Nghiên Ứu Phương Pháp Xá Định Đa Dư Lượng Kháng Sinh Trong Thịt Bằng Kỹ Thuật Sắ Ký Lỏng Ghép 2 Lần Khối Phổ (Lc-Msms).Pdf

TRƯỜNG ĐẠ Ọ ỘI H C BÁCH KHOA HÀ N I LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phương pháp xác định đa dư lượng kháng sinh trong th ng k thuịt bằ ỹ ật s c ký l ng ghép 2 l n kh i ph ắ ỏ ầ ố ổ (LC MS/MS) PHẠ ỮM H U H[.]

TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nghiên cứu phương pháp xác định đa dư

(LC-MS/MS)

PHẠ M H U HOÈ Ữ Ngành: Công ngh ệthự c ph m ẩ

Giảng viên hướng dẫn: TS Vũ Hồng Sơn Viện: Công ngh sinh h c và Công ngh ệ ọ ệ thực ph m ẩ

HÀ NỘI, 2020

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061132045491000000

TRƯỜNG ĐẠ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ọ Ộ

LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phương pháp xác định đa dư

(LC-MS/MS)

PHẠ M H U HOÈ Ữ

Ngành: Công ngh ệ thự c ph m ẩ

Giảng viên hướng dẫn: TS Vũ Hồng Sơn

Viện: Công ngh sinh h c và Công ngh c ph m ệ ọ ệ thự ẩ

HÀ NỘI, 2020

Chữ ký c a GVHD ủ

C NG HÒA XÃ H I CH Ộ Ộ Ủ NGHĨA VIỆ T NAM

Độ ậ – ự c l p T do H nh phúc – ạ

B N XÁC NH N CH Ả Ậ Ỉ NH SỬ A LU ẬN VĂN THẠC SĨ

H và tên tác gi ọ ả luận văn: Phạm H u Hoèữ

Đề tài lu ận văn: Nghiên cứu phương pháp xác định đa dư lượng kháng sinh trong thịt bằng k ỹthuật sắc ký l ng ghép 2 l n kh i ph (LC-MS/MS) ỏ ầ ố ổ

Ngành: Công ngh ệ thực phẩm

Mã số SV: CA170327

Tác giả, Người hướng d n khoa h c và Hẫ ọ ội đồng ch m luấ ận văn xác nhận tác gi ả đã sửa ch a, b sung luữ ổ ận văn theo biên bản h p Họ ội đồng ngày 03/7/2020 v i các n i dung sau: ớ ộ

- B ổ sung địa điểm, th i gian th c hi n nghiên c u vào ph n n i dung và ờ ự ệ ứ ầ ộphương pháp nghiên cứu

- B sung danh m c các ch viổ ụ ữ ết tắt

- Rà soát k t qu , th ng nh t s d ng dế ả ố ấ ử ụ ấu “,” để ngăn cách giữa phần nguyên và ph n th p phân cầ ậ ủa các số liệ u

- Chỉnh s a l i trình b y, các l i chính t Ch nh s cách trích d n tài ử ỗ ầ ỗ ả ỉ ửa ẫliệu tham kh o theo ả quy định

- B sung gi y xác nh n tham giổ ấ ậ a đề tài nghiên c u, b sung n i dung lứ ổ ộ ời cam đoan, lờ ảm ơn.i c

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những n i dung trong luộ ận văn “Nghiên cứu phương pháp

l n kh i ph (LC-MS/MS)ầ ố ổ ” là k t qu cế ả ủa đề tài nghiên c u cứ ấp cơ sở ạ t i Viện Dinh dưỡng mà tôi là thành viên c a nhóm nghiên c u Các s li u và k t qu ủ ứ ố ệ ế ảtrong luận văn hoàn toàn trung th cự , tôi được phép s d ng, không vi ph m b n ử ụ ạ ảquy n c a b t k tác gi nào khác M i tham kh o dùng trong luề ủ ấ ỳ ả ọ ả ận văn đều được

trích dẫn ngu n g c rõ ràng ồ ố

Tác gi ả luận văn

Phạ m H u Hòe ữ

L Ờ I CẢM ƠN

Qua th i gian c g ng, n l c phờ ố ắ ỗ ự ấn đấu, cùng v i s ớ ự giúp đỡ ủ c a các Thầy

Cô, đồng nghiệp, tôi đã hoàn thành đề tài Qua đây tôi xin gử ờ ảm ơn đếi l i c n các Thầy Cô trong Vi n Công ngh Sinh h c và Công ngh Th c ph m, các Th y Cô ệ ệ ọ ệ ự ẩ ầ

B môn Qu n lý chộ ả ất lượng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong su t quá trình hố ọc

tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dinh dưỡng, Khoa Hóa Thực

ph m, nhóm nghiên c u t i Viẩ ứ ạ ện Dinh dưỡng và đặc bi t là TS Nguyệ ễn Văn Sỹchủ nhiệm đề tài cấp cơ sở ạ t i Viện Dinh dưỡng đã tạo điều kiện giúp đỡtôi trong quá trình th c hiự ện đề tài

Tôi xin t lòng biỏ ết ơn sâu sắc đến TS Vũ Hồng Sơn đã tận tình truyền đạt

nh ng ki n th c trong quá trình h c t p và tr c tiữ ế ứ ọ ậ ự ếp hướng d n, ch b o nh ng ẫ ỉ ả ữkinh nghiệm quý báu đồng thời luôn luôn động viên để tôi hoàn thành tố ềt đ tài.Xin trân trọng cảm ơn!

Tác gi ả luận văn

Phạ m H u Hòe ữ

i

MỤC LỤC

ĐẶ T V N Đ 1 Ấ Ề

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 T ng quan chung v kháng sinh 3 ổ ề 1.1.1 Kháng sinh nhóm quinolone [12] 3

1.1.2 Kháng sinh nhóm penicillin [13] 5

1.1.3 Kháng sinh nhóm sulfonamide [14] 6

1.1.4 Kháng sinh nhóm macrolin [15] 8

1.2 Nghiên cứu v tề ồn dư kháng sinh trong thực ph m 9 ẩ 1.2.1 Tình hình sử ụng kháng sinh trong chăn nuôi hiệ d n nay 9

1.2.2 Các nghiên c u v tứ ề ồn dư kháng sinh trong thực ẩph m 10

1.3 Tác hại của tồn dư kháng sinh trong thực phẩm đối vớ ức khỏe con người s i

13

1.4 Các phương pháp xác định dư lượng kháng sinh trong th c ph m 13 ự ẩ 1.5 Một số quy định v giề ới hạ ồn dư kháng sinh trong thực phẩn t m 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN Ứ C U 18

2.1 Vật liệu nghiên c u 18 ứ 2.2 Chỉ tiêu phân tích 18

2.3 Thiế ị ụt b , d ng c , hóa ch t 18 ụ ấ 2.3.1 Thiết bị ụ, d ng c 18 ụ 2.3.2 Thuốc thử, hóa ch t 19 ấ 2.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích 19

2.4.2 ng dỨ ụng quy trình để xác định dư lượng kháng sinh trong m t s ộ ố m u thẫ ực tế 26

2.5 X ử lý và đánh giá kết qu 26 ả 2.5.1 X ử lý kết quả 26

2.5.2 Đánh giá kết quả 27

CHƯƠNG 3 KẾT QU VÀ TH O LU N 28 Ả Ả Ậ 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 28

3.1.1 Xác định các điều ki n trên LC-MS/MS 28 ệ

ii

3.1.2 Quy trình x lý m u 32 ử ẫ

3.2 Xác nhận giá tr s d ng cị ử ụ ủa phương pháp 34

3.2.1 Độ đặc hiệu/độ chọ ọn l c 34

3.2.2 Khoảng tuyến tính và đường chu n 35 ẩ 3.2.3 Giới hạn phát hi n (LOD) và gi i hệ ớ ạn định lượng (LOQ) 39

3.2.4 Độ chụm (độ ặ ại) l p l 39

3.2.5 Độ đúng của phương pháp (độ thu hồi) 41

3.2.6 Độ không đảm bảo đo 44

3.3 Phân tích m u thẫ ực tế 45

3.4 Thảo lu n 46 ậ 3.4.1 Xây d ng quy trình phân tích 46 ự 3.4.2 Xác ậnh n giá tr s d ng cị ử ụ ủa phương pháp 48

3.4.3 Hàm lượng kháng sinh trong m t s m u thộ ố ẫ ịt tại Hà Nội 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KH O 52 Ả PHỤ Ụ L C : 57

LOQ (Limit of Quantification): Giới hạn định lượng

HPLC (High performance liquid chromatography): S c ký l ng hiắ ỏ ệu năng cao.MRL (Maximum residue Limits): Gi i h n tớ ạ ối đa cho phép

