Luận văn nghiên cứu đánh giá dư lượng chất kích thích tạo nạc trong thịt heo và dư lượng kháng sinh trong thịt gà thu thập trên địa bàn tp hồchí minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN LÊ HUỲNH LONG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ DƯ LƯỢNG CHẤT KÍCH THÍCH TẠO NẠC TRONG THỊT HEO VÀ DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỊT GÀ THU THẬP TRÊN ĐỊA BÀN TP HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm TP Hồ Chí Minh - Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ SÀI GỊN LÊ HUỲNH LONG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ DƯ LƯỢNG CHẤT KÍCH THÍCH TẠO NẠC TRONG THỊT HEO VÀ DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỊT GÀ THU THẬP TRÊN ĐỊA BÀN TP HỒ CHÍ MINH Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 Người hướng dẫn khoa học: Tiến sĩ Trần Quang Hiếu TP Hồ Chí Minh - Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Được cho phép Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Sài Gịn thực hồn thành Luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu đánh giá dư lượng chất kích thích tạo nạc thịt heo dư lượng kháng sinh thịt gà thu thập địa bàn TP Hồ Chí Minh” tơi chân thành cám ơn Ban Giám hiệu tạo điều kiện giúp cho tơi học hỏi thời gian qua Để hồn thành luận văn, nỗ lực học hỏi thân cịn có hướng dẫn tận tình thầy cô Đặc biệt hướng dẫn tận tình Tiến sĩ Trần Quang Hiếu anh, chị, em đồng nghiệp Tôi chân thành cảm ơn Tiến sĩ Trần Quang Hiếu, người hướng dẫn cho suốt thời gian thực tập Mặc dù thầy bận nhiều công tác khác dẫn tơi, định hướng cho tơi, để tơi hồn thành tốt luận văn Một lần chân thành cảm ơn thầy chúc thầy dồi sức khoẻ Xin cảm ơn tất đồng nghiệp, bạn bè, thư viện giúp đỡ suốt thời gian qua Tất người nhiệt tình giúp đỡ, đặc biệt anh chị đồng nghiệp Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, thực phẩm Chi cục Thú Y thành phố …, số lượng công việc đơn vị nhiều dành thời gian để hướng dẫn nhiệt tình cho tơi Tuy nhiên kiến thức chun mơn cịn hạn chế thân thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung báo cáo không tránh khỏi thiếu xót, tơi mong nhận góp ý, hướng dẫn thêm quý thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp để báo cáo hoàn thiện Một lần xin gửi đến thầy cô, bạn bè đồng nghiệp lời cảm ơn chân thành tốt đẹp nhất! GVHD: Ts Trần Quang Hiếu MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU 10 1.1 Chất tăng trọng: beta-agonist 10 1.1.1 Cơ chế tác động nhóm beta agonist 12 1.1.2 Ảnh hưởng nhóm beta – agonist người 16 1.1.3 Vai trò chăn nuôi heo ngành thực phẩm 16 1.1.4 Tình hình chăn ni heo Việt Nam 17 1.1.5 Một số thách thức chăn nuôi heo nước ta 19 1.1.6 Thực trạng sử dụng β-agonist thịt heo Việt Nam giới… …………………………………………………………………….20 1.2 Tetracyclin 24 1.2.1 Tetracyclin Tác dụng Tetracyclin 24 1.2.2 Tình hình sử dụng kháng sinh nhóm Tetracyclines chăn ni 26 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 34 2.1.1 Địa điểm lấy mẫu: 34 2.1.2 Số lượng mẫu: 34 2.1.3 Địa điểm phân tích: 34 2.2 Nội dung nghiên cứu 34 2.2 Phương pháp lấy mẫu: Mẫu lấy theo phương pháp ngẫu nhiên 35 2.3 Phương pháp xác định dư lượng nhóm Beta-agonist (Clenbuterol, Salbutamol, Ractopamine) Test Kit 35 2.3.1 Phương pháp kiểm tra miễn dịch theo dòng chảy 35 2.3.2 Kit thử nhanh clenbuterol, ractopamine salbutamol 39 2.3.3 Xác định độ đặc hiệu/độ chọn lọc khả phát CCβ theo hướng truyền thống 39 2.3.4 Xác định