Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất insulin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG  “ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP TRONG SẢN XUẤT HOOCMON INSULIN ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG.” Giảng viên hướng dẫn :GS TS NGUYỄN HOÀNG LỘC Họ tên học viên : NGÔ THỊ VÂN HỒNG Đà Nẵng, ngày 29 tháng năm 2021 MỤC LỤC I MỞ ĐẦU II NỘI DUNG Bệnh tiểu đường 1.1 Khái niệm 1.2 Nguyên nhân 1.3 Phân loại 2 Công nghệ DNA – tái tổ hợp 2.1 Khái niệm 2.2 Quy trình 2.3 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp 2.3.1 Ứng dụng dược phẩm 2.3.2 Các vi khuẩn đặc biệt 2.3.3 Các sản phẩm nông nghiệp 2.3.4 Thuốc oligonucleotide 2.3.5 Liệu pháp gen .9 2.3.6 Chẩn đoán bệnh để can thiệp sớm 2.3.7 DNA fingerprinting 2.3.8 Lập đồ gen Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp sản xuất insulin chữa bệnh tiểu đường 3.1 Sơ lược Insulin 3.2 Quy trình sản xuất insulin cơng nghệ DNA tái tổ hợp 12 III KẾT LUẬN .19 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 20 I MỞ ĐẦU Thế giới ngày phát triển kinh tế, xã hội, khoa học công nghệ, y học….Việc ứng dụng khoa học công nghệ vào lĩnh vực đời sống đặc biệt y học ý quan tâm Hằng năm, có khoảng 36 triệu người chết bệnh khơng truyền nhiễm truyền nhiễm như: bệnh tim mạch, ung thư, tiểu đường, AIDS/HIV, bệnh lao, sốt rét số bệnh khác theo “Thế kỷ 21 kỷ bệnh Nội tiết Rối loạn chuyển hoá” - Dự báo chuyên gia y tế từ năm 90 kỷ XX trở thành thực Tiểu đường vấn đề thời cấp bách sức khoẻ cộng đồng, gây biến chứng nặng nề như: biến chứng thận gây suy thận giai đoạn cuối, biến chứng thần kinh gây giảm chất lượng sống bệnh nhân, nguyên nhân gây cắt cụt chi không chấn thương, biến chứng mắt gây mù lịa, biến chứng tim mạch gây tử vong…(Phạm Ngọc Hoa 2016) Insulin hormone quan trọng có vai trị điều hịa đường huyết tế bào beta đảo Langerhans tuyến tụy sản xuất (Steiner D F 1992) Hàm lượng đường (glucose) máu nguồn lượng thiết yếu cho thể, khơng trì mức bình thường gây bệnh nguy hiểm (Farmer A 2007) Khi đường huyết tăng gây tiết đường qua nước tiểu, dẫn đến mất/thiếu hụt glucose, tượng gọi bệnh tiểu đường Hiện nay, tình hình phát triển bệnh đái tháo đường Việt Nam giới có xu hướng tăng nhanh Do người ln muốn tìm phương pháp để nâng cao sức khỏe, giải bệnh hiểm nghèo Công nghệ DNA tái tổ hợp xem phương pháp tiềm với mong muốn giải vấn đề sức khỏe, sinh trưởng cách kiểm soát biểu cấu trúc gene Với tiến công nghệ sinh học cơng nghệ DNA tái tổ hợp tạo nhiều sản phẩm phục vụ cho vấn đề cải thiện sức khỏe người Insulin hormon tổng hợp nhân tạo, sản xuất công nghệ DNA tái tổ hợp phục vụ điều trị bệnh tiểu đường Năm 2005, nhu cầu insulin dùng trị bệnh đái tháo đường ước tính khoảng đến dự kiến năm 2010 16 Nhu cầu insulin giới vượt qua số vài tấn/năm nguồn cung cấp insulin cho trị bệnh tiểu đường ngày thiếu hụt (Bùi Thị Huyền 2010) Chính lí nên tơi chọn đề tài: “Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp sản xuất hoocmon insulin điều trị bệnh tiểu đường” II NỘI DUNG Bệnh tiểu đường 1.1 Khái niệm Tiểu đường hay gọi đái tháo đường, bệnh rối loạn chuyển hóa carbohydrate, chất béo protein mãn tính, đặc trưng tăng đường máu (glucose) đói tăng cao nguy bệnh tim, đột quỵ, bệnh thận chức thần kinh (BS Bạch Minh 2015) 1.2 Nguyên nhân Tất loại bệnh tiểu