S/N (Signal to noise ratio): T l tín hi u trên nhi u ỷ ệ ệ ễ

iv

DANH MỤC HÌNH V Ẽ

H nh 1.1 ì Công thức cấ ạu t o chung c a quinolone 3 ủ

H nh 1.2 Cân b ng acid base c a quinolone 4 ì ằ ủ

H nh 1.3 Cân b ng acid-base c a fluoroquinolone 5 ì ằ ủ

H nh 1.4 ì Công thức cấ ạu t o chung c a Penicillin 6 ủ

H nh 1.5 ì Công thức cấ ạu t o chung c a sulfonmide 6 ủ

H nh 3.1 Sì ắc ký đồ ủa hỗn hợp dung d ch chu n kháng sinh n c ị ẩ ồng độ 50 µg/L s ử

d ng c t XDB 30 ụ ộ

H nh 3.2 Sì ắc ký đồ ủa hỗn hợp dung d ch chu n kháng sinh n c ị ẩ ồng độ 50 µg/L s ử

d ng c t HC 30 ụ ộ

H nh 3.3 Sì ắc ký đồ ủa hỗn hợp dung d ch chu n kháng sinh n c ị ẩ ồng độ 50 µg/L s ử

dụng pha động gồm nư c và acetontrile đớ ềuchứa 0,1% acid formic 32

H nh 3.4 Sì ắc ký đồ ủa hỗn hợp dung d ch chu n kháng sinh n c ị ẩ ồng độ 50 µg/L s ử dụng pha động g m amonium acetate 5mM và acetontrile ch a 0,1% acid formicồ ứ 32

H nh 3.5 ì Độ thu h i c a các ch t phân tích khi làm s ch trên c t HLB và ồ ủ ấ ạ ộ Bondesil C18 33

H nh 3.6 Sì ắc ký đồ m u tr ng không ch a kháng sinh 34 ẫ ắ ứ H nh 3.7 Sì ắc ký đồ m u tr ng thêm chu n nẫ ắ ẩ ở ồng độ 50 µg/kg 35

H nh 3.8 ì Đường chu n cẩ ủa 16 kháng sinh 38

H nh 3.9 Sì ắc ký đ chuẩồ n enrofloxacin 2 ppb 46

H nh 3.10 Sì ắc ký đồ ẫ m u TL01 có enrofloxacin 46

v

DANH M C Ụ BẢNG

B ng 1.1 ả Công thức ấ ạc u t o c a mủ ột số sulfonamide ph bi n 7 ổ ế

B ng 1.2 ả Ưu và nhược điểm của các phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh

15

B ng 1.3 ả Giới hạ ối đa cho phép củn t a kháng sinh theo EU và Vi t Nam 16 ệ B ng 2.1 ả Danh sách các kháng sinh trong phạm vi nghiên c u 18 ứ B ng 2.2 ả Chương trình gradient pha động s d ng c t XDB C18 20 ử ụ ộ B ng 2.3 ả Chương trình gradient pha động s d ng c t HC-ử ụ ộ C18 21

B ng 2.4 Th tích dung dả ể ịch chuẩn thêm vào m u tr ng 24 ẫ ắ B ng 2.5 ả Độ ặ ại tối đa chấ l p l p nh n t i các nậ ạ ồng độ khác nhau [29] 27

B ng 2.6 ả Độ ặ ại tối đa chấ l p l p nh n t i các nậ ạ ồng độ khác nhau [29] 27

B ng 3.1 Thông s chung cho các ch t phân tích 28 ả ố ấ B ng 3.2 Thông s ả ố chi tiết của các ch t phân tích 28 ấ B ng 3.3 Kả ết quả phân tích dãy chu n cẩ ủa ofloxacin 35

B ng 3.4 T ng hả ổ ợp đường chu n cẩ ủa 16 chất phân tích 36

B ng 3.5 ả Độ ặ ại tại 3 điể l p l m nồng độ ủa c ofloxacin 39

B ng 3.6 ả Độ ặ ại của phương pháp l p l 40

B ng 3.7 ả Độ thu hồi tạ ồng đội n 50µg/kg của ofloxacin 41

B ng 3.8 ả Độ thu hồi tạ ồng đội n 100µg/kg của ofloxacin 41

B ng 3.9 ả Độ thu hồi tạ ồng đội n 150µg/kg của ofloxacin 42

B ng 3.10 T ng hả ổ ợp độ thu hồi của 16 chất phân tích 43

B ng 3.11 ả Độ không đảm bảo đo của phương pháp 44

B ng 3.12 Kả ết quả phân tích 9 m u thẫ ịt (đơn vị µg/kg) 45

1

ĐẶ T V N Đ Ấ Ề

An toàn th c phự ẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác b o v sả ệ ức kho ẻ con người Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề ử ụ s d ng thu c kháng sinh ố(trong thức ăn, điều tr b nh gia súc, gia c m) là r t ph biị ệ ầ ấ ổ ến và được coi là một

tiến b c a công ngh sinh h c Tuy nhiên, vi c l m d ng ộ ủ ệ ọ ệ ạ ụ thuốc kháng sinh có thể làm ngu n th c ph m cung cồ ự ẩ ấp cho con người còn ch a mứ ột lượng nh ch t ỏ ấkháng sinh, ngườ ử ụi s d ng lo i th c ph m này trong th i gian dài có th gây ạ ự ẩ ờ ểnguy h i cho sạ ức khoẻ

Kháng sinh đượ ử ục s d ng nhiều trong lĩnh vực y t và nông nghiế ệp đặc biệt

là chăn nuôi Trên cả th gi i, ngành nông nghiế ớ ệp đã sử ụ d ng 63.200 t n kháng ấsinh các loại trong năm 2010 và dự báo đến năm 2030 lượng kháng sinh s ẽ tiếp

tục tăng thêm 2/3 so với năm 2010 (khoảng 105.600 t n) và Vi t Nam là mấ ệ ột trong năm quố gia được c d ự báo là lượng s d ng kháng sinh cao nh t trên th ử ụ ấ ế

gi i Theo báo cáo c a C c Thú y thì có kho ng 4109 lo i kháng sinh khác nhau ớ ủ ụ ả ạđang được s d ng trong nông nghi p hi n nay, t l ử ụ ệ ệ ỉ ệ kháng sinh được s d ng ử ụtrong chăn nuôi hiện nay là penicillin (9%), tetracycline (66%), macrolinee (12%), aminoglycoside (4%), fluoroquinolone (1%), trimethomprim (2%) và các kháng sinh khác (6%) [1] Vi c s d ng nhi u loệ ử ụ ề ại kháng sinh trong chăn nuôi

m t th i gian dài s ộ ờ ẽ xuất hi n vi khu n kháng kháng sinh trong th c phệ ẩ ự ẩm ảnh hưởng đến s c khứ ỏe con người Tình tr ng kháng kháng sinh Vi t Nam hi n ạ ở ệ ệnay đang có xu hướng tăng từ 30-80%, trong đó sự kháng kháng sinh c a ph c u ủ ế ầStalophycocus neumoniae với chloramphenicol tăng từ 9,4% năm 2002 đến

36,5% năm 2004 Theo kết qu nghiên c u c a d ả ứ ủ ự án “Nghiên cứu cơ chế lan truy n và xây d ng mô hình giám sát vi khuể ự ẩn kháng kháng sinh lưu hành trong thực ph m ởẩ Việt Nam” thì 60% người lành mang trùng nhi m vi khu n kháng ễ ẩkháng sinh và 50% thực ph m t gia súc và th y s n nhi m vi khu n kháng ẩ ừ ủ ả ễ ẩkháng sinh [2]

Để ả b o v quy n l i cệ ề ợ ủa người tiêu dùng, châu Âu, t chở ổ ức EU đã thiết

l p gi i h n l n nhậ ớ ạ ớ ất (MRLs) đố ới dư lượi v ng thu c trong ngu n th c ph m khi ố ồ ự ẩcung cấp cho con người vào năm 2009, trong đó quy định rõ hàm lượng kháng sinh theo t ng lo i th c ph m và t ng lo i thu c, ví d ừ ạ ự ẩ ừ ạ ố ụ như với enrofloxacin trong cơ, gan, thận c a bò, l n, gia c m (gà, v t) là 30µg/kg; trong s a bò là 100 ủ ợ ầ ị ữ

c u trên th giứ ế ới đã xây dựng thành công phương pháp xác định được đồng thời 2-4 nhóm kháng sinh khác nhau trong th c ph m [7],[8],[9] bự ẩ ằng phương pháp

s c ký l ng kh i phắ ỏ ố ổ, ưu điểm của phương pháp này có độ nhạy, độ chính xác cao, đơn giản, ti t ki m hóa ch t, th i gian phân tích nhanh Vì v y nhóm nghiêu ế ệ ấ ờ ậ

cứu đã triển khai đề tài Nghiên cứu phương pháp xác định đa dư lượng kháng sinh trong th t b ng k ị ằ ỹ thuậ ắt s c ký l ng ghép 2 l n kh i ph ỏ ầ ố ổ (LC-MS/MS) với các m c tiêu sau:ụ

- Xây dựng quy trình phân tích đồng th i 2 nhóm kháng sinh (quinolone, ờmacrolide) trong th t bị ằng phương pháp sắc ký l ng ghép 2 l n kh i ph ỏ ầ ố ổ (LC-MS/MS), đảm bảo độ chính xác và tin cậy theo quy định c a AOAC và ISO ủ

17025

- ng d Ứ ụng quy trình đã xây dựng để xác định tồn dư đa kháng sinh trong

một số ẫ m u th t thu th p tị ậ ại Hà Nội

3

CHƯƠNG 1 Ổ T NG QUAN 1.1 T ng quan chung v ổ ề kháng sinh.

