Khóa luận tốt nghiệp đại học nghiên cứu sự hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THU TRANG

NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC

NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU

CELLULOSE TẠO RA TỪ

GLUCONACETOBACTER XYLINUS

NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG

NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI - 2019

Khóa luận tốt nghiệp đại học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THU TRANG

NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC

NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU

CELLULOSE TẠO RA TỪ

GLUCONACETOBACTER XYLINUS

NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG

NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả tình cảm của mình em xin gửi lời biết ơn đến thầy giáo Cao Bá Cường, người đã không quản khó khăn vất vả đã nhiệt tình chỉ dẫn

em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận

Em cũng muốn gửu lời cám ơn của mình đến những thầy cô trong khoa Sinh – KTNN nói chung và thầy, cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng nói riêng đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như tận tình chỉ dẫn em để

em có thể thực hành các bước thí nghiệm để hoàn thiện được khóa luận này

Vì là lần đầu tiên thực hiện nghiên cứu khoa học, tri thức còn nhiều yếu kém nên không thể không gặp phải sai sót Em mong muốn nhận được thật nhiều những chỉ dạy hữu ích từ các thầy, cô cũng như các bạn để khóa luận tốt nghiệp của em được chau chuốt và tốt hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thu Trang

Khóa luận tốt nghiệp đại học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin khẳng định rằng: đây chính là đề tài dó bản thân thực hiện dưới sự giúp đỡ của TS Cao Bá Cường Những trích dẫn trong khóa luận lấy

từ các công bố chính thức và được ghi chú rõ ràng, mạch lạc Các số liệu và kết quả được ghi trong khóa luận là chính xác, không giả dối, không giống khi

được so các kết quả đã từng công bố

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thu Trang

Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

G xylinus Gluconacetobacter

Phosphate buffered saline

Khóa luận tốt nghiệp đại học

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa khoa ho ̣c và ý nghĩa thực tiễn 3

6 Dự kiến kết quả nghiên cứu 4

NỘI DUNG 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 5

1.1.1 Cấu trúc của vật liệu cellulose (VLC) 5

1.1.2 Tính chất của màng từ VLC 5

1.1.3 Ứng dụng của màng từ VLC 5

1.2 Vi sinh vật tổng hợp cellulose 6

1.2.1 Vi khuẩn G xylinus 6

1.2.2 Đặc điểm hình thái của G xylinus 6

1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng của G xylinus 6

1.2.4 Môi trường nuôi cấy G xylinus 7

1.3 Thuốc Neomycin sunfate 8

1.3.1 Công thức cấu tạo 8

1.3.2 Tính chất lý học và hóa học 9

1.3.3 Chỉ định và chống chỉ định 9

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 10

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 11

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Vật liệu nghiên cứu 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 12

Khóa luận tốt nghiệp đại học

2.2.1 Chuẩn bị màng từ VLC 12

2.2.2 Chế tạo màng từ VLC nạp thuốc Neomycin sunfate 16

2.2.3 Phương pháp xử lý thống kê 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 Thu màng từ VLC và tinh chế màng 18

3.1.1 Thu màng từ VLC từ các môi trường lên men 18

3.1.2 Tinh chế màng từ VLC 18

3.2 Phương trình đường chuẩn Neomycin sunfate trong PBS (pH= 7,4) 19

3.3 Xác định lượng thuốc NS nạp vào màng từ VLC 19

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần của các môi trường lên men thu màng từ VLC 7

Bảng 2.1 Môi trường nuôi cấy G Xylinus 13

Bảng 2.2 Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 16

Bảng 3.1 Kết quả thu màng từ VLC tươi (n = 3) 18

Bảng 3.2 Tỷ lệ hấp thụ thuốc NS vào màng từ VLC lên men trong môi trường nước vo gạo 20

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo của neomycin sunfate 8

Hình 2.1 Quy trình tạo màng từ VLC tinh khiết 14

Hình 3.1 Hình ảnh màng từ VLC sau khi được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm trung tâm NCKH & CGCN trường ĐHSP Hà Nội 2 18

Hình 3.2 Phương trình đường chuẩn 19

Khóa luận tốt nghiệp đại học

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ở những năm trở lại đây, theo nhiều sự nghiên cứu người ta đã có sự quan tâm hơn đến vấn đề dùng nguyên vật liệu sinh học trong các loại sản phẩm chăm sóc sức khỏe nhờ khả năng tái tạo, phân hủy sinh học và tương thích sinh học của chúng Một trong số đó có khả năng đáp ứng được những

ưu điểm trên và đang dần phổ biến tới đó là cellulose Vật liệu này có những điểm ưu việt hơn so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [12] Vì vậy, màng từ vật liệu cellulose (VLC) là đối tượng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài về nhiều nghiên cứu ứng dụng khoa học và công nghệ khác nhau Đây là một loại nguyên liệu mới, được áp dụng rộng rãi trong tương đối nhiều lĩnh vực khác nhau Nổi bật là trong lĩnh vực y học, màng từ VLC đã được ứng dụng làm thuốc chống viêm và giảm đau, ví dụ như khi bị phong thấp, bị thâm tím, căng bắp thịt, đau thắt lưng cấp và thoái hoá khớp Không những vậy, nó còn được sử dụng nhằm chấm dứt các cơn đau bụng kinh Tại nước ta, các nghiên cứu và ứng dụng màng từ VLC trong đời sống vẫn còn khá là mới mẻ