đường có điểm chung Thơng thường, thể phân giải carbohydrate từ thức ăn thành dạng đường đặc biệt gọi glucose (đường đơn) Glucose cung cấp nhiên liệu cho tế bào thể Tuy nhiên, tế bào cần insulin, loại hormone máu Để hấp thụ đường sử dụng đường làm lượng Trong bệnh tiểu đường, thể không sản xuất đủ insulin, sử dụng insulin mà thể sản xuất, kết hợp hai rối loạn Khi tế bào dung nạp/hấp thụ glucose, glucose tích tụ máu Lượng đường máu cao gây tổn thương mạch máu nhỏ thận, tim, mắt, hệ thần kinh Đó lý bệnh tiểu đường – đặc biệt không điều trị Cuối gây bệnh tim mạch, đột quỵ, bệnh thận, mù lòa tổn thương thần kinh bàn chân 1.3 Phân loại - Tiểu đường loại Bệnh tiểu đường loại gọi tiểu đường phụ thuộc insulin Nó gọi bệnh tiểu đường khởi phát tuổi vị thành niên, thường thời thơ ấu Bệnh tiểu đường loại loại bệnh tự miễn, xảy thể tự sản sinh loại kháng thể công tuyến tụy Ở người bị bệnh tiểu đường loại 1, tuyến tụy bị tổn thương nên khơng sản xuất insulin Bệnh yếu tố di truyền Bệnh kết tổn thương tế bào beta tuyến tụy Nơi thường sản xuất insulin - Tiểu đường loại Tiểu đường loại dạng phổ biến loại bệnh tiểu đường, chiếm 95% trường hợp tiểu đường người lớn Bệnh tiểu đường loại thường gọi bệnh tiểu đường khởi phát người lớn Tuy nhiên, tăng nhanh tượng béo phì thừa cân trẻ em Nhiều thiếu niên có xu hướng mắc bệnh Bệnh tiểu đường loại gọi bệnh tiểu đường không phụ thuộc insulin Bệnh tiểu đường loại thường nhẹ tiểu đường loại Tuy nhiên, bệnh tiểu đường loại gây biến chứng nghiêm trọng Đặc biệt mạch máu nhỏ nuôi dưỡng thận, thần kinh mắt Bệnh tiểu đường loại làm tăng nguy bệnh tim mạch đột quỵ Với bệnh tiểu đường loại 2, tuyến tụy tạo lượng insulin không đủ cho nhu cầu thể Hoặc tế bào thể đề kháng (thiếu nhạy cảm, không đáp ứng) với insulin Đề kháng insulin, thiếu nhạy cảm với insulin Xảy chủ yếu mô mỡ, gan tế bào Những người béo phì – có với trọng lượng nhiều 20% so với trọng lượng lý tưởng tính theo chiều cao Có nguy mắc bệnh tiểu đường loại vấn đề sức khỏe liên quan cao Những người béo phì thường bị đề kháng insulin Tuyến tụy phải làm việc nhiều để sản xuất thêm insulin lượng insulin không đủ để giữ nồng độ đường máu mức bình thường Công nghệ DNA – tái tổ hợp 2.1 Khái niệm Công nghệ DNA tái tổ hợp tập hợp kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến đổi nghiên cứu đoạn DNA Thuật ngữ tái tổ hợp dùng thường xuyên mục tiêu phối hợp DNA từ hai nguồn xa Ví dụ: gen từ hai nguồn vi khuẩn khác liên kết lại, gen người đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Công nghệ DNA tái tổ hợp (cịn gọi cơng nghệ di truyền, cơng nghệ gen hay kỹ thuật gen…) bao gồm mạng lưới kỹ thuật phân tử dùng để phân tích, biến đổi tái tổ hợp trình tự DNA 2.2 Quy trình Kỹ thuật DNA tái tổ hợp gồm bước sau: - Tách chiết tạo DNA, RNA theo mong muốn (phân lập gen) - Tạo vector tái tổ hợp (chuẩn bị vector tách dòng, enzyme cắt giới hạn enzyme nối) - Chuyển (biến nap) DNA tái tổ hợp tế bào chủ nhân dòng gen - Sàng lọc theo dõi hoạt động gen chuyển vào tế bào chủ, tạo số lượng đoạn DNA theo mong muốn để sử dụng vào mục đích khác 2.2.1 Phân lập gen:  Tách chiết DNA: tùy theo nguồn acid nucleic,có kiểu tách chiết khác nhau: + Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh khối lớn, phá vỡ màng, loại bỏ protein enzim, kết tủa tinh DNA hóa chất, dung mơi, dịch chiết