Kháng sinh đã và đang đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi và nuôi trồng th y s n, không ch phòng và tr bủ ả ỉ để ị ệnh mà còn được dùng li u th p ở ề ấ

nhằm kích thích sinh trưởng [1] Tuy nhiên, vi c l m d ng, s d ng b t h p pháp ệ ạ ụ ử ụ ấ ợ

ho c s d ng sai nguyên t c thu c thú y nói chung và kháng sinh nói riêng trong ặ ử ụ ắ ốchăn nuôi và nuôi trồng th y sủ ản đã gây hiện tượng kháng thu c ho c tố ặ ồn dư thuốc trong s n ph m, ả ẩ ảnh hưởng xấu đến s c kh e c nứ ỏ ộ g đồng, môi trường cũng như hiệu qu ả điều tr b nh [10],[11] Chính vì vị ệ ậy, để tăng cường kiểm soát dư lượng thuốc, các nước phát triển đã có những qui định r t ch t ch và ki m soát ấ ặ ẽ ểnghiêm ng t Ch ng hặ ẳ ạn, EU đã ban hành quyết định s ố 37/2010 quy định gi i ớ

h n tạ ồn dư thuốc thú y cho phép trong s n phả ẩm động vật [3] và thông tư 24/2013/TT-BYT v ề “Mức quy định gi i h n tớ ạ ối đa dư lượng thu c thú y trong ốthực phẩm” [4]

1.1.1 Kháng sinh nhóm quinolone [12]

1.1.1.1. Giới thiệu chung v quinolone ề

Quinolone là những kháng sinh t ng hổ ợp Acid nalidixic là quinoline đầu tiên được cơ quan Quản lý Th c phự ẩm và Dược ph m M chuẩ ỹ ẩn y vào năm 1963

để điều tr nhiị ễm trùng đường tiểu Đến nay các quinolone vẫn được s d ng ử ụ

r ng rộ ãi để điều tr ị cho người và v t nuôi, vì s an toàn và kh ậ ự ả năng kháng khuẩn

r ng Trong c u t o chung c a nhóm quinolone, có hai c u trúc vòng: m t là ộ ấ ạ ủ ấ ộnhân naphthyridine v i nitrogen v trí 1 và 8, và m t là nhân quinolone ch ớ ở ị ộ ỉ có

m t nitrogen v trí s 1 (Hình 1.1) T t c các h p ch t, c quinolone và ộ ở ị ố ấ ả ợ ấ ảnaphthyridone, ch nhóm ceton v trí 4 và bên c nh là nhánh carboxylic acid ứ ở ị ạ ở

v ị trí 3

Fluoroquinolone thu c v ộ ề thế ệ thứ h hai c a quinolone và có hi u qu ủ ệ ả hơn, chống được c hai khuả ẩn gram dương và âm mà các khuẩn này kháng c ự được

4

các kháng sinh khác Fluoroquinolone là d n xu t piperazinyl c a nalidixic acid ẫ ấ ủ

ở nguyên t C7 và có m t nguyên t F v trí s ử ộ ử ở ị ố 6 nên còn được g i là nhóm ọpiperazinyl quinolone (PQ)

1.1.1.2. Tính chất hóa lý c a quinolone ủ

a Tính chất vật lý

Các h p chợ ất quinolone thường là ch t k t tinh không màu, ho c b t tr ng ấ ế ặ ộ ắbay hơi vàng không mùi Các quinolone có nhiệt độ nóng ch y cao (norfloxacin ả221°C) D ng t ạ ự do khó tan trong nước, d ễ tan trong môi trường ki m D ng ề ạmuố ễ tan trong nưới d c T t c ấ ả các quinolone đều b n nhiề ệt nhưng bị phân h y ủ

với ánh sáng

b Tính chất acid-base

Các quinolone có vòng naphthyridine hay vòng quinolone ch a N v trí 1 ứ ở ị

và 8 Cà hai N v ở ị trí này đều liên h p v i h vòng và nhóm carboxylic nên cặp ợ ớ ệđiệ ử ựn t t do của N không còn định v t i v trí N mà phân tán trên toàn b h ị ạ ị ộ ệliên h p Chính vì v y mà chúng có tính base r t yợ ậ ấ ếu Trong khi đó nhóm carboxylic g n v trí s 3 th hi n tính acid (ắ ở ị ố ể ệ Hình 1.2)

H nh 1.2 Cân b ng acid base c a quinoloneằ ủNhững quinolone ch có m t giá tr ỉ ộ ị pKa còn được g i là acidic quinoline ọ(AQ) Các giá trị pKa cuả acid quinolone trong khoảng t 6÷6,9 ừ

Các piperazinyl quinolone ngoài nhóm COOH còn có N trên vòng piperazine,nên ngoài giá tr pKị 1 c a nhóm COOH còn có giá tr ủ ị pK2 liên quan

đến s nh n thêm 1 proton N v trí 4 c a vòng piperazine Trong dung d ch ự ậ ở ở ị ủ ịnước các PQ t n t i ba d ng: catiồ ạ ở ạ on, lưỡng c c và anion (Hình 1.3) ự

5

H nh 1.3  Cân bằng acid-base c a fluoroquinoloneủ

Các piperazinyl quinolone có pKa1 trong kho ng 5,5÷6,6 và pKả a2 trong kho ng 7,2÷8,9 Do ả ảnh hưởng c a nhóm piperazine, hút ủ điện t dử ẫn đến H+ ởnhóm COOH linh động hơn nên tính acid của PQ lớn hơn AQ

c Tính ch t quang h c ấ ọ

Khả năng hấp th ánh sáng trong vùng t ngo i (UV) ụ ử ạ

ng ch t có ch a nhi u nQuinolone là nhữ ấ ứ ề ối đôi (C=O, COOH, vòng thơm) nên hấp th m nh trong vùng UV Ki-Mụ ạ in Bark và đồng s ự đã khảo sát

ph h p th c a hai quinolone là norfloxacin và flumequine có cổ ấ ụ ủ ực đại h p thu ấtương ứng lần lượt g n vùng 280 nm và 250 nm c ầ ả trong môi trường nước, acetonitrile

Tính ch t hu nh quang ấ ỳ

Do c u trúc c a các quinolone là c u trúc vòng benzen, là cấ ủ ấ ấu trúc thường thấy ở nh ng ch t có kh ữ ấ ả năng phát huỳnh quang Ch t có càng nhi u nấ ề ối đôi liên

h p thì kh ợ ả năng phát huỳnh quang càng cao Hơn nữa các quinolone có c u trúc ấ

cứng là điều ki n c n thiệ ầ ết để cho m t h p ch t có kh ộ ợ ấ ả năng phát huỳnh quang Các phân t có các nhóm nguyên t có kh ử ử ả năng chuyển động quay quanh trục liên kết, khi ạởtr ng thái kích thích, s ẽ nhanh chóng tiêu hao năng lượng mà phân

t ử đã hấp thu do đó sẽ không phát huỳnh quang Còn đố ới v i các phân t có c u ử ấtrúc c ng và phứ ẳng như quinolone, năng lượng phân t h p thu khi b kích thích ử ấ ị

gi i t a b ng vi c phát ra b c x v ả ỏ ằ ệ ứ ạ để ề trạng thái cơ bản Chính vì v y mà các ậquinolone là nh ng ch t có kh ữ ấ ả năng phát huỳnh quang Đây là cơ sở để kh o sát ảcác quinolone với đầu dò hu nh quang ỳ

