Đề cương ôn tập công nghệ di truyền i

Nếu có Mg thì tạo nick trong sợi đôi, nếu có Mn thì cắt cả 2 sợi+ Nếu có Mg thì:+ Nếu có Mn thì:+ Enzyme này thường bị bất hoạt ở 75o C hoặc trong môi trường có nồng độ EGTA 5 mM.+ Cắt đ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC KHOA KHOA HỌC SINH HỌC ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN I ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CƠNG DI TRUYỀN I Niên khóa: NGHỆ 2021 - 2025 Hướng dẫn khoa học: Nhóm sinh viên thực hiện: Ts NGUYỄN VŨ PHONG TRẦN ĐỨC PHÚC TP Thủ Đức, 12/2023 TP.Thủ Đức, 12/2023 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC HÌNH ii DANH SÁCH CÁC BẢNG iii CHƯƠNG CÁC ENZYME VÀ THÀNH PHẦN CHỦ YẾU TRONG CLONING 1.1 Enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme) 1.2 Tính chất enzyme cắt 1.3 Terminal transferase 1.4 Methyl hóa .1 1.5 DNA polymerase 1.6 Reverse transcriptase .3 1.7 RNA polymerase .3 1.8 DNA ligase 1.9 Loại nhóm phosphate (phosphatase) 1.10 Nuclease CHƯƠNG GENE CLONING .6 2.1 Vector nhân tạo hệ đầu tiên, pBR322 .6 2.2 Vector pUC .7 2.3 Nhóm vector pGEM 2.4 Vector pBluescript 10 CHƯƠNG 3: THƯ VIỆN DNA, THƯ VIỆN cDNA 14 3.1 Thư viện DNA (DNA genomic library) 14 3.1.1 Khái niệm chức 14 3.1.2 Phương pháp tạo DNA genomic library 14 3.2 Thư viện cDNA (cDNA library) .15 3.2.1 Khái niệm chức 15 3.2.2 Phương pháp lập thư viện cDNA 15 3.2.2.1 Phương pháp tách chiết mRNA từ RNA tổng số 16 3.2.3 Phương pháp tổng hợp cDNA 17 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Cấu tạo Pol I Hình Cơ chế hoạt động phosphatase Hình Vector pBR322 Hình Vector pUC Hình Cơ chế hoạt động operon lac Hình Vector pGEM-T Hình Vector pBluescript 10 DANH SÁCH CÁC BẢNG CHƯƠNG CÁC ENZYME VÀ THÀNH PHẦN CHỦ YẾU TRONG CLONING 1.1 Enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme) - Là loại enzyme dùng để cắt trình tự chun biệt - Có loại enzyme cắt chủ yếu: + Loại I: cắt đoạn vài chục nu cách vị trí nhận biết từ 1000-5000 nu + Loại II: nhận biết trình tự chuyên biệt vị trí nhận biết Loại II chia thành loại: enzyme cắt đầu đầu dính + Loại III: nhận biết trình tự cắt cắt nơi với đoạn 20 nu - Trong mơn học Công nghệ di truyền I, quan tâm nhiều tới Enzyme cắt loại II 1.2 Tính chất enzyme cắt 1.2.1 Isochizomer - loại enzyme cắt giới hạn tạo loại sản phẩm Tuy nhiên sản phẩm tạo từ nhiều loại enzyme cắt Trường hợp gọi Isochizomer Vd: MboI Sau3AI nhận biết cắt trình tự tạo GATC 1.2.2 Đối xứng đảo ngược - Bất kì enzyme cắt giới hạn có tính chất đối xứng đảo ngược, tức trình tự đoạn F đoạn R giống hoàn toàn Vd enzyme BamHI ta có: 5’- GGATCC – 3’ 3’- CCTAGG – 5’ 1.3 Terminal transferase - Enzyme gắt loại nu vào đầu 3’ đoạn DNA 1.4 Methyl hóa - Ở sinh vật prokaryote, chúng thường có chế bảo vệ tế bào chủ cách dùng enzyme cắt giới hạn cắt tác nhân bên ngồi khơng mong muốn Tuy nhiên việc cắt bừa bãi gây tổn hại đến