thích hợp + Đối với mơ, tế bào động thực vật, nguyên tắc tách chiết DNA Tuy nhiên trực tiếp lấy mẫu sinh phẩm lơng, tóc, thịt, máu, nước bọt., mơ thân , rễ, lá…  Tách chiết RNA: quy trình tương tự tách chiết RNA, dịch chiết sau làm protein, sử dụng enzim phân hủy RNA, kết tủa thu RNA  Định lượng DNA, RNA: sản phẩm sau tách chiết cần có độ tinh hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng phương pháp đo quang phổ để xác định số hấp phụ, tù đánh giá độ tinh hàm lượng cần thiết Hoặc dùng phương pháp điện di gel thạch xác định băng DNA, RNA, suy độ tinh hàm lượng cần thiết cho nghiên cứu 2.2.2 Tạo vector tái tổ hợp:  Vector tách dòng: phân tử DNA có kích thước nhỏ, có khả gắn gen cần thiết, tự tái bản, tồn tế bào chủ đặc biệt phải mang tín hiệu nhận biết tế bào chủ mang vector tái tổ hợp Các loại vector tách dòng thường dùng : + Plasmid: phân tử DNA dạng vịng, xoắn kép, có tế bào chất vi khuẩn + Phage: phần lớn phagơ Lamda, có hệ gen chứa vị trí thuận lợi cho cài gen khác nhau, giúp gen dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn có khả có khả chép nhanh + Virut tế bào nhân thực: virut SV40, adenovirut, retrovirut, virut herpes… sử dụng tách dòng chuyển gen tế bào động vật, thực vật  Enzym cắt giới hạn: enzym có khả nhận biết đoạn trình tự phân tử DNA cắt DNA điểm đặc hiệu Đồng thời cắt gen từ hệ gen đó, cắt vector tách dịng vector tái tổ hợp, tạo điều kiện gắn đoạn gen cần thiết  Enzym nối Ligase: enzym quan trọng tế bào, chúng xúc tác hình thành liên kết photphodieste để nối đoạn acid nucleic với Có loại enzym nối quan trọng Cơng nghệ di truyền: enzym E.Coli DNA tách chiết từ vi khuẩn E.Coli, enzym T DNA enzym T4 RNA tách chiết từ phage T4 Ngoài ra, ngày người ta cịn sử dụng đoạn nối (đầu dính - adaptor ) cho enzym đầu Adaptor xúc tác nối đoạn DNA enzym cắt đầu từ tạo nên đầu sol Các adaptor đặc trưng riêng cho loại enzym Dùng enzym cắt hạn chế từ hai nguồn DNA khác nhau, qua khâu nối trộn lẫn tạo sản phẩm DNA tái tổ hợp 2.2.3 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dòng gen: Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ theo kỹ thuật biến nạp( chuyển trực tiếp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ) – tế bào chủ vi khuẩn, tế bào động vật, tế bào thực vật; nhờ máy di truyền tế bào chủ nhân DNA tái tổ hợp, tạo sinh khối lớn Những tế bào chủ thường dùng: + Vi khuẩn E.Coli: dễ thao tác, tốn kém, sinh sản nhanh, tạo dòng DNA tái tổ hợp nhanh + Tế bào nấm men, tế bào động vật, thực vật nuôi cấy Invitro, loại tế bào thường dùng vào mục đích cụ thể; nghiên cứu điều hòa hoạt động gen, đột biến gen… Những phương pháp chủ yếu dùng để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận: + Kỹ thuật siêu âm: chuyển gen vào tế bào trần ( thành Xelulose) mơi trường thích hợp + Kỹ thuật xung điện: sử dụng dòng điện cao áp ( khoãng 500V/cm) tạo lỗ thủng nhỏ tế bào trần, tạo điều kiện gen xâm nhập vào hệ gen tế bào chủ + Kỹ thuật vi tiêm: tiêm lượng nhỏ DNA vào tế bào chủ tế bào trứng thụ tinh giai đoạn phôi 4-8 tế bào + Kỹ thuật bắn gen: dùng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển ( súng bắn gen) vào hệ gen tế bào chủ Vi đạn hạt Volfram vàng trộn với gen cần chuyển phụ gia, vi đạn bắn vào viên đạn lớn hơn, bắn, viên đạn lớn giữ lại, vi đạn bắn vào tế bào nhận với gia tốc lớn 2.2.4 