Là kỹ thuật phân lập các gen nhờ khả năng của chúng trong việc lai với một đoạn mã oligonucleotide nào đó, đoạn này được chuẩn bị bằng cách dự đoán đoạn mã nucleic acid từ những đoạn mã
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version PGS TS Nguyễn Hoàng Lộc (chủ- http://www.simpopdf.com biên) Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn TS Lê Việt Dũng - TS Trần Quốc Dung Giáo trình Cơng nghệ DNA tái tổ hợp NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 2007 Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Simpo PDF se Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Tai lieu chia mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Phụ lục Một số thuật ngữ Adapter Một oligodeoxyribo tương tự linker, có đầu đầu lồi 5’ tương ứng với vị trí cắt hạn chế vector có đầu tương đồng (xem thêm linker) Adenosine diphosphate (ADP) Một ribonucleoside 5’-diphosphate cấu tạo từ adenine, đường ribose (5C) hai gốc phosphate ADP có tác dụng nhận phosphate chu trình lượng tế bào Adenosine triphosphate (ATP) Một ribonucleoside 5’-triphosphate cấu tạo từ adenine, đường ribose (5C) ba gốc phosphate ATP phân tử chứa lượng hóa học tế bào, (mitochondria) (chloroplast) Các gốc phosphate ATP có mang liên kết bị thủy phân phóng thích lượng tự lớn , ADP thích hóa sinh nội Đơi thủy p (adenosine monophosphate) để phóng thích nhiều Amino acid Là phân tử nhỏ mang gốc amine (-NH3) gốc carboxyl (-COOH) liên kết với nguyên tử carbon Amino acid đơn vị cấu trúc sở chuỗi polypeptide Có 20 amino acid khác chuỗi polypeptide amino acid chuỗi polypeptide polypeptide Ampicillin (Amp) (tái tổ hợp) đ tạo Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công nghệ DNAse tái tổmien hợp 176 BAC (bacteria artificial chromosome) Nhiễm sắc thể nhân tạo Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn vi khuẩn, dựa sở plasmid F-factor, sử dụng làm vector tạo dịng BAC tái E coli với đoạn chèn DNA có kích thước lên đến 300 kb Bản đồ cắt hạn chế (restriction map) Trình tự vị trí nhận biết (recognition sites) tất enzyme hạn chế (restriction enzyme hay restriction endonuclease, RE) phân tử DNA Bazơ base (analog base) hóa nitrogen base , base base adenine (A) adenine ặp - 2-aminopurine Ví dụ: base gắn bắt e (G) bắt -C Bazơ nitơ (nitrogen base) cấu n nucleic acid (DNA RNA) nitrogen base nucleic acid adenine, guanine, cytosine thymine (DNA) uracil (RNA) acid thể sinh vật Bắt cặp bổ sung (complementary base pairing) Sự kết hợp thành đôi nitrogen base nằm hai mạch đơn chuỗi xoắn kép DNA-DNA, DNA-RNA RNA-RNA thông qua mối liên kết hydrogen Sự bắt cặp mang tính đặc hiệu: guanine bắt cặp với cytosine, adenine bắt cặp với thymine DNA uracil RNA Biến nạp (transformation) Là trình truyền DNA ngoại lai vào tế bào nhận, chẳng hạn sphaeroplast protoplast, hợp nhiễm sắc thể nhờ tái tổ hợp tương đồng biến đổi đơn vị chép tự trị (autonomous replicon) Sự biến nạp xuất điều kiện tự nhiên số vi khuẩn (ví dụ: Bacillus, Haemophilus, Neisseria Streptococcus), nhiều vi khuẩn (ví dụ: E coli) thể sinh vật eukaryote biến nạp xuất tế bào “thấm” DNA phương pháp nhân tạo như: hóa biến nạp, điện biến nạp Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công nghệ DNAse tái tổmien hợp 177 Biến nạpse điện (electroporation) Kỹ thuật dùng xung điện tạo Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Tai