độ đặc hiệu/độ chọn lọc khả phát CCβ theo hướng thay mẫu đại diện 41 Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Ts Trần Quang Hiếu 2.3.5 Khả phát (CCβ) 41 2.3.6 Độ xác tương đối (Relative Accuracy), độ nhạy (Sensitivity), độ đặc hiệu (Specificity), độ lệch dương (Positive deviation), độ lệch âm (Negative deviation) hệ số kappa (kappa value, the agreement between methods) 42 2.3.7 Độ ổn định 44 2.3.8 Phương pháp sử dụng kit nhanh: 44 2.3.9 Độ thu hồi phương pháp chiết kit 50 2.4 Xác định hàm lượng Beta-Agonits phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC-MS/MS) 51 2.5 Phương pháp xác định dư lượng nhóm Tetracyclines (Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin) phương pháp HPLC-UV 56 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 3.1 Kêt phân tích nhanh nhóm clenbuterol ractopamine salbutamol có thịt 64 3.2 Kết phân tích hàm lượng clenbuterol, ractopamine salbutamol thử phương pháp LC – MS/MS 65 3.3 So sánh khả phát clenbuterol, ractopamine salbutamol kit thử phương pháp UPLC – MS/MS 66 3.3 Kết phân tích Sal, Clen Ract mẫu thực tế phương pháp UPLC – MS/MS 70 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn thịt 71 3.3.2 Kết phân tích hàm lượng clenbuterol, ractopamine salbutamol thử phương pháp UPLC – MS/MS 73 3.4 Kết phân tích dư lượng kháng sinh thịt gà, heo mẫu thực tế phương pháp HPLC – UV 75 CHƯƠNG KẾT LUẬN 80 4.1 Kiến nghị: 81 4.2 Với khó khăn tồn như: 82 4.3 Dự báo tình hình: 83 4.4 Đặt nhiệm vụ, mục tiêu chung: 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Ts Trần Quang Hiếu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Giải thích Sắc ký lỏng siêu cao UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò tứ cực LC-MS/MS (Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry) Sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry Hiệp hội cộng đồng phân tích AOAC (Association of Official Analytical Chemists) Phương pháp kiểm tra theo dòng chảy LFA (Lateral Flow Assay) Kiểm tra sắc ký miễn dịch dòng chảy LFIA (Lateral Flow Immunochromatographic Assay) Protein đáp lại yếu tố gắn kết CREB (cAMP Response Element-binding Protein) Cơ quan quản lý thuốc dược phẩm Hoa Kỳ FDA EU (Food and Drug Administration) European Union (Liên Minh Châu Âu) Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ USDA (United States Department of Agriculture) Clen Lê Huỳnh Long Clenbuterol Trang GVHD: Ts Trần Quang Hiếu Tên viết tắt Giải thích Rac Ractopamine Sal Salbutamol ATTP An toàn thực phẩm VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm ARN Axit Ribonucleic Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Ts Trần Quang Hiếu DANH MỤC BẢNG BIỂU NỘI DUNG STT Bảng 1.1 Giới hạn phát phương pháp phân tích định lượng Bảng 1.2: Số liệu việc sử dụng chăn nuôi công bố số nhóm kháng sinh cho số nước châu Âu năm 2008 Bảng 1.3 Kết tỷ lệ dương tính kháng sinh nhóm Tetracyclines 14 tỉnh thành Hà Nội năm 2006 Bảng 2.1 Bảng so sánh kết định tính Bảng 2.2 Xếp hạng mức độ đồng ý theo giá trị kappa Leeds Koch (1977) TRANG 23 26 30 41 43 Bảng 2.3 Thông tin kit thử nhanh 50 Bảng 3.1 Kết thông số thể khả kit thử 64 10 11 12 Bảng 3.2 Kết mẫu thịt heo từ chợ đầu mối, siêu thị chợ truyền thống Bảng 3.3 Độ thu hồi trung bình độ lệch chuẩn kit thử Bảng 3.4 Kết phân tích mẫu thử kit thử nhanh UPLC – MS/MS Bảng 3.5 Chuẩn bị đường chuẩn Sal, Clen Rac Bảng 3.6 Kết phân tích 80 mẫu thịt phương pháp UPLC-MS/MS Lê Huỳnh