Chọn lọc, tạo dòng biểu gen: Việc chọn lọc dịng tế bào ý khơng đơn giản tốn nhiều công sức Khi xác nhận DNA tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào mang gen cần thiết chúng sinh sản để tạo dòng tạo điều kiện cho gen biểu  Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmit tái tổ hợp: sau biến nạp DNA vào tế bào nhận, tạo nhiều dòng tế bào vi khuẩn khác Chúng ni thành dịng khuẩn lạc vi khuẩn (gồm dịng tế bào vi khuẩn khơng nhận plasmit, dịng nhận plasmit khơng có gen lạ dòng nhận plasmit tái tổ hợp) Do muốn nhận tách dịng gen từ thư viện DNA, người ta sử dụng phương pháp: + Lai acid nucleic: làm tan chỗ khuẩn lạc vi khuẩn giấy lọc nitrocellulose DNA thoát gắn với mẫu thử acid nucleic có mang dấu phóng xạ với độ dài hàng trăm nu Nếu tượng bắt cặp bổ sung xảy có nghĩa gen chuyển vào tế bào nhận + Phát kiểu hình: địi hỏi dịng mục tiêu phải có biểu dạng protein dễ phát phép thử + Phản ứng miễn nhiễm: tế bào nhận plasmit có gắn đoạn DNA lạ tế bào vi khuẩn hoạt tính kháng tetracyclin, khuẩn lạc mọc mơi trường có ampicilin, khơng mọc mơi trường có tetrecyclin Đây dòng tế bào cần chọn  Sự biểu gen tạo dịng: nói chung gen lạ sau đưa vào tế bào nhận, muốn gen có biểu tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ yếu tố phiên mã dịch mã phù hợp sở chế điều hòa biểu biểu gen Các vector gọi vector biểu 2.3 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp Cơng nghệ DNA tái tổ hợp có nhiều ứng dụng đời sống Các ứng dụng bao gồm sản xuất dược phẩm loại hóa chất khác, vi khuẩn đặc biệt, trồng nông nghiệp quan trọng, vật nuôi biến đổi di truyền… Kỹ thuật sử dụng rộng rãi xét nghiệm y khoa (trong vài trường hợp) dùng để kiểm tra khiếm khuyết di truyền người Hàng trăm công ty đặc biệt phát triển sản phẩm thông qua biến đổi di truyền thể sống Dưới ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp 2.3.1 Ứng dụng dược phẩm Sản phẩm thương mại phát triển công nghệ DNA tái tổ hợp dược phẩm dùng điều trị bệnh rối loạn người Các dược phẩm sản xuất thông qua công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm: hormone sinh trưởng người (cho trẻ em mắc bệnh cịi), nhân tố tạo tơ huyết (chữa bệnh khó đơng máu), hoạt tố plasminogen mơ (dùng để hịa tan huyết khối bệnh nhân bị nhồi máu tim), interferon, interleukin, DNA vaccine… 2.3.2 Các vi khuẩn đặc biệt Các vi khuẩn có vai trị quan trọng q trình cơng nghiệp, bao gồm sản xuất ethanol từ nguyên liệu thực vật, lọc khoáng từ quặng, xử lý nước thải loại chất thải khác Các vi khuẩn sử dụng trình biến đổi di truyền công nghệ DNA tái tổ hợp cho chúng hoạt động hiệu Các chủng vi khuẩn hữu ích thu từ kỹ thuật đại phát triển để phân hủy hóa chất độc chất gây ô nhiễm, tăng cường thu hồi dầu, tăng nitrogen cho trồng, ức chế sinh trưởng vi khuẩn vi nấm gây bệnh 2.3.3 Các sản phẩm nông nghiệp Công nghệ DNA tái tổ hợp có ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất nơng nghiệp, nơi mà dùng để tạo trồng vật nuôi mang đặc điểm có giá trị Trong nhiều năm, nhà bệnh học thực vật thừa nhận thực vật bị nhiễm bệnh virus thể nhẹ sau kháng lại nhiễm trùng chủng mang độc tính mạnh 2.3.4 Thuốc oligonucleotide Một ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp thời gian gần phát triển thuốc oligonucleotide có trình tự phân tử DNA RNA nhân tạo ngắn dùng để điều trị bệnh Các antisense