Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa chất lượng miền nam bằng chỉ thị ssr

Ý nghĩa khoa học Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa chất lượng tạo cơ sở lý luận cho việc chọn lọc các nguồn gen lúa chất lượng ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và đ

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Lúa gạo là cây lương thực lâu đời nhất được trồng ở nhiều nơi trên thế giới Diện tích gieo trồng của lúa gạo đứng thứ hai sau lúa mì, tổng sản lượng lúa đứng thứ ba sau lúa mì và ngô Lúa gạo là nguồn lượng thực quan trọng cho khoảng 2/3 dân số trên thế giới, vì thế lúa trở thành loại lương thực được con người tiêu thụ và ưa chuộng nhiều nhất Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên thế giới và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diện tích hơn hơn 1 triệu ha, trong đó có tới 13 nước ở Châu Á Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mĩ La tinh

Ở Việt Nam, lúa là một loại cây trồng quan trọng nhất, vừa là nguồn lương thực chủ yếu vừa là nông sản có kim ngạch xuất khẩu lớn nhất hiện nay Tuy nhiên, do thị hiếu tiêu dùng của con người đòi hỏi ngày càng cao về chất lượng của lúa gạo Sự phát triển các giống lúa thơm là một trong những mục tiêu quan trọng của các chương trình phát triển ngày nay Tuy nhiên, nguồn tài nguyên này đang dần dần bị thu hẹp do năng suất của các giống lúa thơm chất lượng không cao, sự quan tâm đánh giá và khai thác chưa đúng mức, diện tích bị thu hẹp để phát triển các giống lúa cải tiến ngắn ngày có năng suất cao Chính vì vậy việc thu thập và đánh giá nguồn tài nguyên lúa chất lượng nhằm bảo tồn và khai thác nguồn gen quý của các dòng lúa chất lượng để nâng cao năng suất và chất lượng đáp ứng nhu cầu sản xuất và tiêu dùng là một vấn đề cần chú trọng Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi

tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa chất lượng

miền Nam bằng chỉ thị SSR”

Khóa luận quản trị nhân lực

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá mức độ đa dạng và xác định mối quan hệ di truyền của các nguồn gen lúa chất lượng ở miền Nam phục vụ công tác chọn tạo giống lúa có năng suất, chất lượng cao cho miền Nam

3 Ý nghiã khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa chất lượng tạo cơ sở

lý luận cho việc chọn lọc các nguồn gen lúa chất lượng ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chất lượng ở mức phân tử

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chất lượng có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu phục tráng và lai tạo giống lúa chất lượng

Khóa luận quản trị nhân lực

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Nguồn gốc, phân loại và giá trị kinh tế của cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại cây lúa

Lúa có 12 cặp nhiễm sắc thể (2n = 24) là cây tự thụ phấn Người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một cây hoang dại cách đây ít nhất 130 triệu năm Hiện nay, có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa đã

được thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza

glaberrima) [15]

Lúa châu Á O sativa tổ tiên là một loại lúa hoang (O rufipogon) phân

bố quanh chân núi Hymalaya, có 2 thứ sau:

+ Oryza sativavar indica (ở phía Ấn Độ)

+ Oryza sativavar japonica (ở phía Trung Quốc)

Hiện nay, đây là 2 loài lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới Có nhiều giả thuyết khác nhau về nơi đầu tiên tiến hành gieo trồng hay thuần hóa giống lúa này

Lúa châu Phi: đã được gieo trồng trong khoảng 3500 năm trên lưu vực châu thổ sông Niger Tuy nhiên loài này không được phát triển rộng thậm chí việc gieo trồng còn giảm do các giống châu Á được đem tới trong khoảng thế

kỷ 11 [34]

Theo Cadnalle (1998) cây lúa có nguồn gốc từ Ấn Độ Còn theo Roseleviez (1931) cây lúa có nguốn gốc từ Đông Nam Á đặc biệt là từ Ấn Độ

và Đông Dương

Quan điểm được nhiều người công nhận nhất là cây lúa có nguồn gốc

từ Đông Nam Á Vì đây là vùng có diện tích trồng lúa lớn nhất thế giới, có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm phù hợp với sự sinh trưởng của cây lúa Đây cũng

là nơi trồng lúa sớm nhất

Khóa luận quản trị nhân lực

Thông qua việc trao đổi, mua bán mà cây ngày càng được phát tán rộng rãi trên khắp thế giới như Nhật Bản (năm 300 TCN), Triều Tiên (khoảng năm 850 – 500 TCN), Địa Trung Hải của châu Âu (khoảng năm 800 TCN), Nam Mỹ (đầu thế kỷ 18) [34]

Cây lúa nước được phân loại như sau:

Ngành: Hạt kín (Angiospermae)

Lớp : Một lá mầm (Monocotyledoneae)

Bộ : Lúa (Poales)

Họ : Lúa (Poaceae)

Chi : Lúa (Oryza)

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây lúa ở Việt Nam

Lúa là cây lương thực quan trọng thứ 2 trên thế giới sau cây ngô (Bùi Mạnh Cường, 2007) [1], được gieo trồng ở 112 nước, cung cấp lương thực cho hơn 65% dân số thế giới Ở Việt Nam, lúa gạo được sử dụng trong hầu hết các bữa ăn của người dân

Trong gần 30 năm trở lại đây sản xuất lúa gạo đã có bước tăng trưởng mạnh (70%) Năm 2011, Việt Nam đã suất khẩu 7,35 triệu tấn gạo mang về 3,5 tỉ USD cho nền kinh tế quốc dân, đứng thứ 2 trên thế giới (sau Thái Lan) [4] Cây lúa đã góp phần giải quyết tình trạng thiếu đói và hiện nay là bảo đảm an ninh lương thực trong nước

Ngoài ra, những phụ phẩm thu được từ cây lúa như rơm, rạ, trấu cám…đã được ứng dụng triệt để trong chăn nuôi, trồng trọt, làm phân bón, chất đốt giúp giảm chi phí trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường

Khóa luận quản trị nhân lực

1.2 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới

Diện tích trồng lúa trên thế giới đã tăng rõ rệt từ năm 1961 đến năm

1980 Năng suất không ngừng được cải thiện, đặt biệt từ sau cuộc cách mạng xanh của thế giới vào những năm 1965 - 1970, với sự ra đời của các giống lúa thấp cây, ngắn ngày, mà tiêu biểu là giống lúa IR5, IR8 Các giống lúa này có yêu cầu kỹ thuật cao hơn, tạo điều kiện cho các nước phát triển tăng nhanh sản lượng lúa bằng con đường tăng năng suất nhờ có điều kiện phát triển hệ

thống thủy lợi hoàn chỉnh và đầu tư phân bón, kỹ thuật cao (bảng 1.1)

Đến những năm 1990, dẫn đầu năng suất lúa trên thế giới là các nước Triều Tiên, Úc, Mỹ, Nhật Bản, Tây Ban Nha (IRRI, 1990)[16] Trong khi các nước có diện tích lúa lớn, điều kiện tự nhiên khắc nghiệt, thiếu điều kiện đầu

tư, cải tạo môi trường canh tác và không thể đầu tư vào nông nghiệp cao, nên năng suất lúa vẫn còn rất thấp và tăng chậm Điều này làm năng suất lúa bình quân trên thế giới cho đến nay vẫn còn ở khoảng 4,0 - 4,3 tấn/ha, chỉ bằng

phân nửa năng suất lúa ở các nước phát triển (bảng 1.1)

Khóa luận quản trị nhân lực

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, và sản lượng lúa trên thế giới qua các năm

Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (triệu tấn)

2,03 2,38 2,51 2,74 3,25 3,53 3,66 3,89 3,94 3,85 3,98 4,06 4,12 4,12 4,23 4,36 4,32

254,08 316,38 357,00 396,87 467,95 518,21 547,43 598,40 597,32 568,30 585,73 610,84 629,30 641,08 656,50 689,14 685,24

Nguồn: FAOSTAT, 2011

1.2.2 Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam

Trước năm 1975, diện tích trồng lúa cả nước dao động trong khoảng 4,42 - 4,92 triệu ha, năng suất có tăng nhưng chậm, chỉ khoảng 700kg/ha

trong vòng 20 năm Sản lượng lúa hai miền trên dưới 10 triệu tấn (bảng 1.2 )