gene tế bào chủ, để đề phòng trường hợp này, gene prokaryote methyl hóa để enzyme cắt khơng thể tác dụng lên gene tế bào chủ - Methyl hóa q trình gắn nhóm CH3 vào dATP dCTP để enzyme cắt cắt đoạn DNA - Methyl hóa có prokaryote 1.5 DNA polymerase - Là enzyme tổng hợp chuỗi polymer từ dNTP - Luôn tạo mạch theo chiều 5’-3’, gắn vào đầu 3’-OH, cần có primer tổng hợp - Hầu hết polymerase sử dụng kĩ thuật CNSH tạo từ vi khuẩn, virus, phage (Taq polymerase, Pfu polymerase, ) - Ở vi khuẩn có loại polymerase chính: Pol I, Pol II, Pol III 1.5.1 DNA polymerase I - Có cấu tạo: vùng polymerase + vùng 3’-5’ exonuclease + vùng 5’-3’ exonuclease Hình SEQ Hình \* ARABIC Cấu tạo Pol I - Vùng polymerase + vùng 3’-5’ exonuclease gọi vùng Klenow Đây vùng thường sử dụng để tổng hợp nu, ứng dụng khuếc đại DNA - Vùng polymerase đảm nhận vai trò tổng hợp nu - Vùng 3’-5’exonuclease đảm nhận cắt bỏ nu kéo dài - Vùng 5’-3’ exonuclease nhận biết trình tự sửa sai Pol I trượt (bất kì polymerase có đoạn có chế sửa sai) Enzyme nhận biết trình tự sai lệch cách phát liên kết hóa học sai nu 1.5.2 DNA polymerase II - Dùng để tổng hợp DNA mà không cần có primer 1.5.3 DNA polymerase III - Là enzyme dùng để tổng hợp chuỗi mới, nhiên khơng có chế sửa sai khơng có vùng 5’-3’ exonuclease 1.5.4 Một số loại polymerase 1.5.4.1 Khơng có hoạt tính sửa sai - Taq polymerase: polymerase dùng phổ biến Có khả bền nhiệt, thường gắn dATP vào đầu 3’ đoạn DNA sau tổng hợp xong Khơng có hoạt tính 3’-5’ exonuclease nên enzyme có độ xác thấp Thường cần có cofactor Mg 2+ hoạt động hiệu - T4 DNA polymerase: sử dụng nick translation - T7 DNA polymerase: dùng nhiều giải trình tự DNA 1.5.4.2 Có hoạt tính sửa sai - Pfu polymerase: bền nhiệt, có hoạt tính sửa sai nên tỷ lệ sai lệch từ 1,6.10 -6 - Pow polymerase - Bst polymerase - Tth polymerase: có Mg tổng hợp DNA từ DNA, có Mn tổng hợp DNA từ RNA (phiên mã ngược) 1.6 Reverse transcriptase - Enzyme tổng hợp cDNA từ mạch khn RNA, có nguồn gốc từ retrovirus - Thường khơng có 3’-5’ exonuclease nên có tỉ lệ sai sót cao DNA polymerase - Cần khn primer hoạt động - Có hoạt tính RnaseH: exoribonuclease 5’-3’ + 3’-5’ Dùng để phân hủy tổ hợp lai DNA RNA 1.7 RNA polymerase - Dùng để tổng hợp RNA từ DNA, không cần primer Cẩn mạch khuôn promoter - Các loại RNA polymerase thường dùng: SP6 T7 loại cần có Mg hoạt động được, cần trình tự đặc hiệu 1.8 DNA ligase - Tạo liên kết phosphordiester nu kề cận mạch (giữa 5’-phosphate với 3’-OH nu kế tiếp) - Có thể dùng để nối đoạn adaptor linker lại với DNA đầu dính đầu bằng, giúp cho việc nối đoạn DNA, cloning, tạo thư viện DNA, cDNA dễ dàng - Thường khơng bền nhiệt trừ số loại chịu 45-80 o C - số loại cần nhớ: + Ecoli DNA ligase: nối đầu dính + T4 DNA ligase: nối đầu sole tùy trường hợp Có thể sử dụng để sử vị trí hở sợi đơi DNA thể lai DNA-RNA Vì vậy, sử dụng nhiều SHPT 1.9 Loại nhóm