oligonucleotide bổ sung cho RNA không mong muốn, RNA virus Khi bổ sung vào tế bào, antisense DNA liên kết với mRNA virus ức chế dịch mã chúng Các DNA oligonucleotide sợi đơn liên kết chặt chẽ với trình tự DNA khác, tạo thành phân tử triplex DNA Sự tạo thành triplex DNA cản trở liên kết RNA polymerase protein khác cần cho phiên mã Các oligonucleotide khác ribozyme, phân tử RNA mà chức enzyme Những phức hợp liên kết với phân tử mRNA đặc hiệu cắt chúng thành đoạn, phá hủy khả mã hóa protein chúng Một số thuốc oligonucleotide sẵn sàng để thử nghiệm điều trị bệnh AIDS ung thư 2.3.5 Liệu pháp gen Đối với loại bệnh di truyền, bệnh đột biến gen người ta phải cần đến can thiệp liệu pháp gen, hướng chữa bệnh gắn liền với kỹ thuật tiên tiến lĩnh vực công nghệ sinh học đại vi thao tác gen, sửa đổi thay gen… Liệu pháp gen (gene therapy) thực chất phương pháp chữa bệnh gen Có nhiều khái niệm khác liệu pháp gen, cách hiểu chung tập hợp biện pháp để sử dụng gen cần thiết (còn gọi gen trị liệu) nhằm mục đích chữa bệnh cho người 2.3.6 Chẩn đoán bệnh để can thiệp sớm Bằng kỹ thuật chọc ối, kết hợp đồng thời phân tích máu bố mẹ enzyme hạn chế, người ta chẩn đốn sớm trước sinh (vì enzyme hạn chế có khả phân biệt gen đột biến với gen bình thường) 2.3.7 DNA fingerprinting Sử dụng trình tự DNA để nhận dạng người, gọi DNA fingerprinting, công cụ mạnh để khảo sát tội phạm ứng dụng pháp lý khác 2.3.8 Lập đồ gen Một đóng góp có ý nghĩa cơng nghệ DNA tái tổ hợp cung cấp lượng lớn marker (chỉ thị) di truyền dùng lập đồ gen Một nhóm số marker dùng lập đồ gen restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Nguyễn Hoàng Lộc 2007) Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp sản xuất insulin chữa bệnh tiểu đường 3.1 Sơ lược Insulin 3.1.1 Nguồn gốc Insulin hormon quan trọng, giúp thể hấp thu glucose - thành phần cung cấp lượng cho người Nguồn gốc insulin: + Nguồn gốc động vật: từ tụy bò hay lợn Ngày nay, insulin tinh chế phương pháp sắc kí độ tinh khiết hóa cao + Insulin người Được sản xuất từ insulin động vật qua phương pháp: + Bán tổng hợp từ insulin lợn + Tái tổ hợp gen: loại insulin trung tính đơn thành phần, sản xuất kỹ thuật tái tổ hợp DNA, sử dụng nấm men làm thể sinh sản đạt đến độ tinh khiết hóa chất lượng cao nhất, có cấu trúc giống hệt insulin tự nhiên người, tạo kháng thể thời gian tác dụng ngắn 3.1.2 Cấu tạo Là protein gồm 51 acid amin tạo thành chuỗi polypeptid Ở hầu hết loài, chuỗi A gồm 21 acid amin, chuỗi B gồm 30 acid amin nối cầu nối SS(disulfua) Trọng lượng phân tử khoảng : 5800-6000 Dalton 10 Cấu trúc phân tử insulin Mặc dù trình tự acid amin khác loài số đoạn định phân tử có tính bảo tồn cao, đoạn có chứa cầu nối disulfua, hai đầu chuỗi A nhánh bên đầu COOH chuỗi B Sự tương đồng tình tự acid amin dẫn đến cấu trúc chiều Insulin loài khác giống Insulin chiết rút từ động vật có hoạt tính sinh học cao lồi khác 11 Cấu trúc khơng gian phân tử insulin - Phân loại: Có loại insulin: + Insulin có tác dụng nhanh + Insulin tác dụng bán chậm (trung bình) + Insulin tác dụng chậm + Insulin hốn hợp - Cơ chế: + Thời gian bán hủy 3-5 phút + Bị phá hủy đường tiêu hóa enzym proteinase dày + Hấp thu tốt đường tiêm Mức độ phụ thuộc vào nồng độ insulin, vị trí tiêm, độ sâu mũi tiêm, vận động + Insulin bị chuyển hóa gan, thận, Trong 50% gan 12 + Đào