Long Trang 64 66 69 70 72 GVHD: Ts Trần Quang Hiếu NỘI DUNG STT 13 14 15 16 Bảng 3.7 So sánh kết kiểm nghiệm beta-agnoist qua năm quan quản lý với kết nghiên cứu Bảng 3.8 Tổng hợp kết phân tích họ tetraciline mẫu thu thập hệ thống Siêu thị, Chợ đầu mối Chợ truyền thống Bảng 3.9 Kết khảo sát tetracyline 80 mẫu thịt gà Bảng 3.10 So sánh kết kiểm nghiệm họ tetracyline qua năm quan quản lý với kết nghiên cứu Lê Huỳnh Long Trang TRANG 73 75 76 77 GVHD: Ts Trần Quang Hiếu MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm vấn đề ngày quan tâm Đặc biệt nước phát triển, nơi chịu gánh nặng lớn bệnh truyền qua thực phẩm Trong khu vực, ATTP loại hình, nguồn gốc nhiễm bẩn thực phẩm diễn từ trang trại tới bàn ăn ngày quan tâm Thực phẩm khơng an tồn để lại nhiều gánh nặng lên sức khỏe người, đời sống người nông dân, tồn doanh nghiệp, hội xâm nhập thị trường giới, danh tiếng quốc gia sức hút du lịch Tại Việt Nam trình thị hóa nhanh chóng nước có mức thu nhập trung bình Điều dẫn tới thay đổi phần ăn, chế độ dinh dưỡng, đặc biệt tăng nhu cầu thực phẩm có nguồn gốc động vật Hệ thống thực phẩm Việt Nam hòa nhập với hệ thống khu vực giới ATTP Việt Nam mối quan tâm lớn người tiêu dùng nhà hoạch định sách, chủ đề thường xuyên xuất kênh truyền thông đại chúng, hay thảo luận sách Đây kết việc gần thường xuyên xảy vụ liên quan đến thực phẩm chất lượng thực phẩm khơng an tồn Cụ thể bao gồm: tồn dư kháng sinh chất tăng trọng cấm chăn nuôi thường tìm thấy thịt bị nghi ngờ có tồn thịt Tetracycline nhóm kháng sinh sử dụng rộng rãi có hiệu điều trị bệnh nhiễm khuẩn Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh nói chung Tetracycline nói riêng chăn ni khơng liều lượng liệu trình, đặc biệt sử dụng liều thấp thường xuyên gây nên tồn dư kháng sinh sản phẩm chăn nuôi cụ thể thịt gà, gián tiếp gây tác hại kháng kháng sinh cho người tiêu dùng Người tiêu dùng sử dụng sản phẩm tồn dư kháng sinh nhóm Tetracycline gây số tác hại rối loạn tiêu hóa, thai nhi phát triển Trong đó, nhóm β-agonist (thụ thể beta), chứng minh chất chuyển đổi hiệu quả, làm giảm tỷ lệ mỡ, tăng tỷ lệ nạc gia súc, cụ thể thịt heo Thực trạng thịt heo an toàn trở thành vấn đề đáng lo ngại việc sử dụng chất tăng trọng để “thổi” thịt siêu nạc, tình trạng sử dụng thức ăn tăng trọng Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Ts Trần Quang Hiếu [69] E Commission, "Commission Decision EC 2002/657 of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results," Off J Eur Communities L, vol 221, 2002 [70] M L McHugh, "Interrater reliability: the kappa statistic," Biochemia medica, vol 22, no 3, pp 276-282, 2012 [71] G W Latimer, "Appendix F: guidelines for standard method performance requirements," Official methods of analysis of AOAC International, 2012 [72] Ngân hàng giới, 2017 Quản lý nguy an toàn thực phẩm Việt Nam: Những thách thức hội áo cáo kỹ thuật, Ngân hàng giới [73] "What are beta-agonists?" Thoracic.org American Thoracic Society Retrieved 17 October 2014 [74] Yoo, B.; et al "Beta1-adrenergic receptors stimulate cardiac contractility and CaMKII activation in vivo and enhance cardiac dysfunction following myocardial infarction" [75] Johnson, M "Molecular mechanisms of beta(2)-adrenergic receptor function, response, and regulation" [76] "Tetracycline" The American Society of Health-System Pharmacists Archived from the original on 28 December 2016 Retrieved December 2016 [77] Fischer, Janos; Ganellin, C