Đề cương ôn tập công nghệ di truyền i

Nếu có Mg thì tạo nick trong sợi đôi, nếu có Mn thì cắt cả 2 sợi+ Nếu có Mg thì:+ Nếu có Mn thì:+ Enzyme này thường bị bất hoạt ở 75o C hoặc trong môi trường có nồng độ EGTA 5 mM.+ Cắt đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN I

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2021 - 2025

TP.Thủ Đức, 12/2023

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

CHƯƠNG 1 CÁC ENZYME VÀ THÀNH PHẦN CHỦ YẾU TRONG CLONING 1

1.1 Enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme) 1

1.2 Tính chất của enzyme cắt 1

1.3 Terminal transferase 1

1.4 Methyl hóa 1

1.5 DNA polymerase 2

1.6 Reverse transcriptase 3

1.7 RNA polymerase 3

1.8 DNA ligase 3

1.9 Loại nhóm phosphate (phosphatase) 4

1.10 Nuclease 4

CHƯƠNG 2 GENE CLONING 6

2.1 Vector nhân tạo thế hệ đầu tiên, pBR322 6

2.2 Vector pUC 7

2.3 Nhóm vector pGEM 9

2.4 Vector pBluescript 10

CHƯƠNG 3: THƯ VIỆN DNA, THƯ VIỆN cDNA 14

3.1 Thư viện DNA (DNA genomic library) 14

3.1.1 Khái niệm và chức năng 14

3.1.2 Phương pháp tạo DNA genomic library 14

3.2 Thư viện cDNA (cDNA library) 15

3.2.1 Khái niệm và chức năng 15

3.2.2 Phương pháp lập thư viện cDNA 15

3.2.2.1 Phương pháp tách chiết mRNA từ RNA tổng số 16

3.2.3 Phương pháp tổng hợp cDNA 17

DANH SÁCH CÁC HÌNH

DANH SÁCH CÁC BẢNG

CHƯƠNG 1 CÁC ENZYME VÀ THÀNH PHẦN

CHỦ YẾU TRONG CLONING1.1 Enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme)

- Là các loại enzyme dùng để cắt trình tự chuyên biệt

- Có 3 loại enzyme cắt chủ yếu:

+ Loại I: cắt một đoạn vài chục nu cách vị trí nhận biết từ 1000-5000 nu

+ Loại II: nhận biết trình tự chuyên biệt tại vị trí nhận biết Loại II được chia thành 2 loại: enzyme cắt đầu bằng và đầu dính

+ Loại III: nhận biết trình tự cắt và cắt tại nơi đó với đoạn 20 nu

- Trong môn học Công nghệ di truyền I, chúng ta quan tâm nhiều tới Enzyme cắtloại II hơn

1.2.2 Đối xứng đảo ngược

- Bất kì enzyme cắt giới hạn nào cũng có tính chất đối xứng đảo ngược, tức trình

tự của đoạn F và đoạn R là giống nhau hoàn toàn Vd ở enzyme BamHI ta có:

- Ở các sinh vật prokaryote, chúng thường có cơ chế bảo vệ tế bào chủ bằng

cách dùng enzyme cắt giới hạn cắt các tác nhân bên ngoài không mong muốn Tuy nhiên việc cắt bừa bãi có thể gây tổn hại đến bộ gene của tế bào chủ, để đề phòng trường hợp này, bộ gene của prokaryote sẽ được methyl hóa để enzyme cắt không thể tác dụng lên chính bộ gene của tế bào chủ

- Methyl hóa là quá trình gắn nhóm CH3 vào dATP hoặc dCTP để enzyme cắt không thể cắt được đoạn DNA

- Methyl hóa chỉ có ở prokaryote

1.5 DNA polymerase

- Là enzyme tổng hợp chuỗi polymer từ dNTP

- Luôn luôn tạo ra mạch theo chiều 5’-3’, gắn vào đầu 3’-OH, cần có primer mới

- Có cấu tạo: vùng polymerase + vùng 3’-5’ exonuclease + vùng 5’-3’ exonuclease

- Vùng polymerase + vùng 3’-5’ exonuclease gọi là vùng Klenow Đây là vùng thường được sử dụng để tổng hợp nu, và ứng dụng trong khuếc đại DNA

Hình SEQ Hình \* ARABIC 1 Cấu tạo Pol I

- Vùng polymerase đảm nhận vai trò tổng hợp nu

- Vùng 3’-5’exonuclease đảm nhận cắt bỏ nu khi kéo dài

- Vùng 5’-3’ exonuclease nhận biết trình tự sửa sai khi Pol I trượt (bất kì polymerase nào có đoạn này đều có cơ chế sửa sai) Enzyme này nhận biết trình tự sai lệch bằng cách phát hiện liên kết hóa học sai giữa các nu