thải qua thận 3.2 Quy trình sản xuất insulin công nghệ DNA tái tổ hợp Tổng hợp Insulin người q trình sinh hóa gồm nhiều bước, gồm hai phương pháp 3.2.1 Phương pháp 1: Tạo chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học tạo tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh  Bước 1: Chuẩn bị gen cần tách dòng Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng sinh học phân tử tách gen mã hoá proinsulin người nhiễm sắc thể số 11 + Tách mRNA gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein Do hầu hết mRNA người có polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với polyA + Sử dụng sắc kí lực với polyT giữ lại mRNA cần thiết cho trình dịch mã; lại loại bỏ DNA RNA khác + Cắt bỏ cầu nối A - T thu mRNA 13 Tách mRNA gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người  Bước 2: Tách thiết kế plasmit tái tổ hợp + Cắt gen mã hoá proinsulin plasmit loại enzym giới hạn Nối DNA ligase phageT4 Trong thành phần vector biểu phải có promoter mạnh giúp gen biểu vi khuẩn + Thiết kế trình tự mã hố cho protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin tế bào chất Nếu sử dụng mRNA tách từ tiến hành sau: + Sao mRNA tinh khiết thành DNA (cDNA) nhờ enzym phiên mã ngược nhờ dNTP (trong phản ứng RT - PCR) + Cài đoạn cDNA mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli  Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca+ tạo lỗ xung điện Tách biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli  Bước 4: Sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp 14 Sau trình biến nạp, cần chọn lọc dịng vi khuẩn mang gen mong muốn Qúa trình chọn lọc phụ thuộc vào quy trình gen đánh dấu vector sử dụng Thông thường sử dụng kháng sinh Ampixilin Tetraxilin để chọn lọc Sau kiểm tra dòng chọn lọc theo nhiều cách khác cách giải đoạn trình tự nucleotic đoạn gen cài vào vector tái tổ hợp so sánh với trình tự gốc  Bước 5: Ni cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phầm Các vi khuẩn chuyển gen sau đưa vào nồi lên men Nuôi chúng nồi lên men với điều kiện tối ưu Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, theo chất dinh dưỡng liên tục bổ sung để đảm bảo tăng trưởng vi khuẩn theo hàm mũ Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi khuẩ nhân lên qua nguyên phân Như vậy, sau thời gian ngắn, sinh khối tăng  Bước 6: Tiền tinh + Sau lên men cần tách tế bào khử trùng nhiệt + Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit + Proinsulin tách khỏi mảnh vỡ tế bào phương pháp li tâm lọc  Bước 7: Hoạt hoá + Do hệ thống E.coli có khả biểu gen insulin khơng có khả hoạt hố insulin + Hoạt hố proinsulin invitro cách xử lý dung dịch đệm, giúp đạt cấu trúc bậc 4, sau dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi sản phẩm thu có hoạt tính cần thiết  Bước 8: Hỗn hợp tinh cịn có insulin + Bằng phương pháp sắc ký, tách phương pháp miễn dịch gắn enzym + Độ tinh insulin đánh giá qua giai đoạn trung gian trình sản xuất nhờ phịng thí nghiệm chun hố Cuối insulin tinh thể hoá 15 Các tinh thể insulin 3.2.2 Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B + Phương pháp tránh việc sản xuất enzim đặc hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin + Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A B Xác định trình tự DNA để qua tổng hợp tách hai dòng gen + Mỗi DNA chèn vào plasmit