Robin (2006) Analogue-based Drug Discovery John Wiley & Sons p 489 ISBN 9783527607495 Archived from the original on 2016-12-20 [78] "WHO Model List of Essential Medicines (19th List)" (PDF) World Health Organization April 2015 Archived (PDF) from the original on 13 December 2016 Retrieved December 2016 Lê Huỳnh Long Trang 97 GVHD: Ts Trần Quang Hiếu [79] "Tetracycline HCL" International Drug Price Indicator Guide Archived from the original on 10 May 2017 Retrieved December 2016 [80] Meat and meat products - Method for determination of tetracyclines residues by high performance liquid chromatography [81] Kỹ thuật chăn nuôi heo - trung tâm khuyến nông Sở Nông nghiệp phát triển Nông thông thành phố HCM [82] Báo cáo Chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh [83] Ảnh hưởng việc bổ sung Ractopamine Salbutamol thức ăn chăn nuôi đến sinh trưởng, hiệu sử dụng thức ăn mức tồn dư chúng mội số mô lợn giai đoạn vỗ béo Lê Huỳnh Long Trang 98 GVHD: Trần Quang Hiếu PHỤ LỤC Phương pháp HPLC-UV a Nguyên tắc Các kháng sinh nói mẫu thủy sản chiết tách dung dịch đệm (pH 4) Dịch chiết làm phương pháp chiết pha rắn (SPE) cột tách chiết pha đảo Sep-Pak Cartrige C18 Hàm lượng TC, OTC, CTC có dịch chiết xác định hệ thống HPLC với detector UV bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn b Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác, sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC nước có độ tinh khiết tương đương Metanol, loại dùng cho HPLC Axetonitril, loại dùng cho HPLC Dung dịch axit oxalic-metanol Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm phân tử nước metanol bình định mức 1000 ml Định mức tới vạch Dung dịch axit oxalic-metanol không bền, pha trước sử dụng Dung dịch đệm McIlvaine, pH 4,0 ± 0,05, chuẩn bị sau: Hoà tan 28,4 g Na2HPO4 khan nước bình định mức dung tích 1000 ml, định mức tới vạch, thu dung dịch A Hoà tan 21,0 g axit xitric ngậm phân tử nước nước bình định mức, định mức tới vạch, thu dung dịch B Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 1000 ml dung dịch B Chỉnh pH tới 4,0 ± 0,05 cách cho giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1 M dung dịch NaOH nồng độ 0,1 M (sử dụng máy đo pH) Dung dịch đệm McIlvaine bền vòng tuần nhiệt độ phòng Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Trần Quang Hiếu Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA Hoà tan 60,5 g dinatri etylendinitrilotetraaxetat (EDTA) ngậm phân tử nước vào 625 ml dung dịch đệm Mcllvaine Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA bền vòng tuần nhiệt độ phịng Pha động cho HPLC Hồ tan 1,26 g axit oxalic ngậm phân tử nước nước bình định mức 000 ml Định mức tới vạch Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril 166 ml metanol Lọc đuổi khí Dung dịch pha động khơng bền, pha trước sử dụng Các dung dịch chuẩn gốc tetracycline, 1000 mg/ml Cân 108 mg ± 0,1 mg loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi giấy chứng nhận) vào bình định mức dung tích 100 ml riêng biệt Hòa tan định mức tới vạch 100 ml metanol Bảo quản dung dịch kháng sinh chuẩn gốc nhiệt độ -20 0C Các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc bền vòng tháng Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp tetracycline, 100 mg/ml Hút xác 10 ml dung dịch kháng sinh chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml Định mức tới vạch metanol Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp tetracycline, 25 mg/ml Hút xác 2,5 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 100 mg/ml vào bình định mức 10 ml Định mức tới vạch metanol Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ 0C đến 0C Dung dịch bền vòng tuần Dung dịch chuẩn hỗn hợp tetracycline, 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 1,00 mg/ml Hút xác 20; 40; 100; 200 400 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 25 mg/ml vào bình định mức 10 ml Thêm ml dung dịch axit oxalic-metanol vào bình Định mức tới vạch nước Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Trần Quang Hiếu Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ 0C đến 0C Dung dịch bền vòng tuần c Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg Bình định mức, dung tích 10; 100 000 ml Pipet, tự động điều chỉnh từ ml đến10 ml Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 50 ml Phễu Buchner, đường kính 5,5 cm Giấy lọc Dụng cụ đo pH Máy ly tâm, tốc độ 000 r/min, sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml Máy nghiền, tốc độ 10 000 r/min Bể siêu âm Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml Cột sắc ký pha đảo C8, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt mm Cột sắc ký pha đảo C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt mm Hệ thống HPLC, trang bị detector UV d Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu thử Cân 5,00 g ± 0,05 g mẫu (m) băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh thứ Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA vào ống nghiền 30 s máy nghiền Sau đó, ly tâm ống máy ly tâm 10 tốc độ 3000 r/min Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Trần Quang Hiếu Gạn dịch ống thứ vào ống ly tâm thủy tinh (4.4) thứ Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA (3.5) vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ Trộn đều, ly tâm ống 10 tốc độ 3000 r/min lại gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ Trộn ly tâm ống 10 tốc độ 3000 r/min Tiếp tục gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ Ly tâm ống thủy tinh thứ 20 tốc độ 000 r/min Sau đó, lọc dịch qua giấy lọc phễu Buchner Rửa ống ly tâm lần, lần rửa sử dụng ml dung dịch đệm McIlvaine – EDTA Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thủy sản xác định khơng có kháng sinh thuộc nhóm tetracycline Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 100 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 25 mg/ml vào 5,00 g mẫu trắng Đồng mẫu máy nghiền Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử Làm dịch chiết Chuẩn bị cột Nối cột Sep-Pak C18 vào đầu xơ ranh thủy tinh dung tích 100 ml Thêm 20 ml metanol, 20 ml nước vào xơ ranh thủy tinh Loại bỏ dung dịch chảy qua cột Làm dịch chiết Cho dịch chiết ống ly tâm thu vào cột Sep-Pak chuẩn bị Tráng rửa bình chứa 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA Trong giai đoạn này, kháng sinh nhóm tetracycline hấp phụ lên bề mặt hạt rắn chứa cột Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Trần Quang Hiếu Chú ý không cột Sep-Pak khô hai giai đoạn chuẩn bị cột làm dịch chiết Điều chỉnh cho dịch chảy khỏi cột giọt Cho 20 ml nước vào xơ ranh thủy tinh cho chảy qua cột Loại bỏ dịch chảy khỏi cột Làm khơ cột dịng khơng khí Giải hấp kháng sinh nhóm tetracycline cách cho 6,0 ml dung dịch axit oxalic-metanol chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/min Thu dịch khỏi cột vào bình định mức 10 ml Định mức