Sau năm 1975, diện tích trồng lúa tăng khá nhanh và ổn định, nhưng năng suất bình quân giảm sút khá nghiêm trọng do đất đai mới khai hoang

Khóa luận quản trị nhân lực

chưa được cải tạo, thiên tai và sâu bệnh, cơ chế quản lý nông nghiệp trì trệ không phù hợp

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng lúa ở Việt Nam qua các năm

Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất(tấn/ha) Sản lượng (triệu tấn)

1,44 1,99 1,94 2,15 2,16 2,11 2,78 3,21 3,69 4,24 4,29 4,59 4,64 4,86 4,89 4,89 4,99 5,22 5,23

6,36 9,17 9,37 10,17 10,54 11,68 15,87 19,14 24,96 32,53 32,11 34,45 34,57 36,15 35,79 35,85 35,94 38,72 38,89

khoán sản phẩm trong sản xuất, cải thiện hệ thống kênh mương Sau những

nỗ lực khắc phục khó khăn nước ta đã đạt được những thành tựu to lớn Từ một nước phải nhập khẩu gạo hàng năm chúng ta đã tự túc được lương thực

và dần dần tái hòa nhập vào thị trường lương thực thế giới, chiếm lĩnh ngay vị trí quan trọng là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 3 rồi thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan

Từ năm 1997 đến nay, hằng năm nước ta xuất khẩu trung bình trên dưới 4 triệu tấn gạo, đem về một nguồn thu nhập ngoại tệ đáng kể Hiện nay,

VN đứng hàng thứ 6 về diện tích gieo trồng và đứng hàng thứ 5 về sản lượng lúa Hạt gạo VN chẳng những đảm bảo yêu cầu về an ninh lương thực trong nước mà còn góp phần quan trọng trong thị trường lúa gạo thế giới

Trong những năm qua, gạo xuất khẩu VN tăng trưởng về số lượng và chất lượng cũng như mở rộng thị trường Đến nay, ngoài các thị trường truyền thống của VN như là Iraq, Iran (Trung Đông), thị trường Châu Á (Indonesia, Philippines), VN đã mở rộng và phát triển thêm một số thị trường tiềm năng ở

các nước Châu Phi, Mỹ La tinh…(bảng 1.3)

Khóa luận quản trị nhân lực

Bảng 1.3 Thị trường xuất khẩu gạo của Việt Nam năm 2010

Thị trường Lượng(nghìn

tấn)

Trị giá (nghìn USD)

Philippines

Indonesia

Singapore

Cu Ba

Malaysia Đài Loan

Hồng Kông

Trung Quốc

Đông Timo

Nga

Nam Phi Brunei Ucraina

Australia Bỉ

Tiểu vương Quốc Ả Rập thống nhất

Ba Lan

Pháp

Hà Lan

Italia

Tây Ban Nha

1.475,82 687,21 539,29 472,27 398,01 353,14 131,12 124,46 116,72 83,69 31,79 15,14 13,15 7,46 5,91 5,90 5,02 2,58 1,42 1,39 0,84 947.378,77 346.017,26 227.791,80 209.216,94 177.688,70 142.704,50 65.176,23 54.636,94 51.526,93 36.059,49 13.365,04 7.658,56 6.149,16 4.327,17 2.716,95 2.708,17 2.058,80 1.070,36 757,90 829,32 392,84 Tổng cộng 6.886,17 3.247.860,36 Nguồn: Tổng cục thống kê, 2011

Khóa luận quản trị nhân lực

Về giá cả, gạo VN đã dần dần được nâng lên tương đương với gạo Thái Lan, vào cùng một thời điểm và cấp loại gạo Điều này cho thấy, chất lượng gạo và quan hệ thị trường của gạo VN đã có thế cạnh tranh ngang hàng với

gạo Thái Lan trên thị trường thế giới (bảng 1.4 )

Bảng 1.4 Giá gạo xuất khẩu của Việt Nam so với một số nước

(giá FOB, USD/tấn)

Loại gạo Giá gạo (đầu 6/2011 đến cuối 7/2011)

Thái 100B ( 100% gạo nguyên )