1.1.2 Kháng sinh nhóm penicillin [13]

Penicillin là kháng sinh th h u tiên có tính kháng khu n r t mế ệ đầ ẩ ấ ạnh đối

v i nhi u vi khuớ ề ẩn Penicllin được chi t ra t d ch nuôi c y nế ừ ị ấ ấm Penicillium chrysogenum Penicillin lần đầu tiên phát hi n có tác d ng ch ng vi khu n gram ệ ụ ố ẩdương Staphylococcus diplococcus nhưng hầu như không có tác dụng ch ng vi ố

6

khu n gram âm và n m men Penicillin có công th c c u t o g m mẩ ấ ứ ấ ạ ồ ột vòng βlactam, m t vòng thiazolindine và m t m ch bên R (Hình 1.4) Hai lo i penicillin ộ ộ ạ ạđược t ng hổ ợp đầu tiên là benzylpenicillin (penicillin G) và phenoxymethylpenicillin (penicillin V) và m t s ộ ố loại bán t ng hổ ợp như amoxicillin, ampicillin, oxacillin, cloxacillin

-H nh 1.4 Công thức cấ ạu t o chung c a Penicillinủ1.1.3 Kháng sinh nhóm sulfonamide [14]

1.1.3.1. Giới thiệu chung v sulfonamide ề

Các sulfonamide kháng khu n là d n ch t c a p- aminobenzensulfonamid, ẩ ẫ ấ ủ

có công th c cứ ấ ạu t o chung như hình 1.5

Trong đó thường gặp R2 là H, và cũng chỉ khi R2 là H thì Sulfonamide m i có ớ

ho t tính kháng khuạ ẩn, khi R2 ≠H, thì chất đó là tiền thu c R1 có th là mố ể ạch thẳng, d vòng Tuy nhiên, n u R1 là d vòng thì hi u l c kháng khu n mị ế ị ệ ự ẩ ạnh hơn, thông thường là các d vòng 2 3 d tị – ị ố Khi R1 và R2 đều là g c hidro thì thu ốđược Sulfonamide là có c u tấ ạo đơn giản nh t ấ

H nh 1.5 Công thức cấ ạu t o chung c a sulfonmideủ

7

Bng 1.1 Công thức cấu tạo c a mủ ột số sulfonamide phổ ế bi n

Sulfonamide có công th c c u t o g n gi ng v i PABA (para amino ứ ấ ạ ầ ố ớbenzoic acid) là ngu n nguyên li u c n thi t cho vi khu n t ng hồ ệ ầ ế ẩ ổ ợp acid folic đểphát triển Do đó sulfonamide tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình t ng h p ổ ợacid folic c a vi khu n Ngoài ra, sulfonamide còn c ch dihydrofolat ủ ẩ ứ ếsynthetase, m t enzym tham gia t ng h p acid folic V m t lý thuy t, ph kháng ộ ổ ợ ề ặ ế ổkhu n c a sulfonamide r t r ng, g m h u h t các c u khu n, tr c khu n gram (+) ẩ ủ ấ ộ ồ ầ ế ầ ẩ ự ẩ

và (-) Hi n nay, t l kháng thu c và kháng chéo giệ ỷ ệ ố ữa các sulfonamide đang rất cao nên đã hạn ch vi c s d ng sulfonamide r t nhi u M t khác do có nhi u ế ệ ử ụ ấ ề ặ ềđộc tính và đã có kháng sinh thay thế, sulfonamide ngày càng ít dùng m t mình, ộthường dùng d ng ph i h p sulfamethoxazol vạ ố ợ ới trimethoprim để tăng khả năng điều tr c a thu c ị ủ ố

1.1.3.2. Tính chất hóa lý c a sulfonamide ủ

a Tính chất vật lý

Sulfonamide d ng tinh th màu tr ng ho c màu vàng nh t tr prontosil, ở ạ ể ắ ặ ạ ừkhông mùi, thường ít tan trong nước, benzen, chloroform Sulfonamide tan

8

trong dung dịch acid vô cơ loãng hoặc hydroxyd ki m (tr sulfaguanidin) Các ề ừsulfonamide có các thông s ố xác định về: độ chảy, ph IR, ph UV (do có chổ ổ ứa nhân thơm)

b Tính ch t hóa h c ấ ọ

H u hầ ết các sulfonamide đều có tính chất lưỡng tính:

- Tính acid (trừ sulfaguanidin): do có H N-ở amid linh động

- Tính bazơ: có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung d ch acid ị

Các sulfonamide có th tham gia ph n ng diazo hóa do có nhóm amin ể ả ứthơm tự do (có th tham gia ph n ể ả ứng ghép đôi với 2-naphtol/kiềm để cho s n ả

phẩm màu đỏ da cam)

Tác d ng v i mụ ớ ột số muối kim lo i (CuSOạ 4, CoCl2) t o thành ph c màu tạ ứ ủa

v i Cuớ 2+, Co2+ đặc trưng cho từng sulfonamide, nên thường được dùng để phân

bi t các sulfonamide vệ ới nhau Đốt khô trong ng nghi m, sulfonamide b phân ố ệ ị

h y, d l củ ễ ại ặn có màu điển hình cho t ng sulfamide, ví dừ ụn, đốt sulfanilamid

giải phóng ammoniac và cho cặn màu xanh tím

1.1.4 Kháng sinh nhóm macrolin [15]

Các macroline là nh ng kháng sinh có c u trúc heterosia mà ph n genin là ữ ấ ầ

m t vòng lacton có ch a nhi u nguyên t ộ ứ ề ử (thường t 12-17 ho c nhiừ ặ ều hơn) và được chia thành 2 nhóm chính: nhóm kháng khu n và nhóm kháng n m hay còn ẩ ấ

g i là các polyen Nhóm macroline kháng khu n bao g m các macroline có cọ ẩ ồ ấu trúc vòng lacton (ch a t 12-17 c u t - còn g i là vòng esther) có ch a 1 hay ứ ừ ấ ử ọ ứnhiều đường (deoxy sugar) (thường là cladinose và desosamin) (Hình 1.6)

Hình 1.6 : Công thức cấ ạu t o chung c a nhóm macroline ủ

9

Phổ ế bi n nh t trong nhóm này là các kháng sinh ch a vòng lacton 14 c u t ấ ứ ấ ửbao gồm erythromycin, trocandomycin và roxithromycin Đây là những kháng sinh macroline th h I Các kháng sinh thu c nhóm macroline th h II bao gế ệ ộ ế ệ ồm

m t s kháng sinh bán t ng h p t ộ ố ổ ợ ừ erythromycin như azithromycin (chứa vòng lacton 15 c u t -ấ ử được công b ố năm 1980 với biệt dược c a hãng Pfizer 1991 là ủZithromax) và Clarithromycin (ch a vòng lacton 14 c u t ) Nhóm này có ph ứ ấ ử ổkháng khu n rẩ ộng hơn Erythromycin Được x p vào danh sách nhóm kháng sinh ếMacroline thế ệ h II còn bao g m các ch t có c u trúc vòng lacton 16 c u t ồ ấ ấ ấ ửnhư leucomycin, josamycin, spiramycin, tylosin, tylocicin Trong đó tylosin chủ ế y u s d ng trong thú y ử ụ

1.2 Nghiên cứu về ồn dư kháng sinh trong thự t c ph m ẩ

1.2.1 Tình hình s dử ụng kháng sinh trong chăn nuôi hiện nay

Trong những năm gần đây, kháng sinh đượ ử ục s d ng nhiều trong lĩnh vực y

t và nông nghiế ệp đặc biệt là chăn nuôi Trên cả thế ớ gi i, ngành nông nghiệp đã

s d ng 63.200 t n kháng sinh các loử ụ ấ ại trong năm 2010 và dự báo đến năm 2030 lượng kháng sinh s ti p tẽ ế ục tăng thêm 2/3 so với năm 2010 (khoảng 105.600

t n) và Vi t Nam là mấ ệ ột trong năm quốc gia được dự báo là lượng s d ng kháng ử ụsinh cao nh t trên th gi i T l ấ ế ớ ỉ ệ kháng sinh được s dử ụng trong chăn nuôi hiện nay là penicillin (9%), tetracycline (66%), macroline (12%), aminoglycoside (4%), fluoroquinolone (1%), trimethomprim (2%) và các kháng sinh khác (6%) [16]

Ở Việt Nam, kháng sinh được s d ng tràn lan tử ụ rong chăn nuôi Theo báo cáo c a C c Thú y thì có kho ng 4109 loủ ụ ả ại kháng sinh khác nhau đang được s ử

d ng trong nông nghi p hi n nay, bao g m 11 nhóm ch yụ ệ ệ ồ ủ ếu là β-lactam, aminoglycoside, macrolide, tetracycline, quinolone, phenicol, polymyxins, pleuromutilins, lincosamide, sulfamid và diaminopyrimidine Các nghiên c u ứ