tới vạch (thể tích V) nước Tiến hành phân tích dịch thu HPLC Tiến hành phân tích HPLC Điều kiện phân tích Cột sắc ký: cột pha đảo C8 ; Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng; Pha động: hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitril; Tốc độ dòng: 1,2 ml/min; Bước sóng cài đặt cho detector UV: 350 nm; Thể tích tiêm: 60 ml Ổn định cột sắc ký 30 pha động Tiêm dung dịch kháng sinh chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần, tính chiều cao pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ chiều cao pic thu nồng độ (mg/ml) loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính (y = ax + b) Đường chuẩn kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn 0,995 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC theo qui định Mỗi dung dịch mẫu tiêm lần Tính giá trị trung bình Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Trần Quang Hiếu CHÚ THÍCH: Sau phân tích xong, làm hệ thống HPLC (bao gồm cột sắc ký) hỗn hợp: nước - metanol - axetonitril theo tỷ lệ 7:1:2 (thể tích) 30 phút Đối với mẫu chứa 0,5 mg/g kháng sinh nhóm tetracycline, phải kiểm tra xác nhận kết cách tiêm lại dịch chiết mẫu dung dịch kháng sinh chuẩn cột C18 chạy chế độ cột C8 so sánh thời gian lưu pic mẫu pic chuẩn Tính kết Hàm lượng kháng sinh nhóm tetracycline có mẫu thử, C, biểu thị microgam kilogam (mg/kg) tính theo cơng thức sau: Y hiệu số chiều cao pic dịch chiết chiều cao pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài; a, b hệ số đường chuẩn y = ax + b; V Là thể tích dịch chiết thu sau làm tính mililit (ml) m Là khối lượng mẫu sử dụng, tính gam (g) Độ lặp lại độ thu hồi Độ lặp lại Độ lệch chuẩn lặp lại, CVS, tính theo chiều cao pic sắc ký lần tiêm dung dịch kháng sinh chuẩn phải nhỏ 0,5 % Độ thu hồi Độ thu hồi, R, xác định cho lần chạy mẫu phải lớn 80 % Phương pháp xác định dư lượng tetracyclin sắc ký lỏng hiệu cao TCVN 8748:2011 chuyển đổi từ tiêu chuẩn ngành 10 TCN 698:2006, 10 TCN 700:2006, 10 TCN 701:2006 10 TCN 702:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a khoản Điều Nghị định số 127/2007/NĐ-CPngày 01/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Trần Quang Hiếu TCVN 8748:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định dư lượng tetracyclin (oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin) thịt sản phẩm thịt Giới hạn định lượng phương pháp 50 μg/kg a Nguyên tắc Mẫu đồng hóa tetracyclin (oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin) chiết từ mẫu dung dịch đệm Mc Ilvaine/EDTA Loại bỏ protein mẫu dung dịch axit trichloroaxetic lọc qua giấy lọc Làm mẫu cột chiết pha rắn C18 Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), cột sắc ký C18, detector quang phổ khả kiến (UV-Vis) để xác định dư lượng tetracyclin có mẫu b Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) nước cất nước có chất lượng tương đương, trừ có qui định khác Axetonitril Metanol Dung dịch axit tricloaxetic, g/ml Hoà tan 50 g axit tricloaxetic 50 ml nước Dung dịch axit oxalic nước, 0,01 M Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm hai phân tử nước lít nước, lọc qua lọc dung môi với giấy lọc cỡ lỗ 0,45 μm bơm chân không (4.9) Dung dịch axit oxalic metanol, 0,01 M Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm hai phân tử nước lít metanol Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Trần Quang Hiếu Dung dịch axit xitric, 0,1 M Hoà tan 21 g axit xitric ngậm phân