1.5.2 DNA polymerase II

- Dùng để tổng hợp DNA mà không cần có primer

1.5.3 DNA polymerase III

- Là enzyme chính dùng để tổng hợp chuỗi mới, tuy nhiên nó không có cơ chế sửa sai

do không có vùng 5’-3’ exonuclease

1.5.4 Một số loại polymerase

1.5.4.1 Không có hoạt tính sửa sai

- Taq polymerase: một trong những polymerase được dùng phổ biến nhất Có khả năng bền nhiệt, và thường sẽ gắn dATP vào đầu 3’ của đoạn DNA sau khi tổng hợp xong Không có hoạt tính 3’-5’ exonuclease nên enzyme này có độ chính xác thấp Thường cần có cofactor là Mg 2+ thì mới hoạt động hiệu quả

- T4 DNA polymerase: có thể sử dụng trong nick translation

- T7 DNA polymerase: dùng nhiều trong giải trình tự DNA

1.5.4.2 Có hoạt tính sửa sai

- Pfu polymerase: bền nhiệt, có hoạt tính sửa sai nên tỷ lệ sai lệch chỉ từ 1,6.10-6

- Pow polymerase

- Bst polymerase

- Tth polymerase: khi có Mg thì tổng hợp DNA từ DNA, khi có Mn thì tổng hợp DNA

từ RNA (phiên mã ngược)

1.6 Reverse transcriptase

- Enzyme tổng hợp cDNA từ mạch khuôn RNA, có nguồn gốc từ các retrovirus

- Thường không có 3’-5’ exonuclease nên có tỉ lệ sai sót cao hơn DNA polymerase

- Cần khuôn và primer mới hoạt động được

- Có hoạt tính RnaseH: exoribonuclease 5’-3’ + 3’-5’ Dùng để phân hủy tổ hợp lai giữa DNA và RNA

1.7 RNA polymerase

- Dùng để tổng hợp RNA từ DNA, không cần primer Cẩn mạch khuôn và promoter

- Các loại RNA polymerase thường được dùng: SP6 và T7 2 loại này cần có Mg mới hoạt động được, đều cần trình tự đặc hiệu

+ Ecoli DNA ligase: nối đầu dính

+ T4 DNA ligase: nối đầu bằng và sole tùy trường hợp Có thể sử dụng để sử vị trí hở trên sợi đôi DNA hoặc thể lai DNA-RNA Vì vậy, nó được sử dụng rất nhiều trong SHPT

1.9 Loại nhóm phosphate (phosphatase)

- Lấy từ Ecoli hoặc các sinh vật bậc cao

- Dùng để loại nhóm phosphate ở đầu mút DNA làm lòi đầu OH ra, ngăn không cho DNA tự đóng vòng

- Enzyme này bị bất hoạt nếu nó gặp tác nhân tạo phức (chelating agents) như EGTA, nồng độ thấp của phosphate vô cơ

1 10 Nuclease

- Dnase I: là endonuclease cắt sợi đôi/đơn DNA khi có mặt của ion 2+ tại vị trí cắt

ngay sau T, C (Có thể hiểu là cắt chỗ nào có T, C ở trong đoạn DNA, không phải các đoạn ở đầu mút) Nếu có Mg thì tạo nick trong sợi đôi, nếu có Mn thì cắt cả 2 sợi+ Nếu có Mg thì:

+ Nếu có Mn thì:

+ Enzyme này thường bị bất hoạt ở 75o

C hoặc trong môi trường có nồng độ EGTA 5 mM

+ Cắt đoạn DNA một cách ngẫu nhiên ở những nơi có T, C

+ Có thể dùng để tinh sạch RNA

- Rnase T2: cắt tất cả liên kết phosphordiester trong DNA

- S1 nuclease: cắt RNA hoặc DNA sợi đơn thành các 5’-mononucleotide

- Exonuclease VII: tạo DNA đầu bằng, loại primer khỏi PCR

- Rnase A: cắt RNA ở 3’phosphate và 3’-phosphooligonucleotide kết thúc ở C, U

- RNAse H: cắt thể lai DNA-RNA, loại bỏ đầu A ở mRNA (do khi phiên mã tổng hợp mRNA thường tự gắn dATP vào cuối)

Hình SEQ Hình \* ARABIC 2 Cơ chế hoạt động

của phosphatase.