đều ch ra rỉ ằng, các cơ sở chăn nuôi sử ụ d ng kháng sinh không h p lý, không ợđúng liều lượng dẫn đến tình tr ng tạ ồn dư kháng sinh trong thực ph m cao g p ẩ ấnhi u l n so v i tiêu chuề ầ ớ ẩn quy định Theo điều tra c a tác gi Ph m Kim ủ ả ạ Đăng

và c ng s , có 38 loộ ự ại kháng sinh được s dử ụng trên địa bàn 3 huy n c a Hệ ủ ải Phòng, trong đó colistin đượ ử ục s d ng nhi u nh t (30,4%), ti p theo là ampicillin ề ấ ế(24,4%), tylosin (15,00%), chlotetracycline (19,3%), sulfachlopyradin (17,0%)

10

trong đó đáng chú ý là kháng sinh chloramphenicol hiện đã bị ấ c m trên nhi u ề

qu c gia trên th giố ế ới trong đó có Việt Nam [17] Nghiên c u cứ ủa tác gi ả Dương Thị Toan và c ng s ộ ự năm 2014 chỉ ra r ng vi c s d ng kháng sinh cho v t nuôi ằ ệ ử ụ ậ

ở ang trtr ại chăn nuôi chưa được qu n lý ch t và không h p lý, vi c s d ng ả ặ ợ ệ ử ụkháng sinh ch yủ ếu d a vào khuy n cáo cự ế ủa các công tư sản xu t và kinh nghi m ấ ệ

của người chăn nuôi Kết qu ả điều tra ch ra r ng có 17 loỉ ằ ại kháng sinh được s ử

d ng trong các trang trụ ại chăn nuôi, phổ bi n là norfloxacin (60,0%), tylosin ế(60,0%), gentamycin (55,0%), enrofloxacin (40%) [18] K t qu ế ả điều tra “Tình hình s dử ụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong th t gà tị ại các cơ sở chăn nuôi gà công nghi p c a thành ph H ệ ủ ố ồ Chí Minh” của tác gi Võ Th Trà An cho ả ịthấy có 8 loại kháng sinh được s d ng ph biử ụ ổ ến trong chăn nuôi gà thịt công nghiệp trên địa bàn thành ph H Chí Minh: colistin (15,83%), enrofloxacin, ố ồdiaveridin (7,74%), sulfadimidin (6,72%), trimethoprim (6,38%), norfloxacin (5,79%), 13 oxytetracyclin (4,93%), gentamycin (4,51%) và acid oxolinic (4%)

Có 32,61% cơ sở ử ụ s d ng kháng sinh không hợp lý, trong đó sai về ều lượ li ng chiếm t l cao nh t (23,3%) S ỉ ệ ấ ố cơ sở không ngưng thuốc đúng qui định chi m ế44,54% Ki m tra 70 m u th t gà tể ẫ ị ại các cơ sở ử ụ s d ng không h p lý phát hi n 42 ợ ệ(60%) m u th t có tẫ ị ồn dư với các lo i kháng sinh: enrofloxacin, norfloxacin, ạtylosin, tetracyclin, sulfadimidin, sulfadiazin, sulfaquinoxalin Có m i liên quan ố

gi a viữ ệc ngưng thuốc không đúng qui định v i tình tr ng tớ ạ ồn dư kháng sinh 35,71% m u th t gà có tẫ ị ồn dư vượt quá gi i h n t 2 400 l n so v i tiêu chuớ ạ ừ – ầ ớ ẩn

c a Malaysia [19] Trong các loủ ại kháng sinh dùng cho chăn nuôi trên thị trường không ít loại không đảm bảo hàm lượng và chất lượng nên khi s d ng chúng s ử ụ ẽ

có ít hi u quệ ả Người chăn nuôi thường ph i dùng k t h p nhi u lo i kháng sinh ả ế ợ ề ạkhác nhau để phòng và ch a bữ ệnh Do đó đã gây nên hiện tượng tồn dư kháng sinh trong s n phả ẩm động vật như: th t , s a , trị ữ ứng Điều này gây nguy h i l n ạ ớcho s c kh e cứ ỏ ộng đồng

1.2.2 Các nghiên cứu về ồn dư kháng sinh trong thự t c ph m ẩ

Ở Việt Nam:

Nghiên cứu của ác giả Bùi Thị Luyến năm 2013 sử dụng phương pháp sắc t

ký lỏng khối phổ hai lần để xác định tồn dư kháng sinh nhóm quinolone trong 60 mẫu thịt lợn, thịt gà, cá thu thập tạo các chợ khác nhau ở tại Hà Nội, kết quả phân

11

tích cho thấy không phát hiện mẫu thịt gà, cá có chứa kháng sinh nhóm quinolone trong khi có có 8/20 mẫu thịt lợn (chiếm 40%) phát hiện chứa kháng sinh quinolone và 5 mẫu có hàm lượng vượt quá qui định cho phép [20]

Kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Đức Thịnh và cộng sự năm 2012

-2013 tại Thành phố Hồ Chí Minh trong thấy, trong 225 mẫu thịt gà, thịt lợn, thịt

bò trên địa bàn thành phố HCM thì có 55 mẫu có chứa tồn dư kháng sinh, chiếm

tỉ lệ 24,3 % Hàm lượng kháng sinh trong mẫu từ vài µg/kg đến hàng ngàn µg/kg Loại mẫu thịt gà có tỷ lệ nhiễm kháng sinh cao nhất là 37,5% và thịt bò là chủng loại mẫu có tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 10,3% [21]

Tác giả Chứ Văn Tuất và cộng sự năm 2016 đã triển khai nghiên cứu về tồn

dư kháng sinh của 235 mẫu thịt lợn, 66 mẫu thịt gà tại các lò mổ ở một số tỉnh phía Bắc cho thấy có 3,0%, 1,7%, 3,8% mẫu thịt lợn có chứa hàm lượng kháng sinh sulfadimidin, enrofloxacin, chloramphenicol và tỉ lệ nhiễm kháng sinh enrofloxacin, chloramphenicol ở thịt gà là 3,0% và 1,5% [22]

Nghiên cứu của tác giả Lê Văn Du và cộng sự năm 2015 cho thấy, tổng số

150 mẫu gồm 80 mẫu thịt lợn, 70 mẫu thịt gà được thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh để xác định tồn dư kháng sinh nhóm quinolone, sulfonamid trong thịt lợn và quinolone, tetracycline, chloramphenicol trong thịt gà Kết quả cho thấy, trong 80 mẫu thịt lợn sulfadimidine được phát hiện trong 14 mẫu với hàm lượng

từ 103 đến 10.330 µg/kg, norfloxacin được phát hiện trong 3 mẫu Trong 70 mẫu thịt gà, norfloxacin được tìm thấy trong 2 mẫu, enrofloxacin được tìm thấy trong

23 mẫu và florfenicol trong 19 mẫu [23]

Tác giả Nguyễn Thanh Nga trong nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh ciprofloxacin và enrofloxacin trong thực phẩm cũng lựa chọn phương pháp LC/MS/MS Cột được sử dụng là cột XDB-C18 (50mm x 4,6mm; 3,5μm;) với pha động gồm acetonitril và acid formic 0,1% Các điều kiện khối phổ được tối

ưu hóa như sau: Kỹ thuật ion phun hóa điện EIS với chế độ bắn ion dương, tốc

độ dòng: 0,5 ml/phút, nhiệt độ cột: 300C, nhiệt độ MS1 (MS1 Heater) và MS2 (MS2 Heater): 100oC, nhiệt độ dòng khí (gas temp): 350oC, tốc độ dòng khí (gas flow): 8,0l/min, thế áp vào ống mao quản (capillary): 3840V, cường độ dòng điện của buồng (chamber current): 1, μA, cường độ dòng điện tại ống mao 66quản (capillary current): 74nA, áp suất dòng khí N2 cho hệ phun sương

Tác giả Ramalta và cộng sự đã tiến hành mức độ tồn dư kháng sinh trong thịt sử dụng các phương pháp khác nhau như Elisa, sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tổng số 150 mẫu thịt được thu thập tại các cửa hàng bán lẻ để xác định 4 kháng sinh là ciprofloxacin, streptomycin, tetracycline, sulphanilamide Kết quả cho thấy, khi sử dụng phương pháp Elisa thì tỉ lệ mẫu dương tính là 56%; 34%; 18%; và 25,3% đối với ciprofloxacin, streptomycin, sulphanilamide, tetracycline trong khi đó phương pháp TLC và HPLC tương ứng lần lượt là 21,4%; 29,4%; 92,5%; 14,6% và 8,3%; 41,4%; 88,8%; 14,6% Hàm lượng kháng sinh phát hiện trong các mẫu nằm trong khoảng 14,2 – 1280,8 µg/kg khi sử dụng Elisa và 20,7 – 952,2 khi sử dụng HPLC trong đó có 40/150 mẫu (chiếm 26,7%) và 32/150 mẫu (chiếm 21,3%) có hàm lượng ciprofloxacin, streptomycin vượt quá quy định cho phép quy định của Codex [26]