tử nước lít nước Dung dịch dinatri phosphat, 0,2 M Hoà tan 28,4 g dinatri phosphat lít nước Dung dịch đệm Mc Ilvaine Trộn lít dung dịch axit xitric (3.6) với 625 ml dung dịch dinatri phosphat chỉnh pH = 4,0  0,05 Dung dịch đệm Mc Ilvaine/EDTA Hoà tan 60,5 g dinatri etylen diamin tetraaxetat (EDTA) ngậm hai phân tử nước 1,625 lít dung dịch đệm Mc Ilvaine (3.8) Chuẩn oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin Dung dịch chuẩn gốc, 000 μg/ml Cân 50 mg chất chuẩn vào bình định mức dung tích 50 ml riêng biệt (lượng cân điều chỉnh theo độ tinh khiết chất chuẩn) Hoà tan thêm metanol đến vạch để thu dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 000 μg/ml Dung dịch chuẩn gốc bảo quản -20 oC tháng Hỗn hợp dung dịch chuẩn trung gian, 50 μg/ml Lấy 2,5 ml loại dung dịch chuẩn gốc 000 μg/ml (3.10.1) vào bình định mức 50 ml, hồ tan thêm metanol đến vạch để dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 50 μg/ml Bảo quản sử dụng oC tuần Dung dịch chuẩn làm việc, 0,125; 0,25; 0,75 1,0 μg/ml Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc cách pha loãng dung dịch chuẩn trung gian 50 μg/ml (3.10.2) với dung dịch axit oxalic 0,01 M metanol (3.5) nước (tỷ lệ 30:70) để thu dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ tương ứng 0,125; 0,25; 0,75 1,0 μg/ml Các dung dịch chuẩn làm việc chuẩn bị hàng ngày Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Trần Quang Hiếu a Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 4.1 Hệ thống máy sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC), trang bị: - Bơm kênh dung môi gradient; - Detector quang phổ khả kiến (UV-Vis); - Máy tính phần mềm phân tích; - Cột phân tích RP C18, kích thước 25 cm x 4,6 mm, μm Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg Máy xay thịt Máy ly tâm tốc độ cao, tối đa 20 000 r/min Máy ly tâm lạnh, tối đa 000 r/min, oC Máy lắc vortex, tối đa 700 r/min Máy lắc quay tròn Máy khuấy từ Bơm chân khơng, 0,4 bar, 12 W Pipet tự động, dung tích từ 100 μl đến 000 μl Pipet thuỷ tinh, dung tích 25 ml Ống ly tâm polypropylen, dung tích 50 ml, có nắp Ống thuỷ tinh, dung tích 30 ml có nắp 10 ml Cốc thuỷ tinh, dung tích 50 ml Cột chiết pha rắn, ví dụ Bond-Elut C18, cc, 500 mg tương đương Bộ chiết pha rắn, ví dụ Manifold (supelco), adaptor, kim tương đương Lọ đựng mẫu, dung tích ml, xylan hố Đầu lọc, cỡ lỗ 0,45 µm x 22 mm Lê Huỳnh Long Trang GVHD: Trần Quang Hiếu d Lấy mẫu Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Điều quan trọng mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện không bị hư hỏng không bị biến đổi chất lượng trình vận chuyển bảo quản f Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu thử Xay nhỏ đồng hóa mẫu thịt máy xay thịt để đồng mẫu Cân g mẫu thịt cho vào ống ly tâm Cho vào 25 ml dung dịch đệm Mc Ilvaine/EDTA Lắc 30 s máy lắc vortex sau lắc khoảng 15 máy lắc quay trịn với tốc độ 100 r/min Ly tâm với tốc độ 000 r/min 10 nhiệt độ oC máy ly tâm lạnh Chuyển toàn dung dịch vào ống thuỷ tinh 30 ml Đặt ống vào cốc thuỷ tinh đưa lên máy khuấy từ Cho từ từ 2,5 ml dung dịch axit tricloaxetic g/ml vào khuấy Sau khuấy nhanh Nhấc ống khỏi máy quấy từ bỏ khuấy từ khỏi ống Ly tâm với tốc độ 000 r/min, dùng máy ly tâm Nối cột chiết pha rắn với chiết pha rắn bơm chân khơng Hoạt hố cột chiết pha rắn ml metanol ml nước ml dung dịch đệm Mc Ilvaine Chuyển hết dung dịch chiết thu sau ly tâm lên cột chiết pha rắn dùng bơm hút chân không