Cellulose vi khuẩn (CV) được tạo ra từ Gluconacetobacter xylinum có

cấu trúc hóa học không có nhiều điểm khác biệt của cellulose thực vật nhưng khi xét một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, Vì vậy, VLC được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, đáng quan tâm hơn cả là trong sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc VLC đã được dùng như trong một số hệ thống để phân phối thuốc Amin et al đã báo cáo việc sử dụng màng từ VLC làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết quả nhận được là

Khóa luận tốt nghiệp đại học

màng từ VLC giúp cho thuốc được giải phóng một cách liên tục điều đó giúp hiệu quả khi dùng thuốc được cao hơn Gần đây hơn, Huang et al nghiên cứu

việc dùng màng từ VLC cho việc kiểm soát in vitro của berberine Ngoài

thẩm thấu qua da, thí nghiệm điều khiển khả năng giải phóng thuốc qua màng

từ VLC còn được thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột Những kết quả nhận về đã chỉ ra rằng thuốc được giải phóng không nhanh

Neomycin Sulfate là chất ưa nước tan trong nước aminoglycoside kháng sinh và canxi kênh protein chất ức chế liên kết với ức chế ribosome prokaryotic dịch, và có hiệu quả cao chống lại Gram dương và Vi khuẩn Gram âm (Waksman, 1950; Xue và cộng sự, 2010) Nó thường được sử dụng

để phòng ngừa vi khuẩn ô nhiễm của các tế bào nuôi cấy và để điều trị ở nhiều nhiễm trùng mắt, da và đường tiêu hóa (Zejc & Gorczyca, 2002; Patel, Dave, 2015; Darwhekar, Jain, Choudhary, 2012) Neomycin sulfate ức chế DNase I gây ra DNA suy thoái (Xue và cộng sự, 2010)

Nước vo gạo là loại chất khá quen thuộc trong đời sống của con người Ngoài ra nước vo gạo còn có giá thành rất rẻ và dễ tìm kiếm Do vậy,

ta nên dùng nước vo gạo để làm môi trường lên men những vi khuẩn quan trọng cho quá trình nghiên cứu

Với mục tiêu là nghiên cứu xây dựng được hệ thống VLC nạp thuốc thuốc giúp Neomycin sunfate vẫn nguyên vẹn trong môi trường acid, làm hạn chế hơn những tác dụng không mong muốn của thuốc trong việc chữa bệnh

Vì vậy tôi quyết định lựa chọn đề tài này để nghiên cứu:

“Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”

Khóa luận tốt nghiệp đại học

2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc của VLC, tìm ra được những yêu

cầu cần có để màng hấp thụ thuốc ở lượng lớn nhất

- Tạo màng từ VLC từ môi trường nước vo gạo

- Xây dựng được hệ thống hấp thụ thuốc Neomycin sunfate vào màng

từ VLC ở một số trường hợp khác nhau về kích thước, độ dày màng, nhiệt độ Kiểm định và thấy được khả năng hấp thụ thuốc trong các trường hợp đó

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tạo màng và tinh chế màng từ VLC

- Kiểm định được khả năng hấp thụ thuốc từ thí nghiệm đã xây dựng

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của màng từ VLC lên men từ nước vo gạo

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

5 Ý nghi ̃a khoa ho ̣c và ý nghĩa thực tiễn

Khóa luận tốt nghiệp đại học

+ Từ hệ thống màng từ VLC đã hấp thụ thuốc tìm ra màng hấp thụ thuốc tốt hơn

6 Dự kiến kết quả nghiên cứu

- Tạo được màng từ VLC từ chủng Gluconacetobacter xylium lên men

từ môi trường nước vo gạo

- Cung cấp một số thông tin về khả năng giải phóng thuốc Neomycin sunfate qua màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

Khóa luận tốt nghiệp đại học

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu

1.1.1 Cấu trúc của vật liệu cellulose (VLC)

VLC được cấu tạo từ các chuỗi polyme β-1,4-glucopyranose không phân nhánh Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy rằng cấu trúc hóa học

cơ bản của VLC giống cellulose ở thực vật (plant cellulose - PC) Tuy nhiên chúng cũng không giống nhau về cấu trúc đại thể Theo AJ Brown (1886), VLC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5

nm, kết hợp với nhau Các sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó, nhiều bó hợp lại thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm

1.1.2 Tính chất của màng từ VLC

Màng từ VLC với nhiều tính chất độc đáo sau:

- Mức độ mất nước và để thất thoát nước là kém

ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng đắp lên các vết thương Tại trường Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng từ VLC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thí nghiệm trên thỏ

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Kết quả rất khả quan khi màng VLC giúp vết thương lành nhanh và ngăn cản

sự nhiễm trùng của vết thương Ngoài ra, sản phẩm VLC còn được ứng dụng làm màng băng vết thương, trong phẫu thuật, ghép mô ghép cơ quan nội tạng