Sau sản xuất tương tự sản xuất proinsulin + Cuối hai chuỗi A B trộn với hình thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ chất oxi hố định Quy trình sản xuất tóm tắt sau: - Chuẩn bị đoạn oligonucleotide mã hố cho insulin: dựa vào trình tự cấu trúc amino acid insulin gồm 51 amino acid với chuỗi polypeptid A B nối với hai cầu disulfur Người ta tạo dòng gene riêng biệt mã hoá cho hai chuỗi A B - Chuẩn bị vertor: dùng plasmid vi khuẩn hay nấm men - Dùng enzym hạn chế cắt plasmid nối đoạn gene mã hoá cho insulin để tạo vertor tái tổ hợp (thường dùng pBR322) - Chuyển vertor tái tổ hợp pBR322 vào vi khuẩn E.coli 16 - Nuôi cấy (lên men) vi khuẩn E.coli mơi trường thích hợp - Tách chiết thu sản phẩm loại polypeptid A B riêng biệt - Trộn hai loại peptid lại với xử lý phương pháp hoá học hay enzym để tạo cầu disulfur - Kiểm tra chất lượng sản phẩm Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A chuỗi B riêng biệt 17 Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B 3.2.3 Các phương pháp sản xuất khác: + Giả insulin: Cải tiến phương thức hoạt động insulin thể người cách thay đổi trình tự acid amin tạo chất tương tự Insulin giả kết dính với khuếch tán vào máu dễ dàng Quy trình sản xuất Insulin giả tương tự quy trình sản xuất insulin + Phương pháp sản xuất Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất biểu chuỗi A chuỗi B riêng biệt cách sử dụng Escherichia coli, sau thu chuỗi A chuỗi B, trộn với in vitro tạo cầu nối disulfur Phương pháp có hiệu sản xuất thấp Do đó, Eli Lilly phát triển phương pháp cải tiến hơn, phương pháp biểu proinsulin thay biểu chuỗi A B riêng biệt phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A B trypsin carboxypeptidase, tạo thành insulin + Phương pháp sản xuất tập đoàn Novo Nordisk: phương pháp biểu miniproinsulin bao gồm chuỗi B chuỗi A nối với acid amin, biểu nấm men, sau xử lý miniproinsulin in vitro trypsin tạo thành insulin Phương pháp có nhiều thuận lợi cầu nối disulfur hình thành trình biểu trình tiết miniproinsulin, miniproinsulin tách chiết tinh dễ dàng tiết thẳng môi trường nuôi cấy + Phương pháp công ty Bio-Technology General: Trong phương pháp này, dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin biểu tế bào E.coli Bằng cách này, hiệu suất trình biểu protein hiệu trình hình thành cầu nốii Sau đó, proinsulin chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin carboxypeptidase B + Sử dụng tế bào gốc lấy từ máu dây rốn trẻ sơ sinh: Các nhà khoa học Anh Mỹ cho biết họ sử dụng tế bào gốc lấy từ máu dây rốn trẻ sơ sinh để giúp bệnh nhân tiểu đường loại khôi phục khả sản xuất insulin thể  Ưu phương pháp 18 + Insulin tạo gần hoàn chỉnh với cấu trúc Insulin người + Tạo số lượng lớn Insulin thời gian ngắn + Năng suất cao + Nguồn ngun liệu dễ tìm ,khơng nguy hại đến mơi trường + Trong trình tách chiết: dễ thao tác kĩ thuật chuẩn hóa phịng thí nghiệm + Ít tốn chi phí + Giá thành rẻ III KẾT LUẬN Kỹ thuật DNA tái tổ hợp bước tiến phát triển công nghệ sinh học Nhờ giải nhiều toán y học mà trước chưa thể thực Từ việc tách chiết insulin tuyến tụy loài động vật với nhiều nhược điểm như: Cấu trúc khơng hồn tồn giống insulin người, hoạt động chức thể kém, khả hấp thụ kém, quy trình tách chiết địi hỏi kỹ thuật cao, chi phí đắt, giá thành cao, khó sản xuất với qui mơ cơng nghiệp Với