điều chỉnh tốc độ chảy không giọt/s Tráng cốc ml dung dịch đệm McIlvaine/EDTA không để cột bị khô bước Rửa cột ml nước Làm khô cột bơm chân không Rửa giải cột ml dung dịch axit oxalic 0,01 M metanol ml nước.Hứng phần dịch rửa giải vào ống polypropylen Ly tâm với tốc độ 20 000 r/min nhiệt độ oC máy ly tâm tốc độ cao Lọc mẫu qua đầu lọc vào lọ đựng mẫu ml trước bơm mẫu lên hệ thống máy HPLC Lê Huỳnh Long Trang 10 GVHD: Trần Quang Hiếu 6.2 Chuẩn bị mẫu trắng mẫu trắng thêm chất chuẩn Chuẩn bị mẫu trắng đồng thời giống bước chuẩn bị mẫu thử Mẫu trắng mẫu khơng nhiễm tetracyclin Mẫu dùng để kiểm sốt ô nhiễm chéo trình chuẩn bị mẫu phân tích sắc ký Mẫu trắng thêm chất chuẩn mẫu trắng thêm chất chuẩn tetracyclin (oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin) Mẫu dùng để xác định độ thu hồi Sau xay nhỏ đồng hóa mẫu, thêm chất chuẩn tetracyclin vào mẫu Lượng kháng sinh cho vào mẫu phải nằm khoảng tuyến tính VÍ DỤ: Chuẩn bị mẫu trắng thêm chất chuẩn có nồng độ oxytetracyclin 100 μg/kg sau: dùng pipet hút 10 μl dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 50 μg/ml (3.10.2) cho vào g mẫu trắng Sau chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn đồng thời bước giống chuẩn bị mẫu thử CHÚ THÍCH: Nếu có nội chuẩn cho chất nội chuẩn vào tất mẫu, không cần phải chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn Phân tích sắc ký Điều kiện chạy máy: - Bước sóng: 360 nm; - Tốc độ dịng: 0,6 ml/min; - Pha động sau: Pha động Thời gian, Axetonitril (3.1), % Dung dịch axit oxalic 0,01 M (3.4), % 13 87 20 36 64 CHÚ THÍCH: Thời gian ổn định Có thể đặt bước sóng 355 nm Lê Huỳnh Long Trang 11 GVHD: Trần Quang Hiếu Thời gian lưu oxytetracyclin 10,8 min; tetracyclin 11,6 min; clotetracyclin 13,8 min; doxycylin 14,4 Dựng đường chuẩn Trước bơm dung dịch chuẩn cần ổn định cột sắc ký 30 pha động, sau bơm xác 100 μl dung dịch chuẩn làm việc (3.10.3) theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao vào máy sắc ký HPLC (4.1) điều kiện phân tích để xây dựng đường chuẩn xác định giới hạn phát máy Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ chiều cao pic thu nồng độ (μg/ml) loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính: y = ax + b Trong đó: y diện tích pic (chiều cao pic chất chuẩn); x nồng độ tương ứng chất chuẩn, tính microgam mililit (μg/ml); a b hệ số phương trình tuyến tính Tính biểu thị kết Tính độ thu hồi Nồng độ cuối kháng sinh nhóm tetracyclin mẫu trắng thêm chuẩn, Cf, tính từphương trình đường chuẩn (6.4) theo cơng thức: Trong đó: Yt diện tích pic mẫu trắng thêm chuẩn; a hệ số góc đường chuẩn; b số đường chuẩn Độ thu hồi, R, xác định theo công thức: Lê Huỳnh Long Trang 12 GVHD: Trần Quang Hiếu Trong đó: Cf nồng độ cuối kháng sinh nhóm tetracyclin mẫu trắng thêm chuẩn, xác định trên; Ct nồng độ thực (nồng độ chuẩn cho vào mẫu trắng); f hệ số pha loãng mẫu trắng thêm chuẩn Kết xác định độ thu hồi chấp nhận độ thu hồi đạt giới hạn sau: Rm - 3.SD ≤ R ≤ Rm + 3.SD Trong đó: Rm độ thu hồi trung bình; SD độ lệch chuẩn độ thu hồi trung bình Tính kết Dư lượng kháng sinh nhóm tetracyclin (oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin) mẫu thử, X, tính microgam kilogam (μg/kg), tính theo cơng thức: Trong đó: Cf nồng độ cuối kháng sinh nhóm tetracyclin mẫu trắng thêm chuẩn; R độ thu hồi, xác định từ mẫu trắng thêm chuẩn theo; F hệ số pha loãng mẫu Biểu thị kết Kết biểu thị đến số thập phân Lê Huỳnh Long Trang 13