1.2 Vi sinh vật tổng hợp cellulose

Cellulose vi khuẩn là sản phẩm của qúa trình tổng hợp của nhiều vi

sinh vật khác nhau nhưng được biết đến hơn cả phải nhắc đến chủng G

xylinus Cấu trúc của cellulose sẽ là không giống nhau cho từng loại vi sinh

vật Chủng G xylinus là vi khuẩn sinh tổng hợp mang lại kết quả khả quan

nhất và được con người chú trọng nghiên cứu nhiều hơn cả bởi những đặc tính tốt của nó: tạo lượng cellulose lớn và có cấu trúc cellulose phù hợp cho nhiều mục đích sử dụng khác nhau

1.2.1 Vi khuẩn G xylinus

G xylinus là vi khuẩn thuộc họ Acetobacteraceae G xylinus có khả

năng được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như từ nước hoa quả hay từ một vài các loại thực vật như cây cọ ở phần lá hay thạch dừa

1.2.2 Đặc điểm hình thái của G xylinus

Đặc điểm của G xylinus có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong Với

kích thước chiều ngang khoảng 0,6 – 0,8 μm, dài khoảng 2 – 3 μm, vi khuản không sinh bào tử và thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, không có khả năng di chuyển, được sắp xếp riêng rẽ thành từng chuỗi nhưng khi tế bào không còn trẻ hoặc do các nhân tố môi trường nuối cấy thay đổi thì sẽ làm cho hình dạng

có thể bị biến đổi như: bị phình to, phân nhánh hoặc không phân nhánh

1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng của G xylinus

G xylinus có thể sử dụng được đa dạng nguồn cacbon không giống

nhau và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn mà nguồn đường được sử dụng tốt nhất cũng khác nhau

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Nhiệt độ tối thích để chủng G xylinus phát triẻn được là từ 25°C đến

30°C và pH từ 5,4 đến 6,3

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, khi còn non khuẩn lạc mọc riêng

lẻ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày Khi già tế bào mọc thành cụm, và chúng mọc theo đường cấy giống

G xylinus không thể chịu được pH cao, do vậy mà con người thường

sẽ bổ sung acid acetic và acid citric vào môi trường nuôi cấy nhằm khắc phục tối thiểu sự nhiễm khuẩn lạ và làm tăng sự tổng hợp cellulose

1.2.4 Môi trường nuôi cấy G xylinus

Môi trường nuôi cấy được tổng hợp từ nhiều nguồn dinh dưỡng quan trọng như nitơ, cacbon hay sulfua, photpho, các yếu tố vi lượng hay tăng

trưởng Yêu cầu dùng đường của G xylinus không hề nhỏ và nó nắm một vai

trò thiết yếu trong quá trình tổng hợp VLC

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn G xylinus tạo VLC được thể hiện ở

bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần của các môi trường lên men thu màng từ VLC

1.3 Thuốc Neomycin sunfate

1.3.1 Công thức cấu tạo

Khối lượng phân tử: 908.866 g/mol

(2R,3S,4R,5R,6R)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-amino-6-(aminomethyl)-4,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3-hydroxy-5-

[(1R,2R,3S,4R,6S)-4,6-diamino-2-[(2S,3R,4S,5R)-4-[(2R,3R,4R,5S,6S)-3-

(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3-hydroxycyclohexyl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric acid [10]

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của neomycin sunfate

Khóa luận tốt nghiệp đại học

1.3.2 Tính chất lý học và hóa học

Ở dạng tinh khiết, neomycin có màu trắng hay trắng ngà, dễ dàng tan trong nước nhưng lại khó tan trong ethanol 96% [1], [9] Quang phổ hấp thụ của neomycin ở bước sóng 277nm [6]

Neomycin không được tiêm vào cơ thể vì độc tính của thuốc

Neomycin cũng có thể sử dụng kết hợp với chế độ ăn đặc biệt để điều trị một vấn đề nghiêm trọng trong não (bệnh não gan) Tình trạng này được gây ra bởi sự tạo ra không hề nhỏ một vài chất tự nhiên.[7]

Thuốc này được sử dụng để chữa chứng nhiễm khuẩn Thuốc sẽ không thể điều trị cho chứng nhiễm virut Việc sử dụng không theo chỉ dẫn của bác sĩ hay sủ dụng 1 cách bừa bãi bất kì kháng sinh có thể làm cho tác dụng của thuốc không được như mong muốn

Công dụng của thuốc: chữa trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt

do tụ cầu và các khuẩn khác nhạy cảm, thuốc còn được chỉ định để sát khuẩn

bị hôn mê gan.[9]

Tác dụng phụ của thuốc neomycin sunfate:

+ Tai bị nặng hơn so với bình thường, khó tiếp nhận âm thanh bên ngoài

+ Cảm giác quang cuồng, cơ thể khó chịu chỉ thấy buồn nôn, muốn ngất xỉu

Khóa luận tốt nghiệp đại học