CHƯƠNG 2 GENE CLONING2.1 Vector nhân tạo thế hệ đầu tiên, pBR322

2.1.1 Giới thiệu về pBR322

- Vị trí nu đầu tiên là số “0”

- Các vị trí màu xanh là vị trí của enzyme cắt

- amp, tet là gene kháng kháng sinh Vector có mang gene kháng kháng sinh phục vụ cho việc chọn lọc thể biến nạp

- ori là vị trí bắt đầu tái bản

- Chiều mũi tên là chiều của phiên mã

- Vector có độ dài là 4361 bp

2.1.2 Tạo dòng với pBR322

- Xử lí đoạn DNA cần gắn với các enzyme cắt

- Xử lí vector với enzyme cắt

- Cho DNA và vector vào 1 tube, cho DNA ligase vào để nối

- Khả nạp tế bào vi khuẩn, biến nạp DNA tái tổ hợp và tế bào vi khuẩn đó

- Chọn lọc thể biến nạp

2.1.3 Chọn lọc thể biến nạp

Vì sản phẩm nối có nhiều trường hợp: DNA tái tổ hợp, vector tự đóng vòng, DNA tự đóng vòng, nhiều vector tự đóng vòng, Nên ta cần chọn lọc thể mang DNA tái tổ hợp Phương pháp chọn lọc như sau:

H

- Nếu ta cắt vector tại gene kháng amp thì gene amp đã bị bất hoạt Còn tet thì vẫn

có thể biểu hiện được

- Cấy vi khuẩn lên môi trường chứa tetracyline để chọn lọc các thể mang vector, DNAtái tổ hợp

- Lấy các khuẩn đó tiếp tục cấy trên môi trường chúa ampicyline, nếu khuẩn sống sót được thì đó là các khuẩn mang DNA tái tổ hợp hoặc các vecotr tự đóng vòng

- Lấy các khuẩn trên PCR, điện di để phát hiện band của DNA mục tiêu Nếu kết quả cho thấy có band thì đó là vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp

- Khi môi trường có X-gal (dẫn xuất của lactose) thì chất này đóng vai trò là chất cảm ứng, nó kết hợp với protein repressor, làm cho protein này bị thay đổi cấu trúc Dẫn đến việc protein repressor không thể liên kết vào operator và quá trình phiên mã được bắt đầu

2.2.2 Tạo dòng với pUC

- Xử lí đoạn DNA cần gắn với các enzyme cắt

- Xử lí vector với enzyme cắt

- Cho DNA và vector vào 1 tube, cho DNA ligase vào để nối

- Khả nạp tế bào vi khuẩn, biến nạp DNA tái tổ hợp và tế bào vi khuẩn đó

- Chọn lọc thể biến nạp

2.2.3 Chọn lọc thể biến nạp

- Cấy vi khuẩn lên môi trường chứa ampicyline, nếu khuẩn còn sống trên môi trường này thì ta đã loại được trường hợp: khuẩn không mang vector, chỉ nhận DNA mục tiêu

- Bổ sung môi trường cấy với X-gal, IPTG (protein repressor), nếu tại nơi khuẩn cư trú

có màu xanh tức đó là khuẩn mang gene lacZ (mang vector tự đóng vòng, ) không phải thể biến nạp Nếu là màu trắng thì đó là khuẩn mang DNA tái tổ hợp hoặc vector

tự đóng vòng nhưng không mang lacZ (gắn với nhau nhưng ngược lại tạo la-la, cZ-cZ)

- Lấy khuẩn có màu trắng PCR, điện di Nếu có xuất hiện band của DNA mục tiêu thì

đó là khuẩn mang DNA tái tổ hợp

2.2.4 Yêu cầu cần có của vector

- Phải có ori

- Phải có chỉ thị chọn lọc gene kháng kháng sinh

- Phải có trình tự nhận biết đặc biệt của RE

- Phải có chỉ thị nhận biết đoạn DNA: lacZ

- Kích thước phù hợp

- Có thể tạo nhiều bản sao

- Phải được cấy trong vi khuẩn bị tần tật (vi khuẩn không thể sống ở bất kì môi

trường nào khác, tránh bị lây nhiễm ra ngoài môi trường)

2.2.5 Điểm ưu việt của pUC với pBR322

H

- Có thể chọn lọc bằng hệ thống trắng xanh, tăng độ chính xác khi chọn lọc thể biến nạp Tuy nhiên X-gal và IPTG là hai loại hóa chất rất đắt tiền.

