Trang 1 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH –KTNN ====== NGUYỄN VÕ HÀ THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER X
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH –KTNN ====== NGUYỄN VÕ HÀ THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO Khóa luận tốt nghiệp đại học KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật HÀ NỘI, 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH –KTNN ====== NGUYỄN VÕ HÀ THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS NI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO Khóa luận tốt nghiệp đại học KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học ThS Phạm Thị Kim Dung HÀ NỘI, 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa, thầy, cô giáo Sinh – KTNN, thầy cô giáo Viện nghiên cứu khoa học ứng dụng trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Phạm Thị Kim Dung ngƣời theo sát hƣớng dẫn em q trình hồn hồn thành khóa luận tốt nghiệp Do lần làm nghiên cứu khoa học mặt kiến thức em nhiều hạn chế, nên việc thiếu sót khơng thể tránh khỏi Vì em mong góp ý quý thầy, nhƣ bạn sinh viên để khóa luận cuả em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Khóa luận tốt nghiệp đại học Nguyễn Võ Hà Thu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi đƣợc hƣớng dẫn Th.S Phạm Thị Kim Dung Những số liệu kết hồn tồn trung thực khơng trùng lặp với đề tài khác Nếu sai tơi xin chịu hồn toàn trách nhiệm Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Võ Hà Thu Khóa luận tốt nghiệp đại học MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chủng vi khuẩn 1.1.1 Vị trí, phân loại Gluconacetoacter xylinus 1.1.2 Đặc điểm Gluconacetoacter xylinus 1.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus 1.1.4 Đặc điểm cấu trúc màng tạo từ Gluconacetoacter xylinus 1.1.5 Tính độc đáo màng cellulose vi khuẩn 1.1.6 Ứng dụng màng cellulose vi khuẩn 1.2 Tổng quan thuốc Diclofenac natri Khóa luận tốt nghiệp đại học 1.2.1 Sơ lƣợc thuốc Diclofenac natri 1.2.1.1 Công thức 1.2.1.2 Nguồn gốc tính chất 1.2.1.3 Dƣợc động học tác dụng 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng thuốc Diclofenac natri 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng thuốc Diclofenac natri giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng thuốc Diclofenac natri Việt Nam CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Chủng vi khuẩn 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 2.2 Phạm vi, nội dung nghiên cứu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 10 2.2.1 Phạm vi nghiên cứu 10 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 10 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 10 2.2.4 Thời gian nghiên cứu 10 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 10 2.3.1 Phƣơng pháp chế tạo vật liệu cellulose 10 2.3.1.1 Lên men thu vật liệu cenlulose từ môi trƣờng nƣớc vo gạo 11 2.3.1.2 Xử lý vật liệu cenllulose trƣớc hấp thụ thuốc 11 2.3.1.3 Đo độ dày màng 12 2.3.1.4 Đánh giá độ tinh khiết vật liệu màng cellulose 12 2.3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn 13 2.3.3 Xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào vật liệu cellulose 14 2.3.4 Phƣơng pháp xử lý thống kê 15 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Kết tạo loại vật liệu cellulose 16 Khóa luận tốt nghiệp đại học 3.2 Phƣơng trình đƣờng chuẩn thuốc Diclofenac natri 18 3.3 Khối lƣợng thuốc Diclofenac natri hấp thu vào màng 21 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 DANH MỤC HÌNH Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo thuốc Diclofenac natri Hình 3.1 Màng dày 0,5 cm 16 Hình 3.2 Màng nuôi cấy môi trƣờng nƣớc vo gạo 17 Hình 3.3 Màng dày 0,5 cm 17 Hình 3.4 Màng tinh chế 18 Hình 3.5 Màng gạo tinh khiết 0, cm; d = 1,5 cm 18 Hình 3.6 