Thái 5% tấm

Thái 25% tấm

Việt 5% tấm

Việt 25% tấm

Ấn Độ 5% tấm

Pakistan 25% tấm

Pakistan 15-20% tấm

Ấn Độ 25% tấm

550

520

480

470

435

330

315

460

510

Nguồn: Thị trường lúa gạo.com và gentraco.com.vn, 2011

Tổng sản lượng và giá trị xuất khẩu gạo của Việt Nam tăng lên rõ rệt kể

từ lúc nước ta tham gia thị trường xuất khẩu gạo thế giới năm 1989 (bảng1.5)

Khóa luận quản trị nhân lực

Bảng 1.5 Số lượng và giá trị gạo xuất khẩu của Việt nam

310,29 274,52 230,50 405,53 335,06 420,86 538,84 868,42 891,34 1.005,48 1.008,94 615,82 544,11 608,12 693,54 895,18 1279,27

Nguồn: Hiệp hội lương thực VN, 2011

1.3 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền

1.3.1 Chỉ thị sinh hoá

Chỉ thị sinh hóa được phát hiện nhờ phương pháp izozym, dựa trên

cơ sở gen quy định sự tổng hợp protein Izozym là enzym cùng xúc tác cho

Khóa luận quản trị nhân lực

một phản ứng trong tế bào nhưng do các locus gel quy định Các enzym có bản chất là protein và là chất đa điện ly nên trong dung dịch nó ở trạng thái phân cực Khi chịu tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử protein khác nhau về kích thước, khối lượng phân tử, lực tĩnh điện,…sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gel sau khi điện di

Các phân tử protein enzym là do gen quy định Trong quá trình tiền hóa, dưới tác dụng của điều kiện môi trường bên ngoài và bên trong cơ thể, các gen biến đổi hình thành các alen khác nhau và nó mã hóa cho quá trình tổng hợp các phân tử protein khac nhau (Trịnh Đình Đạt và cs.,1999) [2]

Có thể chia izozym thành 2 dạng:

- Izozym đơn gen: các izozym này chịu sự kiểm soát của 1 gen

- Izozym đa gen: các izozym chịu sự kiểm soát của nhiều gen (đa gen) Việc phân tích izozym giữa chúng ta phát hiện những alen đồng trội và đây là phương pháp tương đối rẻ tiền, dễ tiến hành hơn các phương pháp sử dụng chỉ thị ADN Tuy nhiên, với số lượng ít ỏi izozym, chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể và thực tế nó cũng chỉ là sản phẩm của gen nên chưa phản ánh được chính xác bản chất di truyền của các cá thể Do vậy, việc sử dụng chỉ thị izozym còn có những hạn chế nhất định (Nguyễn Văn Đồng, 1998) [3]

1.3.2 Chỉ thị di truyền

Các chỉ thị phân tử được phát hiện thông qua phương pháp đánh dấu các đoạn Oligonucleotide và đều có một số đặc điểm chung là:

+ Không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường ;

+ Thường liên kết với các tính trạng trội hoặc siêu trội ;

+ Mang tính ổn định và được di truyền qua các thế hệ

Chỉ thị phân tử rất đa dạng, phong phú và được chia thành các nhóm như sau:

Khóa luận quản trị nhân lực

+ Chỉ thị dựa trên cơ sở phương pháp lai ADN hay chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) [8] Dựa vào các băng ADN trên gel điện di có thể phát hiện được các thể đồng (hoặc dị) hợp tử trội (lặn) + Nhóm chỉ thị phân tử dựa trên nguyên lý khuếch đại các gel mong muốn bằng kĩ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction): RAPD, SSA,

AFLP…

1.3.3 Các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR

Trong giới hạn nghiên cứu của khóa luận tốt nghiệp tôi xin được trình bày một số chỉ thị phân tử như sau:

a Chỉ thị RFLP (Restriction Fregment Length Polymorphism)

*Nguyên lí của phương pháp RFLP

Phương pháp RFLP (Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt giới hạn) do Botstein và cs, phát minh 1980 [10] Nguyên lý của phương pháp dựa trên các đặc tính cơ bản sau:

- Tính chất cắt đặc trưng của các enzym giới hạn (Restriction enzym – RE

- Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi ADN theo NTBS

Nguyên lí của phương pháp AFLP là: ADN của bộ gen sau khi sử lý bằng enzym giới hạn sẽ bị cắt thành các đoạn có kích thước khác nhau Sau khi điện di, các đoạn này sẽ phân bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này sẽ trở thành những sợi đơn và được chuyển lên màng cellulose hoặc nylon với vị trí không thay đổi Trong quá trình lai ADN tiếp theo trên mẫu dò (thực chất là một đoạn ADN) sẽ bắt cặp với những đoạn có trình tự nucleotide tương đồng với nó trên màng lai – kĩ thuật lai Southerm Khi phân tích đa hình di truyền, sự đa dạng của các cá thể được thực hiện qua

sự khác nhau của các băng trên màng lai

Khóa luận quản trị nhân lực

*Ứng dụng của RFLP: RFLP là chỉ thị được dùng phổ biến nhất và

nhiều nhất, có thể kể ra các ứng dụng đó là:

- Xác định con lai F1 trong quần thể con lai có lẫn các cá thể tự phối ;

- Đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể sinh vật;

- Xác định các dòng giống khác nhau Sollor và Backman (1983) đã phân biệt các dòng nội phối của ngô và cà chua với 20 dấu chuẩn RFLP;

- Xác định biến dị sôma Các biến dị này là do ảnh hưởng của các đột biến không xác định và có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy invitro

- Thiết lập bản đồ phân tử các gen cần quan tâm trong quá trình nghiên cứu (Bùi Mạnh Cường, 2007) [1]

b Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

*Nguyên lý của phương pháp

AFLP (Đa hình chiều dài các đoạn ADN được khuếch đại chọn lọc) là phương pháp dựa trên cơ sở của kĩ thuật PCR Nguyên lý của phương pháp này là gắn các đoạn ADN ngắn (adapter) vào 2 đầu của mạch ADN sau khi đã được cắt bằng enzym giới hạn Sau đó thiết kế mồi theo các đoạn ADN ngắn

đó có gắn thêm một hoặc một số nucleotide và tiến hành phản ứng PCR

Sản phẩm PCR được phân tích trên gel polyacrylamit, kết quả thu được thường là 50 – 100 băng ADN/1 mẫu thí nghiệm Số lượng các đoạn phân tử ADN được khuếch đại phụ thuộc vào lượng C và G có trong primer C và G càng nhiều các đoạn ADN được khuếch đại càng ít Tương tự, nếu kích thước genome càng nhỏ số đoạn phân tử được khuếch đại càng ít

*Ứng dụng: AFLP là phương pháp xác định độ đa hình cao, xây dựng

bản đồ chỉ thị ADN có hiệu quả nhất so với các chỉ thị khác tiết kiệm thời gian, dễ dàng lặp lại và có thể sử dụng để phân tích ADN từ bất kì nguồn gốc nào hay bất kì mức độ phức tạp nào

Khóa luận quản trị nhân lực

Tuy nhiên, AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành rất đắt nên phần nào hạn chế khả năng sử dụng của nó (Nguyễn Văn Đồng, 1998) [3]

c Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA)

*Nguyên lý của RAPD:

RAPD (đa hình các đoạn gen khuếch đại ngẫu nhiên) là một trong những phương pháp nghiên cứu đa hình dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR do William (1990), Wesh và cs phát minh [33]

Nguyên lý của phương pháp là: sử dụng một đoạn oligonucleotide có kích thước 8 – 12 (thông thường là 10) nucleotide không cần biết trước trình

tự làm mồi cho phản ứng PCR Các đoạn oligonucleotide đó do vậy có thể làm mồi xuôi, hoặc có thể là mồi ngược Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kì vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó Theo tính toán một mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide thì xắc suất bắt cặp của

nó là:1/410 =1/1.048.576, có nghĩa là một đoạn ADN khuôn có 1.048.576 cặp nucleotide thì có 1 trình tự bắt cặp với mồi Giả sử một hệ genome đơn bội của lúa có kích thước 550.000.000 bp thì với loại mồi ngẫu nhiên trên có thể

có 524 vị trí bắt cặp với mồi, nghĩa là có thể có 262 đoạn ADN được nhân lên Trong thực tế số lượng các đoạn được nhân bội nhỏ hơn nhiều vì nó phụ thuộc vào độ dài đoạn được nhân và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên ADN của bộ gen

Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD, nếu 2 cá thể

có bộ gen hoàn toàn giống nhau thì khi tiến hành phản ứng PCR – RAPD với bất kì mồi nào cũng cho các băng ADN giống nhau Nếu chúng ít nhiều có sự khác nhau về bộ gen thì với một số mồi sẽ cho những băng khác nhau giữa chúng Sự khác nhau này thể hiện sự đa hình di truyền của các cá thể cần nghiên cứu Do đó, nó được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm di truyền phân tử

Khóa luận quản trị nhân lực

*Ứng dụng của phương pháp: ngoài ứng dụng trong phân tích đa hình

di truyền, RAPD còn được sử dụng cho các mục đích sau:

- Phân tích con lai F1giữa bố mẹ đa hình với một mồi nào đó Khi đó con lai F1 sẽ có tất cả các băng ADN của bố và mẹ;

- Lập bản đồ gen liên kết;

- In dấu vân tay ADN;

- Phân tích di truyền của các quần thể

d Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)

Trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR là một trong những chỉ thị được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản và cho độ chính xác cao

SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1 - 6bp (Litt and Luty, 1989) [20] Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn Thông thường có các kiểu lặp lại:

- Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau

- Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một

số nucleotide khác

- Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau

Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan

đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật

Khóa luận quản trị nhân lực

Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần

kề hai đầu của vùng lặp lại Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp) Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất

ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL)

- Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR

Thuận lợi to lớn của sự phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện

số lượng lớn sự đa hình Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gel, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền

SSR được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di

truyền lúa trồng O sativa, nghiên cứu quá trình tiến hóa, làm rõ độ thuần của

vật liệu lai tạo giống , do đây là chỉ thị đồng trội cho đa hình cao và ổn định Hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập [35], phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của lúa (Giarrocco và ctv, 2007) [16] Trong những năm gần đây, nhiều công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền và ADN fingerprinting để nhận dạng giống ở lúa đã được công bố (Kalyan và ctv, 2006) [19] ; Navraj và ctv, 2009 [23]

Đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ Bộ gen lúa và như vậy trung bình cứ 157kp của phân tử ADN có một chỉ thị SSR (Akagi và ctv,

1996 [9]; Chen và ctv, 1997 [11]; Chen và ctv, 2002 [12]; Cho và ctv, 2000

Khóa luận quản trị nhân lực

[13]; Paunaud và ctv, (1996) [27] ; Temnykh, 2000 [30]; Temnykh, 2001 [29])

SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác như AFLP và RAPD Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ,

sự lai giống, dòng chảy gel trở nên dễ dàng hơn SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền Chẳng hạn, tác giả Parasnis phát hiện đoạn lặp lại GATA kích thước 5kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng marker SSR

Hạn chế của kỹ thuật SSR là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau

1.4 Tổng quan về lúa chất lượng

300 RAPD điều tra đa hình tính trạng thơm của con lai từ giống bố mẹ Khao Dawk Mali 105 (thơm) và CT 9993 (không thơm), kết quả cho thấy tính đa

Khóa luận quản trị nhân lực

hình giữa hai giống khá cao (64,1%)

Neelu Jain và cs., (2003) [26] sử dụng 15 chỉ thị SSR đã được sắp xếp trên nhiễm sắc thể số 8 Garland và cs., (2000) [15] phân tích sự đa dạng về chất lượng gạo của 12 giống lúa Basmati trên thị trường sử dụng các chỉ thị SSR cho mật độ đa hình cao giữa giống Basmati thơm và không thơm

Shu Xia Sun và cs., (2008) [28] tiến hành kiểm tra gel thơm và không thơm trên lúa ở nhiễm sắc thể số 8 bằng kỹ thuật SSR với tám cặp mồi Kết quả cho thấy rằng cặp mồi Ch - 29B và R2 không đa hình mà chỉ cặp mồi Aro7 đa hình, kích thước của cặp mồi Aro7 được xác định 302 bp Ngoài ra, cũng xác định được mồi RM23097 liên kết với locus hương thơm với khoảng

cách là 0,71 cM Các gen thơm (fgr) được thể hiện giữa marker Aro7 (0,57

cM) và RM515 (0,71 cM) Dựa trên cơ sở liên kết phân tử và BAC (bacterial artificial chromosome) trên nhiễm sắc thể số 8 được xây dựng (hình 1) [27]