lieu chia mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn lỗ thủng tạm thời màng sinh chất để đưa DNA ngoại lai vào bên tế bào vật chủ Biến tính (denaturation) Là tượng chuyển từ dạng mạch kép sang dạng mạch đơn DNA RNA thường nhiệt gây nên Biến tính protein tượng chuyển từ cấu hình hoạt động thành dạng khơng hoạt động Biểu gen (gene expression) Là trình phiên mã (transcription) dịch mã (translation) gen để tạo sản phẩm protein Cặp base (base pair, bp) Là liên kết A-T C-G phân tử DNA mạch kép, đơn vị đo chiều dài phân tử DNA Chromosome walking Kỹ thuật dùng để lập đồ nhiễm sắc thể từ tập hợp đoạn DNA cắt hạn chế chồng lên (overlapping) Bắt đầu từ thư viện chứa đoạn DNA nói tạo dòng Một đoạn DNA mang gen biết lựa chọn sử dụng mẫu dị để nhận dạng (ví dụ: cách lai khuẩn lạc) đoạn khác, đoạn chồng lên chứa gen Sau đó, trình tự nucleotide đoạn phân tích nhờ xác định tồn đoạn nhiễm sắc thể Từ đó, đồ vùng đặc biệt xây dựng Chu trình sinh tan (lylic cycle) Một kiểu chu trình sống thực khuẩn thể (bacteriophage) xâm nhiễm vi khuẩn, điều khiển hoạt động sinh sản sinh trưởng gen sinh bacteriophage hệ C (lysogenic cycle) Là tượng hệ gen bacteriophage diện trạng thái ổn định không sinh tan tế bào vật chủ sống Các tế bào vật chủ tiếp tục sinh trưởng phân chia, chép hệ gen bacteriophage (prophage) phối hợp với nhiễm sắc thể vật chủ cho tế bào phân chia prophage chuyển vào hai tế bào Prophage trì cách hợp nhiễm sắc thể vật chủ (ví dụ: bacteriophage λ, bacteriophage Φ105) plasmid bên ngồi nhiễm sắc thể (ví Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công nghệ DNAse tái tổmien hợp 178 dụ: bacteriophage P1 F116) Tế bào vật chủ Simpo PDF se Merge andbacteriophage Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Tai lieu chia mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn biểu kiểu hình biến đổi Chuỗi contig (contiguous sequence) M Chu trình tự d ên (overlapping) (concatemer) Chuỗi mã hóa (coding sequence) Đoạn phân tử DNA mang mã di truyền xác định để phiên mã thành mRNA sau dịch mã thành chuỗi polypeptide Ch (transgenic) Quá trình chuyển ngoại lai (foreign DNA) kỹ thuật khác (Agrobacterium, vi tiêm, bắn gen, xung điện ) vào thể vật chủ (vi sinh vật, động vật thực vật) Chuyển nhiễm (transfection) Kỹ thuật đưa DNA phage DNA virus vào tế bào vật chủ Cosmid Vector lai (hybrid vector) vị trí cos ( h) λ Cơng nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) Hệ thống phương pháp phịng thí nghiệm cho phép cắt đoạn DNA từ sinh vật để ghép nối vào DNA sinh vật khác tạo phân tử DNA tái tổ hợp Phân tử đưa vào sinh vật khác để tạo giống chủng vi sinh vật, thực vật động vật có phẩm chất đặc biệt, đáp ứng nhu cầu ngày cao sản xuất đời sống người Công nghệ có ứng dụng rộng rãi y học, dược học, nông nghiệp nhiều ngành công nghiệp khác Công nghệ sinh học (biotechnology) Theo nghĩa rộng q trình cơng nghiệp có sử dụng vi sinh vật tế bào động vật thực vật (công nghệ sinh học ) Theo nghĩa phổ biến q trình sản xuất sử dụng giống sinh vật mới, tạo công nghệ DNA tái tổ hợp (công nghệ sinh học ) Trong công nghệ sinh học ( , bia, , chăn nuôi ) trước tiên thích hợp Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công nghệ DNAse tái tổmien hợp 179 )PDF se phương pháp Simpo Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Tai lieu chia mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn … cơng nghệ DNA thích hợp hơn, cơng nghệ sinh học vị trí cao cơng nghệ sinh học , gen ta trước Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) triphosphoryl hóa ( DNA N ký hiệu cho nitrogen base (A, G, Deoxyribonuclease (DNase) hủy) DNA sợi đôi DNA sợi đơn ) phân (phân Deoxyribonucleic acid (DNA) ,t nucleotide gốc phosphate nitrogen base DNA khơ hóa (T) (U) kép DNA ợ phiên mã (messenger RNA) mRNA ribosome gọi mRNA dịch Năm 1962, Watson (Mỹ) Crick (Anh) chia sẻ Giải Nobel với Wilkins (Anh) phát minh cấu trúc khơng gian DNA ý nghĩa việc truyền thông tin di truyền Điều đáng tiếc Franklin, người Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công nghệ DNAse tái tổmien hợp 180 đãSimpo có đóng góp đángSplit kểphi cho phát minh mất-trước Theo qui PDF Merge and Unregistered Version http://www.simpopdf.com Tai lieu chia se mien tai: wWw.SinhHoc.edu.vn định Giải Nobel khơng dược phép tặng cho người đứt (nick translation) Phư [ - P]dCTP nhờ enzyme DNA polymerase I E 32 coli (translation) Q trình chuyển thơng tin di truyền trình tự base mRNA sang trình tự amino acid chuỗi polypeptide tế bào gọi trình sinh tổng hợp protein Dịch mã ngược (reverse translation) Là kỹ thuật phân lập gen nhờ khả chúng việc lai với đoạn mã oligonucleotide đó, đoạn chuẩn bị cách dự đoán đoạn mã nucleic acid từ đoạn mã hóa protein biết trước Dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) DNA gen (sequencing) đồng phân Dimer khối thủy (complementary DNA, cDNA) khn mẫu mRNA nhờ q trình transcription) m : m tương ứng (reverse V nhân tạo dựng thư viện cDNA (cDNA library) xây DNA khuôn mẫu (template DNA) (sao chép) khuếch đại DNA (PCR) mẫu DNA polymerase Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công nghệ DNAse tái tổmien hợp 181 Năm 1959, haimien nhà khoa học người Version Kornberg- Ochoa Simpo PDF Merge and Split Unregistered http://www.simpopdf.com Tai lieu chia se phi tai:MỹwWw.SinhHoc.edu.vn nhận Giải Nobel nghiên cứu làm sáng tỏ chế trình chép DNA liên quan đến DNA polymerase I DNA siêu xoắn (supercoiled DNA) DNA xoắn lại thân nó, thường kết gấp khúc, mở xoắn xoắn lại chuỗi xoắn kép DNA DNA (satellite DNA) Là đoạn DNA mang trình tự lặp lại nối tiếp có thành phần khác với trị số trung bình DNA hệ gen DNA vệ tinh heo NA v DNA vệ tinh Dòng (clone) Tập hợp tế bào phân tử giống hệt bắt nguồn từ tế bào hay phân tử ban đầu Dot blot Là k đoạn mồi DNA có đánh dấu đồng vị phóng xạ cắt chế (restriction fragment length polymorphism, RFLP) Tính đa hình chiều dài đoạn cắt hạn chế để sai biệt di truyền vị trí nhận biết enzyme hạn chế (chẳng hạn thay đổi nucleotide) dẫn đến sai biệt chiều dài đoạn hình thành từ phản ứng cắt hạn chế DNA với enzyme RFLP thường dùng để thiết lập đồ di truyền với số marker di truyền biết trước (end labelling) e nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase (blunt end) 5’ lồi (protruding ends) sợi đôi (cohesive ends sticky ends) Đầu tận C (C terminus) Gốc carboxyl (COOH) tự vị trí tận phân tử protein chuỗi polypeptide Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công nghệ DNAse tái tổmien hợp 182 Đầu tận se cùngmien Nand (N terminus) Gốc amine (NH ) ở- vị trí tận Simpo PDF Merge Split Unregistered Version http://www.simpopdf.com Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn phân tử protein chuỗi polypeptide Tất polypeptide