Phƣơng trình đƣờng chuẩn Diclofenac natri OD = 283 19 Hình 3.7 Rút mẫu đo 20 Khóa luận tốt nghiệp đại học DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Môi trƣờng lên men tạo vật liệu cenlulose 11 Bảng 3.1 Giá trị OD màng sau khoảng thời gian 20 Bảng 3.2 Lƣợng thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng gạo sau 21 Bảng 3.3 Hiệu suất hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng gạo sau 22 Khóa luận tốt nghiệp đại học MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Màng cellulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus loại màng sinh học đặc biệt có cấu trúc đặc tính giống với cellulose thực vật Tuy nhiên màng cellulose vi khuẩn khác với màng cellulose thực vật ở: màng cellulose vi khuẩn có đặc tính dẻo dai, bền màng cellulose thực vật màng cellulose vi khuẩn không chứa hợp chất cao phân tử nhƣ: ligin, peptin, sáp nến, [9] … Cellulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus có số tính chất hóa lý đặc biệt nhƣ: độ bền học, khả thấm hút nƣớc cao, đƣờng kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả phục hồi độ ẩm ban đầu, Vì vậy, đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, đáng ý kiểm soát hệ thống vận chuyển thuốc [2] Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trƣờng phân tách cho q trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho pin lƣợng cho tế bào, làm môi trƣờng chất sinh học, thực phẩm hay thay thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, cơng nghệ giấy [2] Khóa luận tốt nghiệp đại học Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose vi khuẩn đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay da trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho ngƣời Ngoài màng cenlulose vi khuẩn đƣợc sử dụng nhƣ vài hệ thống để phân phối thuốc, sợi cellulose vi khuẩn có cấu trúc mạng hệ thống vận chuyển phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng thuốc, giúp thuốc không bị phá hủy môi trƣờng acid Trên giới có nhiều nghiên màng cellulose vi khuẩn Amin cộng nghiên cứu sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm màng bọc cho paracetamol cách phun phủ Kết cho thấy màng cellulose vi khuẩn có khả giữ thuốc giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu sử dụng thuốc[3] Ở nƣớc ta việc nghiên cứu ứng dụng màng cellulose vi khuẩn đƣợc quan tâm năm gần Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ vi khuẩn” Kết cho thấy chế tạo màng với quy mô công nghiệp từ nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm Diclofenac, dẫn xuất acid phenylacetic thuốc chống viêm không steroid Diclofenac đƣợc dùng chủ yếu dƣới dạng muối natri Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau giảm sốt mạnh [7] Natri diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau hạ sốt khả ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào trình sinh tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane chất trung gian gây đau,sốt Hoạt tính chống viêm mạnh aspirin, nhƣng tƣơng đƣơng với indomethacin Chủ yếu đƣợc sử dụng bệnh xƣơng khớp nhƣ: viêm khớp dạng thấp, viêm bao hoạt dịch, viêm gân, viêm khớp vi tinh thể Thuốc dễ dàng đƣợc hấp thụ qua đƣờng tiêu hóa uống, uống lúc đói thuốc đƣợc hấp thụ nhanh [7] Với mục đích đánh giá đƣợc khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu cenlulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus thực đề tài “Nghiên cứu hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu cenlulose Khóa luận tốt nghiệp đại học tạo từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy môi trường nước vo gạo” Mục đích nghiên cứu Đánh giá đƣợc khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy môi trƣờng nƣớc vo gạo Nội dung nghiên cứu Chế tạo đƣợc vật liệu màng, xử lý vật liệu màng trƣớc cho hấp thụ thuốc, xác định lƣợng màng tạo thành Đánh giá khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy môi trƣờng nƣớc vo gạo - Bể ổn nhiệt (Đức) - Máy lắc - Tủ lạnh, tủ lạnh sâu dụng cụ hóa sinh khác * Dụng cụ: - Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml - Pipet 1ml, ml, ml, 10 ml, 25 ml - Micropipet 20-200 µl - Hộp nhựa đĩa 24 giếng để lên men tạo vật liệu cenlulose vi khuẩn có kích thƣớc: 10 x 15 cm, x cm, 1,5 x 1,5 cm, bình tam giác, ống nghiệm dụng cụ hóa sinh khác 2.2 Phạm vi, nội dung nghiên cứu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.2.1 Phạm vi nghiên cứu Đánh giá khả hấp thụ Diclofenac natri vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy môi trƣờng nƣớc vo gạo Khóa luận tốt nghiệp đại học 2.2.2 Nội dung nghiên cứu - Tạo thu màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo - Nạp Diclofenac natri vào màng - Thử nghiệm khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu - Phòng Sinh lý ngƣời động vật, Trƣờng ĐHSP Hà Nội - Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.2.4 Thời gian nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: 15 tuần 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp chế tạo vật liệu cellulose 10 2.3.1.1 Lên men thu vật liệu cenlulose vi khuẩn từ môi trƣờng nƣớc vo gạo Bước 1: Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng Bảng 2.1 Môi trƣờng lên men tạo vật liệu cenlulose Thành phần Hàm lƣợng Glucose 30 g Pepton 10 g Diamoni photphat 0,3 g Amoni sulfat 0,5 g Acid acetic 2% Nƣớc vo gạo 1000 ml Dịch giống 10 % Lƣu ý: pH môi trƣờng đƣợc đo hiệu chỉnh HCl NaOH; pH môi trƣờng đƣợc đo hiệu chỉnh = 4-6,pH thấp tránh bị nhiễm vi khuẩn khác Khóa luận tốt nghiệp đại học Bước 2: Hấp khử trùng môi trƣờng 1130C 15 phút Bước 3: Lấy môi trƣờng khử trùng tia UV 15 phút để nguội môi trƣờng Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống, lắc tay cho giống phân bố dung dịch Bước 5: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thƣớc nghiên cứu, dùng gạc vơ trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh khoảng – 14 ngày 280C Bước 6: Thu vật liệu cellulose thơ, rửa chúng dƣới vịi nƣớc 2.3.1.2 Xử lý vật liệu cenllulose vi khuẩn trƣớc hấp thụ thuốc Mục đích: loại bỏ đƣợc tạp chất môi trƣờng nuôi cấy, đồng thời phá hủy trung hòa độc tố vi khuẩn 11 Phƣơng pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, cellulose tạo thành vật liệu dày mặt môi trƣờng nuôi cấy, ép vật liệu loại bỏ môi trƣờng Để thu đƣợc màng tinh chế ta cần thực bƣớc sau: + Tách màng: Trong nuôi cấy tĩnh, cellulose tạo thành vật liệu dày mặt môi trƣờng nuôi cấy, ép vật liệu loại bỏ môi trƣờng + Ngâm NaOH: Trong vật liệu chứa lƣợng lớn vi khuẩn, vậy, hấp vật liệu NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C thời gian 15 phút nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn giải phóng nội độc tố vi khuẩn thời gian + Ngâm HCl: Màng sau đƣợc ngâm NaOH, rửa nƣớc ép màng Ngâm màng HCl 3% 48 + Ngâm nƣớc: Vớt vật liệu đặt dƣới vòi nƣớc chảy đến vật liệu trắng Thử quỳ tím kiểm tra mơi trƣờng bề mặt vật liệu cenllulose vi khuẩn cần đạt trung tính, ta thu đƣợc cenllulose vi khuẩn tinh khiết 2.3.1.3 Đo độ dày màng Khóa luận tốt nghiệp đại học Độ dày màng đƣợc đo thƣớc kẹp panme, cần đo vị trí khác Sau tính tốn lần đo ta đƣợc độ dày màng cần lấy 2.3.1.4 Đánh giá độ tinh khiết vật liệu màng cellulose Mục đích: Nhằm đảm bảo vật liệu màng cellulose vi khuẩn sau xử lý loại đƣợc tạp chất gây độc hại Chất đƣợc khảo sát đƣờng glucose protein vi khuẩn * Tìm diện glucose vật liệu màng cellulose tinh chế Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling pha để phát diện đƣờng D - glucose, có xuất kết tủa nâu đỏ Tiến hành: + Bƣớc Lấy dịch thử màng sau xử lý hóa học Mẫu đối chứng là: nƣớc cất dung dịch đƣờng glucose 12