai đóng vai trị quan trọng tốc độ biến đổi microsatellite Sự bắt cặp không đồng giảm phân Cơ chế giải thích cho thay đổi lớn số lần lặp lại Trong sơ đồ dưới, nhiễm sắc thể A có nhiều lặp lại, nhiễm sắc thể B có q lặp lại Ngun nhân tồn microsatellite -Microsatellite DNA vô nghĩa, biến đổi phần lớn khơng có tính chất rõ rệt.Chúng thường khơng có tác động có thể đo lường kiểu hình, và chúng đột biến, thơng thường là gây hại và khơng có lợi. Ở người, 90% microsatellite biết tìm thấy vùng khơng mã hóa gen Khi tìm thấy vùng mã hóa người, microsatellite biết gây bệnh Thú vị tìm thấy vùng mã hóa, microsatellite thường sự lặp lại ba nucleotide Sự giải thích dạng nucleotide lặp lại khác gây hại nhiều cho vùng mã hóa, gây đột biến xê dịch khung Microsatellite cung cấp nguồn cần thiết cho đa dạng di truyền Ở vi khuẩn, biến đổi alen microsatellite vùng mã hóa cho để thích nghi với mơi trường khác Nghĩa alen ngắn có thể thích nghi với môi trường, alen dài với nhiều lần lặp lại thích nghi với mơi trường khác Đặc biệt là, sợi nhỏ protein ngắn có thể làm cho vi khuẩn ít nhớt, sợi nhỏ protein dài làm dính gây bệnh (Moxon Wills, 1999) Do đó, có đa dạng quần thể đảm bảo sống sót quần thể vi khuẩn Tiểu luận tài mơi trường khác Tương tự, Kashi Soller (1999) tin đa dạng microsatellite cách để đền bù cho tính đa dạng di truyền chọn lọc di IV CÁC LOẠI SSRs Căn vào cấu tạo đơn vị lặp lại (2-6 lần – dinucleotide repeat) có tri nucleotide loại di nucleotide tìm thấy nhiều động vật có vú chủ yếu GT/AC, thực vật AA/TT, AT/TA Chúng ta phân làm loại (hồn hảo khơng có ngắt qng trình tự phối hợp ngắt quãng bao gồm kết hợp nhiều loại lặp lại, ngắt quãng bị chèn hay nhiều base i) Satellites đoạn trình tự lặp lại lần mà cấu tạo tới vài phần trăm genome lớn tới Mb Satellites thường tập trung vùng tâm động nhiễm sắc thể it sử dụng phân biệt kiểu gen cá thể mà sử dụng nhiều trình lập đồ gen gần vùng tâm động ii) Minisatellites có mặt hàng trăm hàng nghìn vị trí khác gennome mà đơn vị lặp lại từ 10 bp 0,5-30 kb Để phát minisatellite người ta dùng phương pháp mẫu dị phóng xạ Những thơng tin tạo nên thơng tin đặc biệt riêng cho cá thể kiểu "dấu vân tay" người Nó sử dụng để xác định quan hệ gia đình nguồn gốc mẫu vật iii) Microsatellite đoạn lặp lại ngắn 2-6bp kích thước locus 20-100 bp Microsatellite ứng dụng nhiều đơn giản hơn, phân bố genome Các thông tin đa allen locus nhiều locus lúc phân tích cách đơn giản đủ lớn cho phương pháp thống kê để đưa nhiều thơng tin bổ ích cấu trúc quần thể, hệ phả, khoa học hình Microsatellite có tính đa hình cao (chiều dài) allen đồng trội có tính chất cần thiết cho marker Tần số đột biến lớn, tuân theo định luật menden, vị trí nhiễm sắc thể xác định PCR từ lượng DNA nhỏ IV PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MICROSATELLITES (SSRs) Để tìm xác định Microsatellites ta có số thủ tục xác định sau: 1.Cắt nhỏ ADN genome enzym giới hạn 2.Phân tách đoạn ADN điện di gen thạch agarose 1%, phân tách đoạn từ 300- 500bp Tiểu luận tài Chuyển lên màng lai (nylon membral) theo nguyên tắc southernblot Dùng mẫu dò đoạn ADN đánh dấu cho lai ghép với màng lai, mẫu dị trình tự ADN tương ứng với trình tự Microsatellite