cơng nghệ khắc phục hầu hết nhược điểm trên, tạo số lượng lớn insulin phục vụ cho nhu cầu ngày cao người Insulin sản phẩm đầu tiền phục vụ cho y học tạo công nghệ DNA tái tổ hợp Nghiên cứu thành công tiền đề để phát triển tạo nhiều sản phẩm phục vụ cho lĩnh vực y học, từ khâu chẩn đoán, điều trị đến hỗ trợ sức khỏe cho người Cùng với phát triển công nghệ nay, sản phẩm insulin ngày hoàn thiện Mặc dù việc tạo 19 sản phẩm phục vụ sức khỏe công nghệ DNA tái tổ hợp ngày phát triển người nên chủ động phòng bệnh chữa bệnh Ngày nay, bệnh tiểu đường mối lo tồn xã hội, khơng loại trừ độ tuổi mắc bệnh, cần hiểu rõ tác hại bệnh tiểu đường có cách phịng tránh cho thân, gia đình Lập kế hoạch phịng chống bệnh qua thói quen ăn uống sinh hoạt điều độ, phịng ngừa sớm phát tiểu đường để có cách chữa trị tốt Một số biện pháp phòng chống bệnh tiểu đường khuyến cáo là: - Có mức cân nặng hợp lý - Có chế độ ăn uống phù hợp, đường tinh bột - Từ bỏ thuốc chất kích thích - Ngủ đủ giấc - Kiểm tra huyết áp, mỡ máu đường huyết thường xuyên - Lên kế hoạch vận động hợp lý - Lối sống lành mạnh, giảm stress TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT BS Bạch Minh (2015), Bệnh tiểu đường cách phát điều trị, Nhà xuất bạn Lao động Bùi Thị Huyền, Lê Văn Phủng, Phan Văn Chi (2010), Nghiên cứu biểu Insulin người E coli, Tạp chí Khoa học cơng nghệ - Tập 48, số 1, 2010 , Tr 55 – 62 Nguyễn Hoàng Lộc (Chủ biên), Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi (2007), Giáo trình sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Huế Phạm Ngọc Hoa, Nguyễn Huỳnh Nguyên, Lê Thị Mãi, Nguyễn Thị Phương Thùy, Võ Thị Diệu (2016), Tỷ lệ yếu tố nguy bệnh đái tháo đường có biến chứng 20 khoa nội tổng hợp bệnh viện đa khoa An Giang, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Bệnh viện An Giang – Số tháng 10/2016 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Bentley G E., Dodson G D., Hodgkin D., and Mercola D (1976) , Structure of insulin in 4-zinc insulin, Nature 261(5556) 166-168 Dunn M F (2005), Zinc-ligand interactions modulate assembly and stability of the insulin hexamer - a review, BioMetals 18 295–303 Farmer A., Wade A., Goyder E (2007), Impact of self monitoring of blood glucose in the management of patients with non-insulin treated diabetes: open parallel group randomised trial, BMJ 335 132 Steiner D F and James D E (1992), Cellular and molecular biology of the beta cell, Diabetologia 35 (2) S41-S48 TÀI LIỆU INTERNET https://vi.wikipedia.org/wiki/Insulin https://www.bvdkquangnam.vn/index.php/tin-tc/thong-tin-thuc/267-insulin-va-congngh-sn-xut-insulin-bng-dna-tai-t-hp- https://yhoccongdong.com/thongtin/phan-loai-tieu-duong/ 21 ... Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp sản xuất insulin chữa bệnh tiểu đường 3.1 Sơ lược Insulin 3.2 Quy trình sản xuất insulin công nghệ DNA tái tổ hợp 12... tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ yếu tố phiên mã dịch mã phù hợp sở chế điều hòa biểu biểu gen Các vector gọi vector biểu 2.3 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp Công nghệ DNA tái tổ hợp. .. hợp 2.3.1 Ứng dụng dược phẩm Sản phẩm thương mại phát triển công nghệ DNA tái tổ hợp dược phẩm dùng điều trị bệnh rối loạn người Các dược phẩm sản xuất thông qua công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm: