Khảo sát ảnh hưởng bã hèm mật rỉ lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy astaxanthin của tảo haematococcus pluvialis

Mật độ tế bào tảo H.pluvialis khi nuôi trong điều kiện nồng độ chất thải cồn sinh học 60% tăng khoảng 10,5% so với môi trường nuôi cấy chuẩn M1B1 [10].. Một nghiên cứu khác, đã sử dụng m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Ngọc

Đơn vị công tác: Viện Kỹ thuật CNC NTT

Thời gian thực hiện: 06 tháng

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Ngọc

Đơn vị công tác: Viện Kỹ Thuật CNC NTT

Thời gian thực hiện: 06 tháng

Các thành viên phối hợp và cộng tác:

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT



OHM Optimal Haematococcus medium

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Tế bào tảo Haematococcus pluvialis 6

Hình 2 1 Tảo Haematococcus pluvialis sau khi được hoạt hóa 9

Hình 3 1 Dịch nuôi cấy tảo Haematococcus Pluvialis 12

Hình 3 2 Hình thái tế bào tảo Haematococcus Pluvialis 16

Hình 3 3 Mật độ tế bào tảo ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau 17

Hình 3 4 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của tảo 17

Hình 3 5 Trọng lượng khô của tảo Haematococcus pluvialis ở các điều kiện nuôi cấy 17 Hình 3 6 Hàm lượng astaxanthin được tích lũy ở các điều kiện nuôi cấy 17

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

01 Nôi dung 1: Khảo sát nồng độ

CMS

Chọn được nồng độ CMS tối ưu Đánh gia được hàm lượng

Astaxanthin

02 Nội dung 2: Xử lý số liệu và viết

bài báo, báo cáo

01 bài báo đăng tạp chí trong nước bản thảo

Thời gian thực hiện:

Thời gian nộp cuốn báo cáo :

MỞ ĐẦU

Hiện nay, ngành công nghiệp sản xuất cồn của Việt Nam khá phát triển do có nguồn nguyên liệu phong phú và dồi dào Bã hèm mật rỉ (Condensed molasses solubles:CMS) là sản phẩm thừa còn sau quá trình lên men mật mía để sản xuất ethanol CMS được coi là thuộc loại nước thải ô nhiễm nặng, hàm lượng hữu cơ rất cao (ở dạng đậm đặc nước thải

có COD từ 50.000 mg/l đến 100.000 mg/l), pH giá trị rất thấp (từ 4,2 đến 4,5), ngoài ra nhiệt độ cũng khá cao (từ 75oC đến 85oC); và trong 1 tấn mật rỉ sẽ thải ra 3m3 CMS Do

đó, việc giảm thiểu nồng độ ô nhiễm đạt tiêu chuẩn là hết sức khó khăn, đòi hỏi phải kết hợp nhiều phương pháp và nhiều ban ngành

Tảo H.pluvialis là nguồn astaxanthin tự nhiên dồi dào Hàm lượng astaxanthin được

tạo ra phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy Hầu hết tế bào vi tảo đều duy trì ở trạng thái sinh dưỡng, tích lũy rất ít hoặc không tích lũy astaxanthin khi nuôi ở điều kiện thích hợp Tuy nhiên, dưới điều kiện stress, tế bào chuyển sang dạng bào nang không chuyển động và khi được kích thích phù hợp tế bào tảo có thể tích lũy một lượng lớn astaxanthin Vì vậy, điều kiện cho tế bào sinh trưởng và tổng hợp astaxanthin là rất khác nhau Việc xác định rõ ràng pha sinh trưởng tế bào và pha tổng hợp astaxanthin là cần thiết để đạt được mật độ tế bào và hàm lượng astaxanthin cao Trong đó yếu tố về dinh dưỡng môi trường rất quan trọng Sự thiếu hụt nitơ có cảm ứng đến quá trình tạo astaxanthin [1], tuy nhiên khi bổ sung lượng nitơ cao gấp 4 lần môi trường nuôi cấy cơ bản RM thì mật độ tế bào tảo đạt cao nhất Ngoài ra, photpho hoặc dư thừa acetate hoặc

bổ sung các tiền chất carotenoit khác nhau đã được chứng minh có ảnh hưởng đến quá trình tạo astaxanthin [1], [2]

Trước thực trạng và các yếu tố ảnh hưởng đã nêu trên, chúng tôi sử dụng bã hèm

mật rỉ để nuôi cấy tảo H.pluvialis nhằm sử dụng đường cũng như protein và khoáng chất

trong CMS là nguồn dinh dưỡng thay thế cho tảo sinh trưởng, tích lũy astaxanthin; từ đó xây dựng một quy trình nuôi cấy tiết kiệm và hiệu quả vừa giải quyết vấn đề về xử lý nước thải vừa có thêm nguồn thức ăn cung cấp cho thủy sản hoặc phân bón cho nông nghiệp

Kết quả thực nghiệm cho thấy, tảo H.pluvialis có thể sinh trưởng trong môi trường

có chứa CMS Trọng lượng khô được tích lũy cao nhất sau quá trình nuôi cấy ở điều kiện CMS 0,2 % đạt 209,3 mg/L và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu đạt 0,06 mg/L/ngày Hàm lượng astaxanthin cao nhất đạt 2,5 % so với trọng lượng khô ở điều kiện CMS 0,01 %

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tảo Haematococcus Pluvialis

Tảo Heamatococcus pluvialis là tảo lục đơn bào, chu kỳ tế bào được chia làm hai giai

đoạn dựa trên hình thái và sinh lý tế bào là: giai đoạn di động và giai đoạn không di động

Tế bào H pluvialis trong giai đoạn di động có thành mỏng, hai roi và chủ yếu phát triển bằng cách tăng sinh tế bào Ngược lại, tế bào của H pluvialis trong giai đoạn không di

động có vách dày, không roi và xảy ra quá trình tích tụ astaxanthin [3]

Hàm lượng astaxanthin được tích lũy từ 0,5 – 4% trên trọng lượng khô của

H.pluvialis [4] cao hơn rất nhiều so với một số loại vi tảo lục khác như: Neochloris wimmeri, Protosiphon botryoides, Scotiellopsis oocystiformis, Chorella zofingiensis và Scenedesmus vacuolatus (0,27 -1,92% trọng lượng khô) [5]

Khi tiếp xúc với điều kiện môi trường khắc nghiệt H.pluvialis tạo ra một lượng lớn

ketocarotenoid astaxanthin Trong điều kiện tăng trưởng tối ưu, tế bào sinh dưỡng của tảo vẫn tích lũy các carotenoid sơ cấp (- carotene, lutein, violaxanthin, neoxanthin và zeaxanthin) thường được chứa trong lục lạp Tuy nhiên, khi tảo tiếp xúc với các điều kiện hạn chế tăng trưởng thì tế bào bắt đầu tổng hợp astaxanthin, hình thái bắt thay đổi để

thích ứng với môi trường khắc nghiệt Sự hình thành của astaxanthin trong H.pluvialis có

liên quan đến những thay đổi lớn trong hình thái, sinh lý và đặc điểm quang hợp Những thay đổi này được biểu hiện qua việc rụng roi, tạo ra các bào tử trứng bất động, các cơ quan tích tụ lượng lớn lipid trong nguyên sinh chất có chứa astaxanthin, thành tế bào sporopollenin dày có khả năng chống lại sự phân hủy oxy hóa và giảm khả năng quang hợp Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, các ketocarotenoid như canthaxanthin, echinenone, adonirubin và -carotene cũng được tìm thấy trong tế bào tuy nhiên chỉ Dạng roi di động Không roi tích lũy Astaxanthin

Hình 1 1 Tế bào tảo Haematococcus pluvialis

chiếm một lượng nhỏ khoảng một vài phần trăm so với lượng carotenoid tổng Carotenoid chứa các nhóm hydroxy (ví dụ:astaxanthin) thường xuất hiện ở tảo như

Haemato-coccus spp., Oocystis spp., v.v ở dạng hỗn hợp phức tạp của acid béo mono- và

bis-este Những carotenoidacyl este có thể chiếm tới 98% tổng số carotenoid trong chủng tảo đặc biệt này Tỷ lệ chính xác của mono: bis-este phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy [1]

1.2 Astaxanthin và ứng dụng

Astaxanthin [(3S,3'S)-3,3'-dihydroxy-,-carotene-4,4'-dione] là một xanthophyll ketocarotenoid có đặc tính chống oxy hóa mạnh hơn -carotene và Vitamin E, gần đây các ứng dụng của astaxanthin trong dược phẩm đã được nghiên cứu như bảo vệ chống lão hóa do sự oxy hóa của tia UV và viêm [6] Do đặc tính chống ung thư, chất carotenoid nàycũng tìm thấy ứng dụng để tăng cường phản ứng miễn dịch và cải thiện tổn thương

mô, trong ngoài tác dụng điều trị các bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm loét dạ dày và tăng huyết áp [7]

1.3 Bã hèm mật rỉ (Condensed molasses solubles:CMS)

Thành phần CMS bao gồm một lượng nhỏ đường, chất hữu cơ và tro vô cơ Lượng lớn CMS của các nhà máy đường, ethanol thải ra môi trường sẽ là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường nước; bởi chất hữu cơ như các hợp chất của cacbon nitơ, phốt-pho dễ bị phân hủy bởi các vi sinh vật, gây mùi hôi thối cho không khí và nguồn nước Mặt khác, phần lớn các chất rắn lơ lửng dạng vô cơ, khi thải ra môi trường có khả năng lắng và tạo thành một lớp dày ở đáy nguồn nước, phá hủy hệ sinh vật Các khí độc trong quá trình phân hủy

sẽ gây thiếu hụt oxy trong nước, tác động xấu đến hệ sinh thái

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Các nghiên cứu ngoài nước

Astaxanthin là một xanthophyll carotenoid có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, gấp 54 lần so với - carotene, 14 lần so với vitamin E và 65 lần so với vitamin C Khả năng vô hiệu quá các oxy đơn phân tử mạnh hơn vitamin E là 550 lần, vitamin C 6000 lần [8] Chính vì thế, astaxanthin đã được ứng dụng trong nhiều chế phẩm bảo vệ sức khỏe như: tăng cường sức khỏe, giảm nguy cơ mắc các bệnh mạn tính, giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư, bệnh thần kinh, giảm các nguy cơ về các biến chứng bệnh tiểu đường, phụ hồi teo cơ,…[9]

Tảo Heamatococcus pluvialis được xem là nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên

hiệu quả Hàm lượng astaxanthin so với trọng lượng khô chiếm khoảng 0,5 – 4,0% cao hơn gấp 2-3 lần so với một số loại vi tảo khác [5] Chính vì vậy, các nghiên cứu về yếu

tố ảnh hưởng đến khả năng tích lũy astaxanthin được thực hiện nhằm tìm ra môi trường nuôi cấy tảo hiệu quả Nghiên cứu của Mark Harker và các cộng sự đã chỉ ra rằng, yếu tố

dinh dưỡng và vật lý có ảnh hưởng để khả năng tích lũy astaxanthin của H.pluvialis Khi

nuôi cấy tảo dưới các điều kiện khắc nghiệt như: thiếu nitơ, độ mặn và cường độ ánh sáng cao kích thích tảo tạo ra lượng astaxanthin khác nhau [1] Bên cạnh đó, việc giảm chi phí nuôi trồng cũng rất quan trọng Một số nguồn carbon, nitơ “xanh” như: bã hèm mật rỉ, chất thải cồn từ các nhà máy đã được sử dụng trong nuôi cấy tảo nói chung và tảo

H.pluvialis nói riêng Mật độ tế bào tảo H.pluvialis khi nuôi trong điều kiện nồng độ chất

thải cồn sinh học 60% tăng khoảng 10,5% so với môi trường nuôi cấy chuẩn M1B1 [10] Một nghiên cứu khác, đã sử dụng mật mía trong nuôi cấy tảo Chlorella zofingiensis để sản xuất astaxanthin, kết quả cho thấy hàm lượng astaxanthin tăng 42,2% và sinh khối tăng 29,3% khi nuôi cấy trong môi trường chứa 5g/L mật rỉ đường [11] Qua các nghiên cứu cho thấy, các nguồn carbon, nitơ này cho hiệu quả cao về năng suất, đồng thời vừa tiết kiệm chi phí vừa góp phần bảo vệ môi trường

Các nghiên cứu trong nước

Với giá trị sinh học cao và tiềm năng về kinh tế, tảo H.pluvialis đã và đang được

quan tâm ở Việt Nam Các sản phẩm từ tảo được nghiên cứu và ứng dụng để làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi để tăng sản lượng và chất lượng thủy hải sản có giá trị về kinh tế

cao Ví dụ như khi nuôi cá hồi bằng thức ăn có bổ sung H.pluvialis, chất lượng thịt cá hồi

được cải thiện rõ rệt, hàm lượng canxi và DHA cao gấp 4,26 và 1,69 lần so với khi sử dụng cám nhập ngoại và cám trong nước [12]

Ngoài ra, các nghiên cứu về điều kiện ức chế để tăng hàm lượng astaxanthin cũng như sự

tăng trưởng trong nuôi cấy tảo H.pluvialis cũng đã được thực hiện Trong các điều kiện,

ánh sáng và nồng độ nitrat có ảnh hưởng mạnh đến khả năng sinh trưởng và tích lũy

astaxanthin của H.pluvialis [13], [14] Mới gần đây, công nghệ nuôi cấy cố định trên hệ

thống quang sinh học hai lớp màng theo phương ngang đã được thiết lập và tối ưu hóa điều kiện nuôi, kết quả cho thấy tăng sinh khối đạt tối đa là 6,08 g/ngày/m2 với tỷ lệ astaxanthin đạt mức 1,75% lượng sinh khối khô của tế bào và việc thu hoạch tảo được đơn giản hóa hơn

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tảo Heamatococcus pluvialis UTEX2505 được nuôi cấy tại Viện Kỹ thuật Công

nghệ cao trường Đại học Nguyễn Tất Thành.Được nuôi cấy trong môi trường OHM dưới điều kiện ánh sáng trắng cường độ 100 µmol/photon/m2/schiếu sáng và sục khí liên tục ở nhiệt độ 25oC±2 (Hình 2)

Các vật liệu và phương pháp thực hiện trong có thể được hiệu chỉnh và sửa đổi trong quá trình thực hiện đề tài

2.2 Nội dung nghiên cứu: Khảo sát nồng độ CMS

Mục đích: Chọn được nồng độ CMS tối ưu để nuôi cấy tảo H.pluvialis đạt hàm lượng

astaxanthin cao

Trong nội dung nghiên cứu này sử dụng bã hèm mật rỉ đã được xử lý của Công ty Huy Việt Tây Đô dưới dạng chất lỏng sệt Thành phần của CMS đã được xác định như bảng 1 Lấy 1 lượng tảo cho vào erlen 500 mL, bổ sung dung dịch môi trường đã được hấp

vô trùng vừa đủ để đạt mật độ tế bào 1x105 tế bào/mL Nuôi cấy dưới ánh sáng trắng cường độ 100 µmol/photon/m2/s (với chu kỳ sáng: tối, 12 giờ: 12 giờ)

 Thí nghiệm được bố trí với các nghiệm thức sau:

- Dung dịch CMS nồng độ 0,01%

- Dung dịch CMS nồng độ 0,05%

- Dung dịch CMS nồng độ 0,1%

- Dung dịch CMS nồng độ 0,2%

- Môi trường OHM

Hình 2 1 Tảo Haematococcus pluvialis sau khi được hoạt hóa

Xác định được sinh khối khô, mật độ tế bào và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu ở từng nghiệm thức khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy

 Thu sinh khối và định lượng Astaxanthin

- Thu sinh khối: Dịch tảo sau khi đã đạt mật độ và quan sát tế bào bằng kính hiển vi

có màu đỏ đậm đều hết các tế bào sẽ được lọc qua màng lọc nylon monofilament với đường kính lỗ lọc là 25 µm Sau đó rửa tảo nhiều lần với nước cất hấp vô trùng, đem đi đông khô và bảo quản ở tủ -20oC

- Lấy sinh khối tảo khô tiến hành định lượng Astaxanthin

2.3 Phương pháp nghiên cứu

 Quan sát hình thái tế bào H.pluvialis

Hình thái tế bào H.pluvialis được quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng

đại 100x sau các ngày nuôi cấy

 Xác định trọng lượng khô của H.pluvialis

Lấy 10 mL dịch nuôi cấy tảo lọc qua màng lọc, với đường kính màng là 47 mm, đường kính lỗ 20 µm Sau đó tảo được rửa với 20 mL nước cất hấp vô trùng, và sấy khô

ở 103°C suốt 6 tiếng hoặc cho đến khi trọng lượng khô không đổi (g)

 Xác định mật độ tế bào tảo

Sử dụng buồng đến hồng cầu, thêm 10µL dung dịch tảo vào mỗi buồng đếm Đếm 5

ô lớn Mật độ tế bào được tính theo công thức: N= 0,25a ⨯106 tế bào/mL (a: là số tế bào trung bình đếm được

 Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu

Trọng lượng khô tế bào ở hai thời điểm khác nhau trong quá trình tăng trưởng của mẫu tảo được dùng để tính tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (µ: g/L/ngày) trong khoảng thời gian đó theo công thức:

Trong đó: Dry weight 1, Dry weight 2: Trọng lượng khô tại thời điểm 1 và 2

t1, t2: thời điểm 1 và 2

 Định lượng Astaxanthin

- Xây dựng đường chuẩn Astaxanthin

- Tách chiết Astaxanthin: cân 10mg cho thêm 1mL HCl 4M, ủ 70oC trong 5 phút

Ly tâm 6000 vòng/5 phút, bỏ dịch Rửa lại cắn với nước cất hấp vô trùng 2 lần, ly tâm lấy cắn Nghiền cho tơi cắn, cho 1mL aceton và trộ đều; đánh siêu âm 20 phút ở nhiệt độ lạnh Ly tâm thu dịch chiết Lấy dịch chiết cho phản ứng với

enzyme Cholesterol esterase Định lượng astaxathin trong dung dịch chiết sau khi phản ứng bằng phương pháp HPLC

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Hình thái tế bào tảo Haematococcus Pluvialis

Kết quả khảo sát cho thấy, nồng độ CMS trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng

rõ ràng đến hình thái, màu sắc và mật độ tế bào tảo Khi nuôi cấy với CMS, màu sắc dịch

tế bào đậm hơn so với mẫu đối chứng được nuôi trong môi trường OHM Ở nồng độ CMS 0,01% màu sắc tế bào tảo hầu hết đã chuyển sang màu đỏ và kích thước tế bào lớn sau 03 ngày nuôi cấy Các điều kiện CMS 0,05% và 0,1% tế bào dần chuyển sang màu đỏ sau 06 ngày nuôi cấy Bên cạnh đó, tế bào tảo duy trì màu xanh cho đến ngày nuôi cấy 18

và bắt đầu chuyển dần sang màu đỏ khi nuôi cấy trong mô trường CMS 0,2% và OHM (hình 3.2)

Màu sắc dịch nuôi cấy cũng có sự khác biệt rõ ràng, ở điều kiện môi trường OHM và CMS 0,2% màu sắc dung dịch đậm hơn so với ban đầu Các điều kiện CMS 0,05% và 0,1% màu sắc dung dịch nuôi cấy không có sự thay đổi khác biệt, tuy nhiên ở điều kiện 0,01% màu sắc dịch nuôi cấy chuyển sang màu đỏ chỉ sau 5 ngày nuôi cấy (hình 3.1)

Hình 3 1 Dịch nuôi cấy tảo Haematococcus Pluvialis

Nghiên cứu của Mark Harker và các cộng sự đã chỉ ra rằng, yếu tố dinh dưỡng và

vật lý có ảnh hưởng để khả năng tích lũy astaxanthin của H.pluvialis Trong đó, yếu tố về

dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố rất quan trọng Sự thiếu hụt nitơ có cảm ứng đến quá trình tạo astaxanthin [1], trong điều kiện CMS 0,01% hàm lượng dinh dưỡng thấp làm sự sinh trưởng của tảo bị ức chế dẫn đến việc thay đổi màu sắc của tế bào trong một thời gian ngắn Ngược lại, khi trong môi trường giàu dinh dưỡng như OHM và ở các nồng CMS cao hơn nhiều dinh dưỡng hơn kích thích tảo tăng trưởng cho đến khi hàm lượng các chất dinh dưỡng trong dung dịch nuôi cấy bị cạn kiệt tế bào

dần chuyển sang màu đỏ

CMS 0,01% CMS 0,05% CMS 0,10% CMS 0,20% Đối chứng (OHM) Ngày

3.2 Sự tăng trưởng của tảo Haematococcus pluvialis

Kết quả thí nghiệm cho thấy, tảo H.pluvialis có thể sinh trưởng được trong môi

trường có CMS, tuy nhiên do hàm lượng chất khoáng khá thấp dẫn đến sự tăng trưởng của tảo thấp hơn nhiều so với mẫu đối chứng môi trong môi trường OHM

Nồng độ CMS có ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của quần thể tảo H.pluvialis Khi

tăng dần nồng độ CMS mật độ tế bào và trọng lượng khô tăng tỷ lệ thuận theo Sau 12 ngày nuôi cấy ở nồng độ CMS 0,2% tảo cho mật độ cao nhất là 19,3⨯104 tế bào/mL với trọng lượng khô là 192,689 mg/L Kết quả này cao hơn gấp 2 lần khi nuôi cấy tảo

H.pluvialis trong môi trường có bổ sung nước thải sắn 2,5 % với mật độ tế bào tối đạt

9,13 ⨯104 tế bào/mL do tác giả OHC Rodrigues đã công bố Tuy nhiên, mật độ tế bào khi nuôi cấy ở nồng độ CMS này vẫn thấp hơn mẫu đối chứng khi nuôi cấy trong môi trường OHM có thể giải thích do trong điều kiện CMS hàm lượng các chất khoáng thấp không cung cấp đủ chất dinh dưỡng để tảo sinh trưởng và tăng sinh số lượng tế bào Thực nghiệm cho thấy, thời gian của giai đoạn tăng trưởng tỷ lệ thuận với nồng độ CMS Tốc

độ tăng trưởng đặc hiệu khi nuôi cấy ở điều kiện CMS 0,1% là 0,06 mg/L/ngày cao hơn không đáng kể so với các điều kiện còn lại và thấp hơn 2 lần so với mẫu đối chứng (hình 3.3, 3.4 và 3.5, bảng 3.1)

Trong thành phần của CMS có chứa các chất dinh dưỡng (nitơ, phospho) và các vi lượng sắt (Fe) và bo (B) là những yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của vi tảo

H.pluvialis, do đó tảo vẫn có thể sinh trưởng trong môi trường CMS mặc dù môi trường

này khá nghèo nàn về mặt dinh dưỡng Theo nghiên cứu của Bahareh Nahidian và các cộng sự đã cho thấy, N và P rất cần thiết cho quá trình phân chia tế bào do là hai yếu tố

Hình 3 3 Mật độ tế bào tảo ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau

quan trọng cho sự tổng hợp thành tế bào Khi giảm nồng độ N xuống 50% so với lượng N ban đầu trong môi trương BBM, không ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của tế bào; nhưng khi tăng nồng độ N lên gấp 2 – 3 lần làm tăng tỉ lệ tăng trưởng của tảo lần lượt 86% và 14% [15] Trong thí nghiệm này, khi sử dụng CMS để nuôi cấy cho thấy mật độ

tế bào cũng như khối lượng sinh khối khô của tảo cũng không ảnh hưởng đáng kể mặc dù

nồng độ N và P rất thấp Mặt khác, tảo H pluvialis được môi cấy trong môi trường giàu

dinh dưỡng OHM có mật độ tế bào tăng liên tục và cao hơn rất nhiều so với môi trường