mà quan tâm 5 So sánh khôi phục vạch AND tương ứng với Microsatellite mà quan tâm Chuyển vào vector sequencing Sequencing xác định SSR trình tự ADN nằm ngồi trình tự SSR, vùng để thiết kế mồi Tổng hợp mồi kiểm tra đa hình Microsatellite kích thước alen khác từ hai nucleotide trở lên mặt khác q trình tổng hợp PCR, polymeraza tạo thêm bỏ sót đơn vị lặp lại nucleotide A Do để xác định kích thước alen địi hỏi q trình điện di phải dùng gel có độ phân tách cao Tạo Microsatellites mồi: -Nếu biết vị trí cụ thể gen, ví dụ exon gen, mồi thiết kế tay -Mồi SSR ngẫu nhiên phát triển phân đoạn nhân ngẫu nhiên DNA từ loài đầu mồi -Các phân đoạn ngẫu nhiên đưa vào plasmid vi khuẩn vector ,sau cấy vào vi khuẩn ecoli VI NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA MICROSATELLI Trong chuẩn đốn bệnh: Tiểu luận tài - Vì ADN Microsatellite thay đổi chiều dài phát triển số bệnh ung thư, chúng marker hữu ích việc dị tìm, phát ung thư sớm Bởi tính đa hình chúng hữu ích nghiên cứu liên kết để định vị Gen chiụ trách nhiệm nhiều trật tự di truyền học Nghiên cứu quần thể : - ADN Microsatellite sử dụng để phát thay đổi đột ngột quần thể, hiệu ứng phân đoạn quần thể tương tác quần thể khác Microsatellite hữu ích nhận quần thể phôi thai quần thể VIII ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP Ưu điểm -Thuận lợi to lớn phân tích microsatellite phương pháp biểu số lượng lớn đa hình Một locus đậu nành (Glycine max) báocáo có 26 alen Hơn nữa, phân biệt cá thể có kết hợp các locus kiểm tra làm cho phương pháp hữ dụng thí nghiệm dịng chảy gen, xác định trồng phân tích mốiquan hệ cha -Microsatellite marker đồng trội, dị hợp tử dễ dàng xác định Tính đồng trội microsatllite gia tăng hiệu độ xác phép tính tốn di truyền quần thể dựa marker so với marker khác, AFLP RAPD Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử hệ F1 làm cho phân tích phả hệ, lai giống, dịng chảy gen trở nên dễ dàng -Khi primer SSR xác định, việc sàng lọc vật liệu sử dụng kỹ thuật hồn tồn khơng đắt tiền Hơn nữa, khuếch đại SSR loài nghĩa là sự xác định primer SSR thích hợp khơng cần thiết lồi có quan hệ gần Ví dụ, ba primer microsatellite thiết kế Malus domestica (Rosaceae), microsatellite cung cấp 35 loci, số đó có primer có thể khuếch đại các loài Malus khác 2.Hạn chế Hạn chế phương pháp microsatellite khơng thể áp dụng phân tích hệ thống lớn bao gồm nhiều lồi có quan hệ di truyền xa nhau, điều microsatellite có tỉ lệ đột biến cao dẫn đến trở ngại Thứ nhất: Trình tự vùng flanking bên vùng microsatellite thường khác loài đột biến, khó áp dụng primer microsatellite loài cho loài khác Tiểu luận tài Thứ hai,: Do tỉ lệ đột biến cao nên lồi có kết phân tích với trình tự microsatellite, ví dụ AC19, khơng thể kết luận lồi có nguồn gốc tổ tiên ban đầu, loài phân ly từ tổ tiên chúng AC18 đột biến thành AC19, cịn lồi phân ly từ tổ tiên chúng AC20 đột biến thành AC19 40 IX.TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Văn Duệ, 2005 Giáo trình kỹ thuật trồng ăn Nhà xuất Hà Nội Trang 105 – XEM THÊM TẠI: http://congnghesinhhoc24h.com/tai-lieu/phat-hienmarker-microsatellite-tu-co-so-du-lieu-trinh-tu-est459.html#sthash.CyoXH41P.dpuf Tiểu luận tài