Tác giả Metli và cộng sự sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần để nghiên cứu xác định tồn dư 38 loại kháng sinh thuộc 7 nhóm trong gan gà tại Thổ Nhĩ Kỳ, kết quả cho thấy, chỉ xác định được trimethoprim và sulfametoxazole trong một mẫu với hàm lượng tương ứng là 298,5µg/kg và 312,8 µg/kg và cả hai mẫu này đều vượt quá quy định cho phép ở Thổ Nhĩ Kỳ và Châu Âu [27]

13

1.3 Tác h i c a tạ ủ ồn dư kháng sinh trong thực phẩm đối v i s c khớ ứ ỏe con

người

Tồn dư kháng sinh trong thực ph m s gây ẩ ẽ ảnh hưởng tr c tiự ếp đến sức

khỏe con người nếu thường xuyên ăn các loại thực phẩm có chứa dư lượng kháng sinh M t trong nh ng nguyên nhân mang tính toàn c u là gây ra tình tr ng ộ ữ ầ ạkháng kháng sinh Tình tr ng ph bi n c a vi khu n kháng kháng sinh ạ ổ ế ủ ẩ ở Việt Nam đang ở mức báo động Ngoài nguyên nhân s d ng kháng sinh m t cách ử ụ ộ

rộng rãi trong điều tr y h c, nhóm nghiên c u GARP-ị ọ ứ Việt Nam đã nhấn m nh ạđến ý nghĩa của vi c s dệ ử ụng kháng sinh trong chăn nuôi đố ới các căn nguyên i vgây bệnh trên người [28] Tình tr ng kháng kháng sinh ạ ở Việt Nam hi n nay ệđang có xu hướng tăng từ 30-80%, trong đó sự kháng kháng sinh c a ph c u ủ ế ầStalophycocus neumoniae với chloramphenicol tăng từ 9,4% năm 2002 đến

36,5% năm 2004 Theo kết qu nghiên c u c a d ả ứ ủ ự án “Nghiên cứu cơ chế lan truy n và xây d ng mô hình giám sát vi khuề ự ẩn kháng kháng sinh lưu hành trong thực ph m ởẩ Việt Nam” thì 60% người lành mang trùng nhi m vi khu n kháng ễ ẩkháng sinh và 50% th c ph m t gia súc và th y s n nhi m vi khu n kháng ự ẩ ừ ủ ả ễ ẩkháng sinh [2] Do v y, c n thiậ ầ ết để xây dựng các phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh trong th c ph m nh m góp ph n xây d ng m t h th ng giám ự ẩ ằ ầ ự ộ ệ ốsát tồn dư kháng sinh trong thực ph m, gi m t l vi khuẩ ả ỉ ệ ẩn kháng kháng sinh lưu truy n trong thề ực phẩm

1.4 Các phương pháp xác định dư lượng kháng sinh trong th c ph m ự ẩ

Trên th gi i hi n nay có r t nhi u các nghiên cế ớ ệ ấ ề ứu xác định dư lượng của các kháng sinh nói chung và quinolon nói riêng trên các n n m u khác nhau Mề ẫ ột

s ố phương pháp đang được s dử ụng như: phương pháp miễn d ch enzym ị(ELISA) [26]; phương pháp vi sinh vật (test vi sinh v t h c) [29],[30], biosensor ậ ọ[31], phương pháp lý hóa [20],[21],[22],[23],[24],[25],[26],[27] Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng và được tóm t t b ng 1.2 Có th nh n th y, ắ ở ả ể ậ ấphương pháp được s d ng ph bi n hi n nay là s c ký l ng hiử ụ ổ ế ệ ắ ỏ ệu năng cao (HPLC) do có độ chính xác cao, phát hiện được m t lư ng nh kháng sinh tộ ợ ỏ ồn dư trong th c ph m ự ẩ Các detector được s d ng nhi u nh t là detector UV [32], ử ụ ề ấdetector hu nh quang [32],[33] và detector kh i ph [20],[21],ỳ ố ổ [25] Để xác định

14

tồn dư kháng sinh cần ph i tr i qua quá trình tách chi t l y ch t c n phân tích ra ả ả ế ấ ấ ầ

kh i n n mỏ ề ẫu, sau đó được làm s ch và làm gi u s d ng b ng các k ạ ầ ử ụ ằ ỹ thuật hiện đại để phát hiện và định lượng Nhi u k thu t x lý m u có th ề ỹ ậ ử ẫ ể đượ ử ụng đểc s dphân tích tồn dư kháng sinh trong các nền m u khác nhau Nguyên t c chung cẫ ắ ủa quá trình này là k t t a protein trong m u s d ng dung môi thích hế ủ ẫ ử ụ ợp để chiết được chất phân tích, sau đó được làm s ch và/ho c làm giàu mạ ặ ẫu trước khi đem

đi phân tích Dung môi được s d ng ch yếu là acetonitril [20],[21],[25],[32] ử ụ ủ[33] ho c h n h p acetonitril: acid phosphoric 0,3%, h n h p acetonitril : acid ặ ỗ ợ ỗ ợformic [34] M t s nghiên cộ ố ứu cũng sử ụ d ng h n h p acid acetic/ethanol hoỗ ợ ặc acid formic/ethyl acetate để chi t m u cho k t qu tế ẫ ế ả ốt Giai đoạn này thường được k t h p v i k thu t rung siêu âm, lế ợ ớ ỹ ậ ắc Vortex cho đồng nh t và ly tâấ m đểphân tách l p tớ ốt hơn Giai đoạn chiết đượ ặ ạc l p l i nhi u lề ần để chiết đượ ối đa c tchất phân tích D ch chiị ết được lo i ch t béo b ng k thu t chi t l ng l ng (n-ạ ấ ằ ỹ ậ ế ỏ – ỏhexan) ho c làm s ch m u s d ng k ặ ạ ẫ ử ụ ỹ thuật chi t pha rế ắn SPE, sau đó cô cạn làm giàu m u, hòa cẫ ặn và đem đi phân tích [20] Bên c nh nhạ ững phương pháp kểtrên thì m t s nghiên c u gộ ố ứ ần đây đã ứng d ng k thu t QuERChERS [7],[21], ụ ỹ ậđây là kỹ thuật được đa số các nghiên c u s dứ ử ụng để làm s ch m u, s d ng ít ạ ẫ ử ụdung môi, th i gian phân tích ng n và cho hi u qu cao Vì n n m u th t chờ ắ ệ ả ề ẫ ị ứa nhi u protein, lipid do v y k ề ậ ỹ thuật QuEChERS được s dử ụng để loạ ỏi b các tạp chất như protein, lipid trong mẫu, tăng cường kh ả năng phân tích mẫu S c ký ắ

l ng là k ỏ ỹ thuật được s d ng ph biử ụ ổ ến để phân tích tồn dư kháng sinh K ỹ thuật này đều có nhiều điểm thu n lậ ợi để xây d ng mự ột phương pháp phân tích đa dư lượng kháng sinh trong th c ph m nói chung Ngay t ự ẩ ừ khi được bắt đầ ứu ng

d ng trong phân tích, s c ký lụ ắ ỏng đã được nghiên c u phát triứ ển để xác định rất nhi u h p ch t V i kh ề ợ ấ ớ ả năng kết h p v i nhi u lo i detector khác nhau nên ợ ớ ề ạ

ph m vi ng d ng c a s c ký l ng r t rạ ứ ụ ủ ắ ỏ ấ ộng rãi và phong phú Để xác định tồn dư kháng sinh, trong thời gian đầu, detector UV và detector hu nh quang và khỳ ối

ph ổ đượ ử ục s d ng ph bi n trong các nghiên cổ ế ứu, đặc biệt là detector khối phổ do

có độ nh y cao, m c µg/kg [20],[21],[25] Th i gian gạ ở ứ ờ ần đây, kỹ thu t kh i ậ ố

ph phát tri n m nh m ổ ể ạ ẽ và đạt được nhiều bước tiến vượ ật b c S c ký l ng ghép ắ ỏ

n i v i detector kh i ph ố ớ ố ổ có độ nhạy và tính đặc hi u rệ ất cao, đáp ứng được yêu

c u ngày càng kh t khe cầ ắ ủa thế ới về phân tích dư lượ gi ng

Độ nhạy và độ đặc

hi u kém, ch xác ệ ỉđịnh đượ ừc t ng ch t ấ

Thời gian phân tích dài, xác định được các ch t trong cùng ấ1-2 nhóm

Trang thi t b ế ị đắt tiền, cán b phân ộtích có chuyên môn cao

[20][21][25]

