Khóa luận tốt nghiệp đại học nghiên cứu sự hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cenlulose tạo ra từ gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

Trang 1 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH –KTNN ====== NGUYỄN VÕ HÀ THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER X

TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS

NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Khóa luận tốt nghiệp đại học

TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS

NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa, các thầy, cô giáo trong Sinh – KTNN, các thầy cô giáo ở Viện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Phạm Thị Kim Dung

là người đã theo sát và hướng dẫn em trong quá trình hoàn hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Do lần đầu tiên làm nghiên cứu khoa học về mặt kiến thức em vẫn còn nhiều hạn chế, nên việc thiếu sót là không thể tránh khỏi Vì vậy em rất mong

sự góp ý của quý thầy, cô cũng như các bạn sinh viên để khóa luận cuả em hoàn thiện hơn Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Võ Hà Thu

Khóa luận tốt nghiệp đại học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được hướng dẫn bởi Th.S Phạm Thị Kim Dung Những số liệu kết quả này là hoàn toàn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Võ Hà Thu

Khóa luận tốt nghiệp đại học

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về chủng vi khuẩn 3

1.1.1 Vị trí, phân loại của Gluconacetoacter xylinus 3

1.1.2 Đặc điểm của Gluconacetoacter xylinus 3

1.1.3 Môi trường nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus 3

1.1.4 Đặc điểm cấu trúc màng tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus 4

1.1.5 Tính độc đáo của màng cellulose vi khuẩn 4

1.1.6 Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn 5

1.2 Tổng quan về thuốc Diclofenac natri 5

1.2.1 Sơ lược về thuốc Diclofenac natri 5

1.2.1.1 Công thức 5

1.2.1.2 Nguồn gốc và tính chất 6

1.2.1.3 Dược động học và tác dụng 6

1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri 7

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri trên thế giới 7

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri tại Việt Nam 7

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 Đối tượng nghiên cứu 9

2.1.1 Chủng vi khuẩn 9

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 9

Khóa luận tốt nghiệp đại học

2.2.1 Phạm vi nghiên cứu 10

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 10

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 10

2.2.4 Thời gian nghiên cứu 10

2.3 Phương pháp nghiên cứu 10

2.3.1 Phương pháp chế tạo vật liệu cellulose 10

2.3.1.1 Lên men thu vật liệu cenlulose từ môi trường nước vo gạo 11

2.3.1.2 Xử lý vật liệu cenllulose trước khi hấp thụ thuốc 11

2.3.1.3 Đo độ dày màng 12

2.3.1.4 Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu màng cellulose 12

2.3.2 Xây dựng đường chuẩn 13

2.3.3 Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu cellulose 14

2.3.4 Phương pháp xử lý thống kê 15

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 16

3.1 Kết quả tạo các loại vật liệu cellulose 16

3.2 Phương trình đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri 18

3.3 Khối lượng thuốc Diclofenac natri hấp thu vào màng 21

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO 24

Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac natri 6

Hình 3.1 Màng dày 0,5 cm 16

Hình 3.2 Màng nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo 17

Hình 3.3 Màng dày 0,5 cm 17

Hình 3.4 Màng tinh chế 18

Hình 3.5 Màng gạo tinh khiết 0, 5 cm; d = 1,5 cm 18

Hình 3.6 Phương trình đường chuẩn Diclofenac natri OD = 283 19

Hình 3.7 Rút mẫu đo 1 giờ 20

Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo vật liệu cenlulose 11 Bảng 3.1 Giá trị OD của màng sau các khoảng thời gian 20 Bảng 3.2 Lượng thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng gạo sau 2 giờ 21 Bảng 3.3 Hiệu suất hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng gạo sau 2 giờ 22

Khóa luận tốt nghiệp đại học

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Màng cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus là một loại màng sinh

học đặc biệt có cấu trúc và đặc tính giống với cellulose ở thực vật Tuy nhiên màng cellulose vi khuẩn khác với màng cellulose thực vật ở: màng cellulose

vi khuẩn có đặc tính dẻo dai, bền chắc hơn màng cellulose thực vật do màng cellulose vi khuẩn không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, peptin, sáp

nến, [9] … Cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus có một số tính chất

hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, Vì vậy, nó được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, đáng chú ý nhất trong

sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc [2]

Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trường phân tách cho quá trình

xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy [2]

Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm

da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người Ngoài ra màng cenlulose vi khuẩn đã được sử dụng như trong một vài hệ thống để phân phối thuốc, các sợi cellulose vi khuẩn có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường acid

Trên thế giới đã có nhiều nghiên về màng cellulose vi khuẩn Amin và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm màng bọc cho paracetamol bằng cách phun phủ Kết quả cho thấy màng cellulose vi khuẩn

có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc[3] Ở nước ta việc nghiên cứu và ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn đang được quan tâm trong những năm gần đây Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh đã nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Với mục đích đánh giá được khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri

của vật liệu cenlulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus chúng tôi thực hiện

đề tài “Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cenlulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá được khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu

cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước

vo gạo

3 Nội dung nghiên cứu

 Chế tạo được vật liệu màng, xử lý vật liệu màng trước khi cho hấp thụ thuốc, xác định lượng màng tạo thành

 Đánh giá khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu

cellulose tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy trong môi trường

nước vo gạo

Khóa luận tốt nghiệp đại học

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chủng vi khuẩn

1.1.1 Vị trí, phân loại của Gluconacetoacter xylinus

Gluconacetoacter xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, là loại vi khuẩn

hiếu khí, có khả năng sản xuất cellulose ngoại bào[7]

1.1.2 Đặc điểm của Gluconacetoacter xylinus

- Hình thái: có dạng que, hơi cong hoặc thẳng, là nhóm vi khuẩn gram

âm, không sinh bào tử, không di chuyển, sắp xếp riêng rẽ có khi xếp thành chuỗi [7]

- Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Có khả năng oxy hóa ethanol thành acidacetic, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa đường thành axit, có phản ứng với catalase dương tính Chủng vi khuẩn phát triển tối ưu ở 25 – 300

C, tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 – 8, ở pH bằng 5,5 là mức pH tối ưu để sản xuất cellulose

1.1.3 Môi trường nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus

- Gluconacetoacter xylinus được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp từ

các nguồn dinh dưỡng như: cacbon, nitơ, photpho, các yếu tố vi lượng và các

yếu tố tăng trưởng Gluconacetoacter xylinus là loài có khả năng tổng hợp

cellulose từ cacbonhydrat Glucse, fructose, maninol,… là nguồn cacbohydrat chủ yếu mà màng cellulose vi khuẩn này sử dụng Khi sử dụng Glycerol, galactose, lactose,… thì màng cellulose vi khuẩn này tổng hợp cellulose cho hiệu suất thấp hơn và không nên dùng mannose, cellobiose, acetate,…làm nguồn cacbonhydrat[2] Tùy thuộc vào các màng cellulose vi khuẩn khác nhau mà người ta sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường sao cho hợp lý

- Các sản phẩm khác: Rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất phomat, khoai tây, nước mía, nước dừa già,… cũng là nguồn nguyên liệu để

nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus

Khóa luận tốt nghiệp đại học

4

1.1.4 Đặc điểm cấu trúc màng tạo ra từ Gluconacetoacter xylinus

- Màng cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer không phân nhánh gồm các gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết  1, 4 glucan [3] Các chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành các thớ sợi thứ cấp Khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong thượng tầng ở một loài thực vật thì người ta thấy sợi thứ cấp là loại sợi tự nhiên mảnh nhất Các sợi thứ cấp kết lại với nhau tạo thành vi sợi, các vi sợi tạo thành các bó sợi, các bó sợi tạo thành dải sợi Một dải sợi có chiều dài khoảng 130 – 177 nm và dày khoảng từ 3 – 4 nm

- Tính đến thời điểm hiện tại Gluconacetoacter xylinus được đánh giá

là loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose hiệu quả nhất trong tự nhiên

Cấu trúc hóa học cơ bản của màng cellulose vi khuẩn giống với cellulose có nguồn gốc tự nhiên, tuy vậy cấu trúc đại thể của chúng vẫn có sự khác nhau Ở màng cellulose vi khuẩn các sợi mới sinh ra kết lại với nhau tạo thành sợi sơ cấp, các sợi sơ cấp kết lại tạo thành vi sợi (vi sợi nằm trong bó), cuối cùng các dải sợi được hình thành [3] Cấu trúc của màng cellulose vi khuẩn phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy Cụ thể cấu trúc hóa học

được trình bày trong hình:

1.1.5 Tính độc đáo của màng cellulose vi khuẩn

- Là loại màng trong suốt, có cấu trúc mạng tinh thể [3]

- Có sức căng, độ bền sinh học cao, kích thước ổn định [3]

Khóa luận tốt nghiệp đại học

- Có khả năng hấp thụ nước và giữ nước tốt, có độ xốp chọn lọc So với các loại cellulose khác thì màng cellulose vi khuẩn có độ tinh sạch cao hơn [3]

- Dễ dàng bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật [3]

- Có khả năng kết sợi và tạo tinh thể tốt, khả năng chịu nhiệt và tính bền cơ học cao [3]

- Màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy, các sản phẩm từ cellulose vi khuẩn được sản xuất trực tiếp mà không cần qua các bước trung gian [3]

- Đặc biệt có thể tổng hợp cellulose dưới dạng màng mỏng hay sợi cực nhỏ nhờ vi khuẩn [3]

1.1.6 Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn

Màng cenlulose vi khuẩn được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như:

- Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho

tế bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy [2]

- Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người Ngoài ra, màng cenlulose đã được sử dụng như trong một vài hệ thống để phân phối thuốc, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trường acid [2]

1.2 Tổng quan về thuốc Diclofenac natri

1.2.1 Sơ lược về thuốc Diclofenac natri

1.2.1.1 Công thức

Diclofenac natri:

Khóa luận tốt nghiệp đại học

6

- Tên khoa học: Natri 2-[(2,6-diclorophenyl)amino]phenyl] acetat,

- Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2

- Công thức cấu tạo: [7]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của thuốc Diclofenac natri

- Natri diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do khả năng ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane là các chất trung gian gây đau, sốt [7]

Hoạt tính chống viêm của nó mạnh hơn aspirin, nhưng tương đương với indomethacin [7]

Chủ yếu được sử dụng trong các bệnh xương khớp như: viêm khớp dạng thấp, viêm bao hoạt dịch, viêm gân, viêm khớp vi tinh thể

1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri trên thế giới

Nghiên cứu về màng cellulose vi khuẩn từ Gluconacetoacter xylinus và

ứng dụng của nó đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới

- Năm 1989 Brown và cộng sự đã sử dụng màng như một chất để biến đổi độ nhớt, để sản xuất ra các sợi truyền quang, làm môi trường trong cơ chất sinh học, thực phẩm

- Năm 1998 Jonas, Farad, năm 2006 Czafa và cộng sự đã nghiên cứu dùng màng cellulose vi khuẩn để làm mặt nạ dưỡng da và da nhân tạo

Diclofenac natri là thuốc nằm trong danh mục thuốc thiết yếu của 74 nước, phần lớn được nghiên cứu và sử dụng để chữa các bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm bao dịch, viêm gân,…

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc Diclofenac natri tại Việt Nam

Ở nước ta việc nghiên cứu và sử dụng màng cellulose vi khuẩn vẫn dừng lại ở mức khiêm tốn, hầu hết các nghiên cứu đang chỉ dừng lại ở bước đầu và ở quy mô phòng thí nghiệm

Hiện nay, ở Việt Nam tình hình điều trị các bệnh viêm khớp ngày càng được cải tiến Việc sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm tác nhân vận chuyển thuốc vẫn đang được nghiên cứu và đang là một hướng đi mới

Khóa luận tốt nghiệp đại học

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của màng celllulose vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

2.1.1 Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Gluconacetoacter xylinus dùng lên men thu nhận vật

liệu celulose được mua tại Nhật Bản

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Nguyên liệu:

Nước vo gạo, gạc vô trùng

Các loại hóa chất:

+ Diclofenac natri dạng tinh khiết (Việt Nam)

+ Đường glucose (Việt Nam)

+ Pepton (Việt Nam)

+ Nước cất (Việt Nam)

+ NaOH, HCl, (NH4)2SO4 (Việt Nam)

+ Acid acetic (Việt Nam)

+ Metanol (Việt Nam)

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

* Thiết bị:

- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)

- Cân phân tích (Sartorius - Thụy Sỹ)

- Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S

- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA

- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)

- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)

- Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh)

Khóa luận tốt nghiệp đại học