- Có MCS, không cần phải thiết kế quá nhiều vị trí đặc biệt của RE

- Có thể chuyển đoạn gene lớn hơn

2.3 Nhóm vector pGEM

2.3.1 Giới thiệu về nhóm pGEM

- Kích thước 3051 bp

- Là loại vector vòng hở, đầu 3’ có đính thêm dNTP tùy loại

- Là nhóm pGEM, nó có 4 loại ứng với 4 loại dNTP: pGEM-T, pGEM-A, pGEM-C,

pGEM-G

- Có đầy đủ các thành phần của 2 loại vector trên

- Có tính ưu việt là không cần phải có trình tự đặc biệt của RE

- Có promoter SP6, T7 nên nó có thể tự tổng hợp RNA

- Khi RNA polymerase gắn vào promoter T7 thì nó sẽ tạo ra RNA hệt như đoạn SP6 và ngược lại

2.3.2 Tạo dòng với vector pGEM-T

Ta có thể dùng phương pháp tương tự như các loại trên Ngoài ra ta còn cách khác như sau:

- Xử lí đoạn DNA mục tiêu với Taq polymerase (vì tính chất của Taq thường gắn dATP vào đầu 3’ khi kết thúc phản ứng) hoặc dùng Terminal transferae cùng dATP để gắn Avào DNA

H

- Dùng ligase để nối vector với DNA mục tiêu

- Khả nạp tế bào vi khuẩn và biến nạp sản phẩm nối vào

- Lấy khuẩn cho kết quả màu trắng PCR, điện di Nếu có xuất hiện band thì đó là khuẩn mang DNA tái tổ hợp

2.3.4 Tính ưu việt của pGEM-T so với pUC

- Có thể tạo dòng mà không cần đến tình tự đặc biệt của RE

- Có khả năng tự tạo ra RNA

2.4 Vector pBluescript

2.4.1 Giới thiệu về pBluescripts

- Là vector có nguồn gốc từ thực khuẩn thể M13, vì vậy nó có thể tự xâm nhiễm theo

cơ chế của các thực khuẩn thể

- Có MCS nằm bên trong lacZ

- Có khả năng tự tạo RNA

H

- Có thể tạo dòng theo 1 chiều (+/-) Nếu là (+) thì tổng hợp ngược chiều kim đồng

hồ, (-) thì theo chiều kim đồng hồ

- Là 1 trong những vector tối ưu nhất hiện nay

2.4.2 Tạo dòng với pBluescript

- Xử lí đoạn DNA và vector với RE, nếu muốn có thể tổng hợp theo 1 chiều thì dùng 2 loại RE khác nhau có trên vector

- Nối DNA với vector bằng ligase

- Lấy khuẩn cho kết quả màu trắng PCR, điện di Nếu kết quả xuất hiện band của DNAmục tiêu thì đó là khuẩn mang DNA tái tổ hợp

2.4.4 Tính ưu việt của pBluescript

- Có thể mang DNA kích thước rất lớn

-Có thẻ tạo DNA dạng vòng đơn theo chiều nhất định

- Khi chuyển vào vi khuẩn thì tự tạo DNA đôi

- Có hệ thống chọn lọc trắng xanh

- Chèn DNA vào theo 1 chiều duy nhất

- Khả năng tự kết nối cực thấp, nhưng vẫn cần phải PCR, điện di cho chắc

- Có cơ chế tự xâm nhiễm của phage

2.5 Phage lambda và Phagemid

2.5.1 Phage lambda, chu trình sinh tan (lytic cycle) và chu trình tiềm tan (lysogenic cycle)

Hình 8 Chu trình sinh tan và tiềm tan của phage.

- Chu trình sinh tan có thay đổi như sau: Khi DNA của phage vào tế bào chất của tế bào chủ thì nó sẽ là dạng vòng, DNA dạng vòng này tự tái bản trong tế bào chủ, sau

đó nó tự cắt thành sợi đôi và gắn liền các DNA đã cắt lại với nhau

2.5.2 Cấu trúc bộ gene của Phage lambda

: L-cos : gene phát sinh hình thái

: R-cos : gene phát sinh hình thái

: Vùng hợp nhất, tái tổ hợp (vùng đệm)

: Vùng điều hòa miễn dịch: Vùng điều hòa chức năng muộn gồm: vùng bắt đầu tái bản vàvùng phân giải tế bào chủ

+ Vùng điều hòa miễn dịch: điều hòa miễn dịch, nếu cắt bỏ thì không ảnh hưởng đến quá trình sống của phage

CHƯƠNG 3: THƯ VIỆN DNA, THƯ VIỆN cDNA3.1 Thư viện DNA (DNA genomic library)

3.1.1 Khái niệm và chức năng

- Tập hợp tất cả các đoạn DNA của bộ gene sinh vật

- Các đoạn DNA được tạo dòng từ vector

- Có chức năng là để phân lập 1 đoạn DNA hoặc xác định vị trí của DNA trên bộ gene

3.1.2 Phương pháp tạo DNA genomic library

Thu nhận DNA sinh vật cần tạo thư viện

Cắt DNA thành các mảnh dựa vào RE

Gắn mảnh DNA lên vector tạo dòng

Biến nạp vào tế bào chủ

Hình 3.1 Tổng quan về cách lập DNA genomic library.

- Có nhiều cách để lập genomic library, các phương pháp này mang bản chất gần nhưtương đương nhau, chỉ khác là sử dụng vật liệu để tạo dòng, có các sách sau:

+ Plasmid: dễ dùng nhất, tuy nhiên chỉ mang được đoạn DNA kích thước nhỏ

và hiệu suất biến nạp tương đối thấp

+ Phage lambda: thông dụng nhất, có thể mang DNA lên đến 20kb

+ Cosmid: có thể mang DNA 40-50kb

+ BAC (Bacterial Artificial Chromosome): chính xác nhất, có thể mang DNA lớn 100-300kb, ít hình thành thể khảm, hiệu quả trong tạo dòng và thu hổi DNA, có khả năng duy trì sự ổn định DNA

+ YAC (Yeast Artificial Chromosome): có thể mang đoạn DNA lớn nhất, nhưng khó xài

- Khi biến nạp, hầu hết đều dùng chung phương pháp (hóa biến nạp, điện biến nạp, shock nhiệt, súng bắn gene, ) riêng với phương pháp dùng phage lambda, ta sử dụng cách cho phage tự xâm nhiễm tế bào chủ (đã thông qua bước đóng gói invitro)

3.2 Thư viện cDNA (cDNA library)

3.2.1 Khái niệm và chức năng

- Tập hợp tất cả các đoạn cDNA của sinh vật (tổng hợp từ mRNA của sinh vật đó)

- Các đoạn cDNA được tổng hợp từ vector

- Chức năng: xét khả năng biểu hiện gene của đoạn đó

3.2.2 Phương pháp lập thư viện cDNA

Tách chiết lấy mRNA:

+ Đuôi polyA + Tách bằng cột sắc kí oligo dT + Ly tâm

Phiên mã ngược RNA thành cDNA

Cắt cDNA thành mảnh bằng RE

Mảnh cDNA gắn với vector

Biến nạp vào tế bào chủ

Hình 3.2 Tổng quan cách lập thư viện cDNA.

3.2.2.1 Phương pháp tách chiết mRNA từ RNA tổng số

- Cơ sở áp dụng: mRNA có cấu trúc luôn chứa đoạn polyA ở đầu 3’

a) Sắc kí cột oligodT-cellulose

- Do mRNA thường có đuôi polyA ở đầu 3’ Nên khi cho RNA tổng số đi qua cột sắc kí,trên cột sắc kí có các oligodT, các mRNA sẽ được giữ lại ở trên cột và các thành phần khác sẽ rớt xuống

- Rửa cột sắc kí bằng dd đệm, đem qua cột sắc kí lần nữa, rửa (có thêm bước này chochắc chắn)

- Định lượng mRNA (Nothern Blot)

3.2.3 Phương pháp tổng hợp cDNA

Primer ngẫu nhiên:

+ Dễ xài+ Thương có độ chính xác thấp, do không biết trình tự đoạn gene có bổ sung với các primer ngẫu nhiên hay không

Primer oligodT:

+ Khả dụng vì mRNA luôn có polyA+ Không đặc hiệu, có thể tổng hợp với các tác nhân nhiễm trong mẫu

Primer bổ sung với đoạn gene:

+ Đặc hiệu nhất+ Phải biết trước trình tự đoạn gene

+ Cắt bỏ RNA

+ Tùy theo trình tự của cDNA mà nó cóthể tự làm primer

+ Tổng hợp mạch còn lại nhưng bị thiếu hụt

+ Sản phẩm cuổi cùng sẽ có thêm các đuôi trùng hợp, sẵn sàng cho việc tạo dòng

Hình 3.3 Tổng quan phương pháp tạo cDNA.

3.2.4 Phương pháp tạo dòng cDNA

3.2.4.1 Hệ thống dG:dC

Chuẩn bị vật liệu vector