1.5 Một số quy định về ới hạn tồn dư kháng sinh trong thự gi c ph m ẩ

Ủy ban Châu Âu (EU) đã ban hàng quyết định số 37/2010 ngày 22 tháng 12 năm 2009 quy định giới hạn tối đa cho phép thuốc thú y trong sản phẩm động vật [3], theo đó các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật phải được kiểm soát dư lượng tuân thủ quy trình của Chỉ thị số 2001/82/EC Ở Việt Nam, Bộ Y tế đã ban hành Thông tư số 24/2013/TT-BYT Ban hành Quy định mức giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y trong thực phẩm [4] của 59 loại thuốc thú y, Bộ Nông nghiệp

và phát triển nông thôn ban hành thông tư 15/2009/TT BNN và thông tư 03/2012/TT-BNN quy định danh mục thuốc, hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng [35],[36], cụ thể như sau:

-16

B ng 1.3  Giới hạ ối đa cho phép củn t a kháng sinh theo EU và Vi t Nam ệ

Hoạt chất Đối tượng Giới hạn tối đa cho phép

(MRL) (µg/kg) Việt Nam EU Amoxicillin,

17

Hoạt chất Đối tượng Giới hạn tối đa cho phép

(MRL) (µg/kg) Việt Nam EU Sulfamethoxazole

- 1 Quy định c a B ủ ộ Y tế theo thông tư 24/2013/TT-BYT ngày 14/8/2013

- 2 Quy định c a B Nông nghi p và phát triủ ộ ệ ển nông thôn theo thông tư 15/2009/TT-BNN ngày 17/3/2009 và 03/2012/TT-BNN ngày 16/1/2012

18

CHƯƠNG 2 Ậ V T LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được th c hi n t i Khoa Hoá Th c phự ệ ạ ự ẩm – Viện Dinh dưỡng trong khoảng th i gian t tháng 6 năm 2017 đờ ừ ến tháng 6 năm 2018

- C t s c ký HC-C18 (100mm x 4,6mm x 5µm) và ti n c ộ ắ ề ột tương ứng của

19

hãng Agilent, M ỹ

- Máy ly tâm

- Máy l c xoáy Vortex ắ

- C t SPE Oasis HLB (500mg, 6mL) c a hãng Waters, M ộ ủ ỹ

- Đầ ọu l c mẫu 0,45µm, đường kính 13mm của hãng Satorious, Đức

- Màng lọc dung môi pha động 45µm, đường kính 47mm c a hãng Satorius, ủĐức

- ng ly tâm dung tích 50mL, 15 mL c a hãng Corning, M Ố ủ ỹ

- D ng c ụ ụ thủy tinh thông thường c a phòng thí nghi m ủ ệ

2.3.2 Thuốc thử, hóa chất

Tất cả các hóa ch t thuấ ốc thử phả ại đ t tiêu chu n dùng cho phân tích ẩ

- Các chu n kháng sinh cẩ ủa hãng Sigma, Mỹ

- Acetonitrile, methanol, acid formic loại dùng cho HPLC c a hãng ủMerck, Đức

- Nước tinh khiết dùng cho HPLC và nước c t 2 l n l c qua màng lấ ầ ọ ọc 0,45µm

2.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Đề tài sẽ thực hiện 2 nội dung sau:

2.4.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích

2.4.1.1. Kho sát các điều kiện trên LC-MS/MS

a. Khảo sát và l a ch n các thông s c a detector MS ự ọ ố ủ

 Các điều ki n c n kh o sát gệ ầ ả ồm:

- Chế độ hóa hơi: APCI hay ESI và lựa chọ n ion (+) hay ion (- )

- Chế độ theo dõi ion: MRM, SIM, TIC

- Các ion m (procusor ion) và ion con (product ion) ẹ

- Các thông s v ố ề năng lượng b n phá theo t ng ch ắ ừ ất

- Nhiệ ột đ ngu n ion hóa và th ion hóa ồ ế

- Nhiệ ột đ và tốc độ c a khí mang ủ

- Thế phân m nh cho t ng c p ion ả ừ ặ

- M ột số thông s khác: khí loố ại tạp, well time

 Cách ti n hành: S d ng t ng dung d ch chu n có nế ử ụ ừ ị ẩ ồng độ 100 µg/kg, ti n ếhành bơm vào hệ ố th ng kh i ph ch n l a các thông s tố ổ để ọ ự ố ối ưu nhất cho t ng ừ

20

chất phân tích

b Khảo sát và l a ch n c t tách ự ọ ộ

Tiến hành kh o sát trên 02 c t s c ký là c t HC-C18 (150mm x 4,6mm; 5 ả ộ ắ ộµm) và c t XDB C18 (50mm x 2,1mm; 1,7 µm) ộ

Điều kiện như sau:

- Thể tích tiêm mẫu 10µl, nhiệ ột đ buồng cột 400C

- Pha động: s d ng gradient gi a dung môi hử ụ ữ ữu cơ và dung dịch acid hữu

cơ

+ Dung môi hữu cơ: thử nghi m Acetonitril chệ ứa 0,1% acid formic

+ Dung d ch phân c c: th nghiị ự ử ệm nước ch a 0,1% acid formic ứ

Chương trình gradient cho từng cột như sau:

B ng 2.2  Chương trnh gradient pha động s d ng c t XDB C18 ử ụ ộ

Thời gian

(phút)

Tốc độ dòng (ml/phút)

Nước ch a 0,1% ứacid formic (%)

Acetonitril chứa 0,1% acid formic

Nước ch a 0,1% ứacid formic (%)

Acetonitril chứa 0,1% acid formic

Tiến hành khảo sát hai pha động có thành phần như sau:

- Pha động 1: gồm nước ch a 0,1% acid formic và acetonitrile ch a 0,1% ứ ứacid formic

- Pha động 2: gồm đệm amonium acetate 5mM và acetontrile ch a 0,1% ứacid formic

 Cách ti n hành: S d ng h n h p dung d ch chu n có nế ử ụ ỗ ợ ị ẩ ồng độ ừ t ng chất

là 50 µg/L, và tiến hành bơm lặ ạp l i 3 l n vào h ầ ệ thống LC/MS/MS để xác định

tín hi u pic s c ký và kh ệ ắ ả năng tách của từng chất phân tích

2.4.1.2. Nghiên cứu và lựa chọn quy trnh xử lý mẫu

Quy trình x lý m u tham khử ẫ ảo theo Yamaguchi (2015) và được tóm tắt như sau [7] :

22

Cân chính xác (đến 0,1mg) kho ng 2g m u vào ng Fancol 50 mL ả ẫ ố

 Thêm 10 mL dung dịch acetonitrile 80% trong nước



Lắc đều trong 1 phút và ly tâm với tốc độ 1500g trong 5 phút

 Chuy n toàn b l p trên vào ng Fancol 15 mL có ch a 0,3g C18 ể ộ ớ ố ứ



Lắc trong 1 phút và ly tâm với tốc độ 1500g trong 5 phút

 Hút 1 mL d ch trong và pha loãng vị ới 1 mL nước cất



L c qua màng l c 0,22µm ọ ọ

 Bơm vào cộ ủt c a h th ng LC/MS/MS ệ ốLàm s ch m u: ạ ẫ

S d ng các n n mử ụ ề ẫu nước c t, thu c th và thêm chu n nấ ố ử ẩ ở ồng độ xác định và các điều ki n phân tích b ng LC-ệ ằ MS/MS đã lựa chọn đượ ởc trên, ti n ếhành th nghiử ệm điều ki n làm giàu, làm s ch m u b ng cách khệ ạ ẫ ằ ảo sát hai điều

ki n: s d ng c t SPE Oasis HLB và làm s ch b ng b t C18 ệ ử ụ ộ ạ ằ ộ

+ Test 1 (làm s ch b ng HLB): ạ ằ Hút 2 mL nước c t vào ng falcon 50 ấ ố

ml Thêm 100 µL h n h p dung d ch chu n 10 µg/Lỗ ợ ị ẩ , để yên trong t i 30 phút, ốsau đó thêm 8 mL ACN Lắc trong 30 giây, siêu âm nhiở ệt độ phòng trong 10 phút Làm sạch bằng cột SPE Oasis HLB (500mg, 6ml)