phosphate (phosphatase) - Lấy từ Ecoli sinh vật bậc cao - Dùng để loại nhóm phosphate đầu mút DNA làm lịi đầu OH ra, ngăn khơng cho DNA tự đóng vịng - Khi mơi trường có X-gal (dẫn xuất lactose) chất đóng vai trị chất cảm ứng, kết hợp với protein repressor, làm cho protein bị thay đổi cấu trúc Dẫn đến việc protein repressor liên kết vào operator trình phiên mã bắt đầu 2.2.2 Tạo dịng với pUC - Xử lí đoạn DNA cần gắn với enzyme cắt - Xử lí vector với enzyme cắt - Cho DNA vector vào tube, cho DNA ligase vào để nối - Khả nạp tế bào vi khuẩn, biến nạp DNA tái tổ hợp tế bào vi khuẩn H - Chọn lọc thể biến nạp 2.2.3 Chọn lọc thể biến nạp - Cấy vi khuẩn lên môi trường chứa ampicyline, khuẩn cịn sống mơi trường ta loại trường hợp: khuẩn không mang vector, nhận DNA mục tiêu - Bổ sung môi trường cấy với X-gal, IPTG (protein repressor), nơi khuẩn cư trú có màu xanh tức khuẩn mang gene lacZ (mang vector tự đóng vịng, ) khơng phải thể biến nạp Nếu màu trắng khuẩn mang DNA tái tổ hợp vector tự đóng vịng khơng mang lacZ (gắn với ngược lại tạo la-la, cZ-cZ) - Lấy khuẩn có màu trắng PCR, điện di Nếu có xuất band DNA mục tiêu khuẩn mang DNA tái tổ hợp 2.2.4 Yêu cầu cần có vector - Phải có ori - Phải có thị chọn lọc gene kháng kháng sinh - Phải có trình tự nhận biết đặc biệt RE - Phải có thị nhận biết đoạn DNA: lacZ - Kích thước phù hợp - Có thể tạo nhiều - Phải cấy vi khuẩn bị tần tật (vi khuẩn sống mơi trường khác, tránh bị lây nhiễm ngồi mơi trường) 2.2.5 Điểm ưu việt pUC với pBR322 - Có thể chọn lọc hệ thống trắng xanh, tăng độ xác chọn lọc thể biến nạp Tuy nhiên X-gal IPTG hai loại hóa chất đắt tiền - Có MCS, khơng cần phải thiết kế nhiều vị trí đặc biệt RE - Có thể chuyển đoạn gene lớn 2.3 Nhóm vector pGEM 2.3.1 GiớiHthiệu nhóm pGEM - Kích thước 3051 bp - Là loại vector vòng hở, đầu 3’ có đính thêm dNTP tùy loại - Là nhóm pGEM, có loại ứng với loại dNTP: pGEM-T, pGEM-A, pGEM-C, pGEM-G - Có đầy đủ thành phần loại vector - Có tính ưu việt khơng cần phải có trình tự đặc biệt RE - Có promoter SP6, T7 nên tự tổng hợp RNA - Khi RNA polymerase gắn vào promoter T7 tạo RNA hệt đoạn SP6 ngược lại 2.3.2 Tạo dòng với vector pGEM-T Ta dùng phương pháp tương tự loại Ngồi ta cịn cách khác sau: - Xử lí đoạn DNA mục tiêu với Taq polymerase (vì tính chất Taq thường gắn dATP vào đầu 3’ kết thúc phản ứng) dùng Terminal transferae dATP để gắn A vào DNA - Dùng ligase để nối vector với DNA mục tiêu - Khả nạp tế bào vi khuẩn biến nạp sản phẩm nối vào - Chọn lọc thể biến nạp 2.3.3 Chọn lọc thể bién nạp - Cấy vi khuẩn mơi trường chứa ampicyline, khuẩn cịn sống khơng phải khuẩn khơng mang vector, mang DNA mục tiêu, / - Chọn lọc hệ thống trắng xanh, nơi khuẩn cư trú có màu xanh khuẩn mang vector tự đóng vịng, màu trắng khuẩn mang DNA tái tổ hợp, vector tự đóng vịng khơng có lacZ, - Lấy khuẩn cho kết màu trắng PCR, điện di Nếu có xuất band khuẩn