tổng hợp từ đầu tận N đến đầu tận C đứt (nick) đứt gãy sợi đơn DNA sợi đôi Điện di gel (gel electrophoresis) Kỹ thuật dùng để phân tách phân tử nucleic acid protein dựa vào dịch chuyển chúng giá thể dạng gel (agarose polyacrylamide) ảnh hưởng điện trường Sự dịch chuyển phân tử phụ thuộc vào điện tích, cấu hình, kích thước khối lượng phân tử nucleic acid protein dung môi nồng độ chất dùng làm giá thể Đoạn cắt hạn chế (restriction fragment) Các đoạn DNA nhỏ sinh sau xử lý đoạn DNA lớn enzyme hạn chế Đoạn kết thúc phiên mã (terminator hay transcription terminator) Trình tự nucleotide nằm cuối gen hoạt động tín hiệu kết thúc phiên mã Nó hiệu cho RNA polymerase giải phóng phân tử RNA tạo thành khỏi gen Lưu ý không nhầm với ba kết thúc (terminator codons hay stop codons: UAG, UAA UGA), xuất mRNA, tín hiệu dừng dịch mã (xem mã vơ nghĩa) Có hai loại terminator phổ biến: Rho-independent terminator (thường cấu trúc thân-quai (stem-loop structure) RNA phiên mã) nằm đầu operons, Rho-dependent terminator (vùng cấu trúc đặc trưng RNA, khơng dịch mã, xem yếu tố Rho) nguyên nhân gây chiều phân cực dịch mã (translational polarity) 76.000) E coli (Klenow fragment) polymerase I (khối 5’ 3’ Đoạn mồi (primer) Một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với mạch DNA khn mẫu có mang đầu 3’-OH tự giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp chuỗi DNA Đoạn nhồi (stuffer fragment) Còn gọi vùng đệm hay vùng trung tâm Là phần phage λ loại bỏ thay đoạn chèn DNA (insert DNA) mà không ảnh hưởng đến khả sinh sản phage tế bào vật chủ Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công nghệ DNAse tái tổmien hợp 183 (palindrome) Đoạn -DNA mạch kép có Simpo PDF se Merge and Split Unregistered Version http://www.simpopdf.com Tai lieu chia mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn trình tự xếp base hai mạch đơn giống hệt đọc theo chiều (chẳng hạn 5’ 3’) Ví dụ: đoạn nhận biết enzyme hạn chế Đóng dấu (replica plating) Phương pháp chuyển nguyên mẫu khuẩn lạc vết tan từ đĩa thạch gốc sang đĩa thạch cách dùng màng nylon (ví dụ: màng Hybond-N+) vừa khít áp lên mặt thạch đĩa gốc để dính lấy tế bào khuẩn lạc (colony) vết tan (plaque) đĩa gốc, đưa màng áp lên mặt thạch t dài gen hóa cho phân kết thúc , Đơn vị chép (replicon) Đoạn DNA điểm khởi đầu chép kéo dài hai phía tới hai điểm kết thúc chép Đơn vị tái tổ hợp (recon) Đoạn DNA gen có chiều dài đủ ngắn để trao đổi chéo khơng thể diễn bên Hiện nay, biết cặp nucleotide Đi polyA (polyA tail) Đoạn trình tự dài 50-200 nucleotide adenine bổ sung vào đầu 3’ hầu hết mRNA eukaryote sau phiên mã E coli (Escherichia coli) Vi khuẩn thường có ruột non động vật có xương sống E coli coi sinh vật mẫu cho việc nghiên cứu hoạt động tế bào Đây vi khuẩn Gram âm có kích thước genome khoản 4×106 base-pair Các q trình biểu gen (phiên mã dịch mã) đôi với nhau, sinh sợi mRNA tổng hợp sử dụng cho q trình dịch mã Khơng có tượng biến đổi sau dịch mã (post-translation) Vì thế, E coli xem tế bào vật chủ đơn giản Rất nhiều thí nghiệm tạo dịng gen thực hàng ngày phòng thí nghiệm sử dụng E coli làm vật chủ với nhiều chủng khác mặt di truyền cho ứng dụng đặc biệt Endonuclease Là enzyme nuclease acid đầu Nuclease thủy phân liên kết phosphodiester Tai lieu chia phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công nghệ DNAse tái tổmien hợp 184