CMS Tốc độ tăng trưởng của tảo Haemetococcus pluvialis tăng khi tăng nồng độ Fe 3+

có thể do Fe là xúc tác oxy hóa khử trong hệ thống quang hợp tảo và do đó là sự đồng hóa phân tử NADPH năng lượng cao [15] Kết quả thực nghiệm của đề tài có xu hướng giống với nghiên cứu của Bahareh Nahidian

Hình 3 5 Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu của tảo

Hình 3 4 Trọng lượng khô của tảo Haematococcus pluvialis ở các

điều kiện nuôi cấy

Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự số khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự chữ khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05

150,164 ± 0,332 1bc

153,819 ± 3,469 12bc

3.3 Hàm lượng astaxanthin

Hàm lượng astaxanthin trong tảo Haematococcus pluvialis có bị ảnh hưởng bởi

các môi trường có nồng độ CMS khác nhau Hàm lượng astaxanthin được tích lũy ở điều kiện CMS 0,01% là 3,1% (so với trọng lượng sinh khối khô) cao hơn khi nuôi cấy ở các điều kiện nuôi cấy có nồng độ CMS cao hơn (0,05%; 01,%, 0,2%) Bên cạch đó, thời gian tế bào tảo bắt đầu bị ức chế để tạo astaxanthin tỷ lệ thuận với nồng độ CMS có trong môi trường nuôi cấy Cụ thể, tảo sau 15 ngày nuôi cấy ở điều kiện CMS 0,2% mới bắt đầu đổi màu và tích lũy dần astaxanthin, trong khi đó ở các điều kiện CMS có nồng độ thấp hơn (0,1%; 0,05% và 0,01%) có thời gian chuyển pha tích lũy astaxanthin ngắn hơn; đặc biệt là nồng độ CMS 0,01% chỉ sau 3 ngày nuôi cấy tế bào dần chuyển sang đỏ và tích lũy astaxanthin (hình 3.6)

Khi tiếp xúc với điều kiện môi trường khắc nghiệt, Haematococcus pluvialis sẽ

tích lũy một lượng lớn astaxanthin Trong điều kiện tăng trưởng tối ưu tế bào sinh dưỡng của tảo vẫn tồn tại và chứa các carotenoid thường được tìm thấy trong lục lạp như là fl-carotene, lutein, violaxanthin, neoxanthin và zeaxanthin (thường được gọi chung là carotenoide sơ cấp) Tuy nhiên, khi tảo tiếp xúc với các điều kiện hạn chế tăng trưởng tế bào bắt đầu tổng hợp astaxanthin, đồng thời sẽ có những thay đổi về hình thái, tế bào tròn

và to hơn có vách dày và chuyển dần sang màu đỏ để tồn tại được trong môi trường điều

kiện khắc nghiệt Sự hình thành astaxanthin ở H pluvialis có liên quan đến những thay

đổi lớn trong đặc điểm hình thái, sinh lý và quang hợp của tảo

Hình 3 6 Hàm lượng astaxanthin được tích lũy ở các điều kiện nuôi cấy

Dinh dưỡng và các thông số môi trường là những yếu tố có thể gây ra sự hình

thành astaxanthin trong tế bào của H pluvialis Khi được nuôi cấy trong môi trường

OHM, tảo duy trì trạng thái xanh và tăng trưởng mạnh và chỉ khi các thành phần dinh dưỡng và vi lượng trong môi trường như nitrat bị cạn kiệt khiến sự phát triển trở nên hạn chế, các tế bào bị ức chế và tích lũy astaxanthin Trong nghiên cứu của Mark Harker và các cộng sự đã chỉ ra rõ, khi giảm nồng độ N và P trong môi trường nuôi cấy kích thích tảo tạo astaxanthin [1] Trong môi trường CMS nồng độ N và P thấp hơn rất nhiều so với

môi trường OHM, do đó đã tạo ra một môi trường khắc nghiệt làm tảo H.pluvialis kích

thích tạo astaxanthin Nồng độ CMS càng thấp thời gian tảo chuyển dạng tích lũy astaxanthin càng ngắn