mang DNA tái tổ hợp 2.3.4 Tính ưu việt pGEM-T so với pUC - Có thể tạo dịng mà khơng cần đến tình tự đặc biệt RE - Có khả tự tạo RNA 2.4 Vector pBluescript H 2.4.1 Giới thiệu pBluescripts - Là vector có nguồn gốc từ thực khuẩn thể M13, tự xâm nhiễm theo chế thực khuẩn thể - Có MCS nằm bên lacZ - Có khả tự tạo RNA 10 - Có thể tạo dịng theo chiều (+/-) Nếu (+) tổng hợp ngược chiều kim đồng hồ, (-) theo chiều kim đồng hồ - Là vector tối ưu 2.4.2 Tạo dòng với pBluescript - Xử lí đoạn DNA vector với RE, muốn tổng hợp theo chiều dùng loại RE khác có vector - Nối DNA với vector ligase - Chọn lọc thể biến nạp 2.4.3 Chọn lọc thể biến nạp - Cấy vi khuẩn môi trường chứa ampicyline Nếu khuẩn cịn sống khuẩn mang vecotr tự đống vòng, DNA tái tổ hợp, - Chọn lọc hệ thống trắng xanh, màu xanh khơng phải mục tiêu cần tìm, màu trắng khuẩn mang DNA tái tổ hợp, vecotr tự đóng vịng khơng chứa lacZ - Lấy khuẩn cho kết màu trắng PCR, điện di Nếu kết xuất band DNA mục tiêu khuẩn mang DNA tái tổ hợp 2.4.4 Tính ưu việt pBluescript - Có thể mang DNA kích thước lớn -Có thẻ tạo DNA dạng vòng đơn theo chiều định - Khi chuyển vào vi khuẩn tự tạo DNA đơi - Có hệ thống chọn lọc trắng xanh - Chèn DNA vào theo chiều - Khả tự kết nối cực thấp, cần phải PCR, điện di cho - Có chế tự xâm nhiễm phage 11 2.5 Phage lambda Phagemid 2.5.1 Phage lambda, chu trình sinh tan (lytic cycle) chu trình tiềm tan (lysogenic cycle) Hình Chu trình sinh tan tiềm tan phage - Chu trình sinh tan có thay đổi sau: Khi DNA phage vào tế bào chất tế bào chủ dạng vịng, DNA dạng vịng tự tái tế bào chủ, sau tự cắt thành sợi đôi gắn liền DNA cắt lại với 12 2.5.2 Cấu trúc gene Phage lambda : L-cos : gene phát sinh hình thái : R-cos : gene phát sinh hình thái : Vùng hợp nhất, tái tổ hợp (vùng đệm) : Vùng điều hòa miễn dịch : Vùng điều hòa chức muộn gồm: vùng bắt đầu tái vùng phân giải tế bào chủ - Chức vùng: + L-cos R-cos: chất trình tự DNA đầu dính, dùng để gắn vào tế bào chủ + Gene phát sinh hình thái: tạo hình thái, cấu trúc phage gồm: đầu, đuôi, + Vùng đệm: vùng để thêm DNA mục tiêu cần cloning có điều kiện giới hạn để gắn ghép Kích thước DNA mục tiêu phải khoảng 78%-105% tổng độ dài phage để không gây ảnh hưởng xấu đến chức sống phage Ngoài cắt bỏ vùng khơng gây ảnh hưởng đến khả sinh sản phage khơng cịn chế chu trình tiềm tan + Vùng điều hịa miễn dịch: điều hịa miễn dịch, cắt bỏ khơng ảnh hưởng đến trình sống phage 13 CHƯƠNG 3: THƯ VIỆN DNA, THƯ VIỆN cDNA 3.1 Thư viện DNA (DNA genomic library) 3.1.1 Khái niệm chức - Tập hợp tất đoạn DNA gene sinh vật - Các đoạn DNA tạo dòng từ vector - Có chức để phân lập đoạn DNA xác định vị trí DNA gene 3.1.2 Phương pháp tạo DNA genomic library Hình Miêu tả Thu nhận DNA sinh vật cần tạo thư viện Cắt DNA thành mảnh dựa vào RE Gắn mảnh DNA lên vector tạo dòng Biến nạp vào tế bào chủ Hình 3.1 Tổng quan cách lập DNA genomic library 14