+ Hoạt hóa cột bằng 10 mL methanol, 10 mL nước cất

+ N p m u vào c t v i tạ ẫ ộ ớ ốc độ 1-2 mL/phút

+ Loại tạp bằng 10 mL MeOH 5% trong nước

+ Rửa giải chất phân tích b ng 2 x 5 mL acetonitrile ằ

Thổi khí N2 đến khoảng 8 mL, thêm nước c t chấ ứa 0,1% acid formic đến

v ch 10 mL Lạ ắc đều, pha loãng d ch chiị ết trong nước cất chứa 0,1% acid formic, bơm vào hệ ố th ng LC/MS/MS

Nồng độ ừ t ng chất chuẩn trong test 1 là: 0,1 x 10/10/2 = 50 (ng/mL)

23

+ Test 2 (làm s ch b ng b t C18): ạ ằ ộ Hút 2 mL nước c t vào ng falcon 50 ấ ố

ml Thêm 100 µL hỗn hợp dung d ch chuị ẩn 10 ppm, để yên trong t i 30 phút, sau ố

đó thêm 8 mL ACN Lắc trong 30 giây, thêm 0,3 g b t C18, l c ti p 30 gi y, ly ộ ắ ế ấtâm tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút D ch chi t pha loãng 2 lị ế ần trong nước

cất chứa 0,1% acid formic rồi bơm vào hệ thống LC/MS/MS

Nồng độ ừ t ng chất chuẩn trong test 2 là: 0,1 x 10/10/2 = 50 (ng/mL)

2.4.1.3. Xác nhận các giá trị sử dụng của phương pháp.

Các thông s c n thố ầ ẩm định theo yêu c u c a AOAC và ISO 17025 [27] gầ ủ ồm có:

a. Độ đặ c hiệ u/đ chọn lọ ộ c

Trên h ệ thống LC-MS/MS, v i m i ch t phân tích l a chớ ỗ ấ ự ọn được ít nh t 01 ấion m và 02 ion con, mẹ ột ion con đ định lượể ng, một ion con để đị nh tính

Cách xác định: ti n hành phân tích m u tr ng, m u dung d ch chu n và mế ẫ ắ ẫ ị ẩ ẫu

trắng thêm chuẩn theo các điều ki n LC-ệ MS/MS đã lựa chọn được K t qu phế ả ải đạt như sau:

- Trên sắc đồ ẫ m u tr ng không xu t hi n các pic có cùng thắ ấ ệ ời gian lưu với pic c a các ch t phân tích trên sủ ấ ắc đồ m u dung d ch chu n và m u tr ng thêm ẫ ị ẩ ẫ ắchuẩn

- Trên sắc đồ m u tr ng thêm chu n có các pic có thẫ ắ ẩ ời gian lưu tương tựnhư trên sắc đ c a dung d ch chu n ồ ủ ị ẩ

b. Khoảng tuyến tính động học và đường chu n ẩ

Khoảng tuy n tính cế ủa phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có

s ph ự ụ thuộc tuy n tính giế ữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Có nhi u cách xây d ng kho ng tuyề ự ả ến tính như sử ụ d ng dung d ch chu n trên nị ẩ ền dung môi, s d ng m u tr ng có thêm chu n, hay s d ng m u th c có thêm ử ụ ẫ ắ ẩ ử ụ ẫ ựchuẩn Đường chu n xây d ng trên m u tr ng ho c m u thẩ ự ẫ ắ ặ ẫ ực có độ tin c y cao ậhơn khi xây dựng trên n n dung môi và lo i b ề ạ ỏ đượ ảnh hưởc ng c a n n m u do ủ ề ẫ

v y trong nghiên c u này tôi ti n hành xây dậ ứ ế ựng đường chu n trên n n m u ẩ ề ẫtrắng

Cách xác định:

S d ng n n m u th t lử ụ ề ẫ ị ợn đã được xác định không ch a chứ ất phân tích đểlàm thí nghiệm (m u tr ng) ẫ ắ

24

Tiến hành n p h n h p dung d ch chu n vào 10 m u trạ ỗ ợ ị ẩ ẫ ắng đã xác định không có chất phân tích để được nồng độ ừ 1 đế t n 500 (µg/kg) (Bảng 2.4) Bơm

lần lượt m u nẫ ồng độ 3 l n vào h ầ ệ thống LC/MS/MS để xác định được tín hiệu

đo (diện tích ho c chi u cao c a ch t phân tích) V ặ ề ủ ấ ẽ đường cong ph thu c gi a ụ ộ ữtín hiệu đo và nồng độ đồ thị, tuy n tính trong kho ng nế ả ồng độ này đảm b o có ả

h s Rệ ố 2 ≥ 0,995 và độ chệch ở ồng độ n nh nh t không quá 20%, các nỏ ấ ồng độcòn lại có đ ệch không quá 15% ộch

B ng 2.4  Thể tích dung dịch chuẩn thêm vào m u tr ng ẫ ắ

TT Tên

m u ẫ

Lượng

cân (g)

c Gi i hớ ạn phát hi n (LOD) và gi i hệ ớ ạn định lượng (LOQ)

LOD là nồng độ nh ỏ nhất trong m u phân tích có ẫ thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

LOQ là nồng độ ố t i thi u trong m u phân tích mà có th ể ẫ ể định lượng được

bằng phương pháp khảo sát

Cách xác định LOQ như sau: Điểm th p nh t c a kho ng tuy n tính s là ấ ấ ủ ả ế ẽ

gi i hớ ạn định lượng của phương pháp, giá tr ị này đảm b o có giá tr S/N >10 (S ả ị

là tín hiệu đo của ch t phân tích, N là tín hiấ ệu đo của nhiễu đường n n) Giá tr ề ị

Cách xác định: n hành l p l i thí nghi m 10 l n trên cùng m t m u tr ng tiế ặ ạ ệ ầ ộ ẫ ắ

có n p chu n 3 nạ ẩ ở ồng độ khác nhau (50; 100; 150 µg/kg) Tính độ ệ l ch chu n ẩ

SD và độ ệ l ch chuẩn tương đối RSD hay h s bi n thiên CV theo các công th c ệ ố ế ứsau:

Trong đó: SD là độ ệch chuẩ l n; n: s l n ti n hành thí nghi m ố ầ ế ệ xi: giá trị tính được củ ầa l n th nghiử ệm thứ i

x: giá tr trung bình c a các l n th nghi m ị ủ ầ ử ệ

26

Ctt: nồng độ ch t phân tích trong m u tr ng thêm chu n ấ ẫ ắ ẩ

f Độ không đảm bảo đo

Độ không đảm bảo đo à thông số gắn với kết quả của phép đo, đặc trưng lcho sự phân tán của các giá trị có thể quy cho đại lượng đo một cách hợp lý Độ không đảm bảo đo của phương pháp trên nền mẫu phân tích được xác định theo công thức:

U (%) = t, k x RSD (%) Trong đó: t, k là giá tr t tra t b ng v i m c tin c y 95%, k là b c t do ị ừ ả ớ ứ ậ ậ ự

và k = n-1

n là s l n th l p lố ầ ử ặ ại đối với m u th c ẫ ự

RSD là h s bi n thiên cệ ố ế ủa kết quả đo lặ ạp l i (%)

2.4.2 Ứng dụng quy trình để xác định dư lượng kháng sinh trong một

- Địa điêm lấy m u: t i ch ẫ ạ ợ Mai Động, quận Hai Bà Trưng, Hà ộN i

- X lý m u: m u sau khi thu th ử ẫ ẫ ập được đồng nhất bằng máy xay m u ẫ

- Phân tích các m u trên h ẫ ệ thống LC/MS/MS với các điều kiện xác định Tính toán kết quả phân tích đưa ra đánh giá sơ bộ ề phương pháp phân tích v 2.5 X ử lý và đánh giá kết qu ả

2.5.1 Xử lý kết quả

- Sử dụng phần mềm Multiquan 3.02.2 đi kèm theo thiết bị LC/MS/MS để thu được các sắc ký đồ, tính toán di n tích, chi u cao pic, thệ ề ời gian lưu, nồng độkháng sinh của chất phân tích

- Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để lập đường hồi quy tuyến tính, xác định độ thu hồi, độ lặp lại của phương pháp

27

2.5.2 Đánh giá kết quả

- Kết quả độ lặp lại được đánh giá theo AOAC 2016 như sau:

B ng 2.5  Độ ặ ại tối đa chấ l p l p nh n t i các nậ ạ ồng độ khác nhau [29]

- Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) theo AOAC như sau:

B ng 2.6  Độ ặ ại tối đa chấ l p l p nh n t i các nậ ạ ồng độ khác nhau [29]

TT Hàm lượng (%) T l ỉ ệ chất Đơn vị Độ thu h i (%) ồ