Hình 1.1: Vi trí gen thơm trên nhiễm sắc thể số 8

1.4.2 Các tính trạng chất lượng

Ngoài tính trạng của mùi thơm, chất lượng của lúa phụ thuộc nhiều yếu

tố như hàm lượng amyloza, hàm lượng protein, dạng nội nhũ…

Khóa luận quản trị nhân lực

1.4.3 Nghiên cứu chọn tạo lúa chất lượng

Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế bắt đầu phát triển giống lúa thơm Basmati năng suất cao vào đầu năm 1970 Nghiên cứu được thực hiện trên những cặp

lai đầu tiên, giữa giống lúa Basmati 370 và các dòng lúa Indica cải tiến có

hàm lượng amyloza trung bình và nhiệt độ hóa hồ trung bình Những dòng thấp cây từ quần thể con lai được chọn lọc, những dòng này có mức độ hữu thụ khác nhau và dạng cây khác nhau Sau khi tiến hành lai chéo các dòng này

Khóa luận quản trị nhân lực

thu được các dạng cây và độ hữu thụ khác nhau Những cây có dạng khỏe và

độ hữu thụ cao được chọn ra để phân tích hàm lượng amyloza, nhiệt độ hóa

hồ và hương thơm Những dòng có dạng cây xấu, độ hữu thụ thấp, chất lượng hạt kém và độ thơm thấp được loại bỏ qua các thế hệ Sau một số chu kỳ lai

và chọn lọc những dòng có dạng cây khỏe, thấp cây, đáp ứng được các đặc điểm về chất lượng như Basmati được chọn lọc và tiến hành khảo nghiệm tại IRRI, Ấn Độ và Pakistan [11]

Tác giả Song và cộng sự tiến hành nghiên cứu hương thơm lá lúa giữa lúa thơm nhị bội thể và lúa không thơm tứ bội thể, kết quả cho thấy tỷ lệ giữa các cây không có hương thơm và cây có hương thơm là 35:1 ở thế hệ F1 và 3:1 ở thế hệ F2 Ren và cộng tác viên khi lai giữa dòng lúa thơm bất dục đực

tế bào chất (dòng A) với dòng phục hồi không thơm (dòng R) thì thu được hạt không thơm ở thế hệ F1, hạt ở F2 phân ly theo tỷ lệ không thơm và thơm là 15:1 Hạt thu được ở F1 và F2 đều có hương thơm khi lai giữa bố và mẹ là những giống lúa thơm

Với sự phát hiện ra cây lúa dại có hạt phấn bất thụ vào 1970, các nhà khoa học Trung Quốc, Ấn Độ và IRRI đã tạo ra một số dòng CMS - bất dục đực thuộc tế bào chất (A), dòng bảo tồn thích ứng (B), và dòng phục hồi (R) thích hợp để sản xuất ra những tổ hợp lúa lai đa dạng Những tổ hợp lai 3 dòng đầu tiên của Trung Quốc gồm có Wei-you 2, Wei-you 3, Wei-you 6, Shan-you 2, Shan-you 3, Shan-you 6, Nam-you 2, Nam-you 3, Si-you 2, Si-you 3 và Si-you 6 [22]

Sau khi tạo ra những dòng CMS với loại WA (wild - abortive), những dòng CMS khác cũng lần lượt được tạo ra như Zhenshan 97A, V20A, Erjiu

Ai 4A, Erjiu Nan 1A, V41A [22] Ở Philippines, IRRI đã dùng các CMS từ

V20A, Kaliya 1 ARC, Gambiaka, v.v để tạo ra các CMS thích hợp với khí

hậu nhiệt đới, như: IR8025A, IR68275A, IR68281A, IR68273A, IR68888A,

Khóa luận quản trị nhân lực

IR68891A, IR68893A, v.v Tương tự, dòng CMS được tạo ra từ các nguồn tế

bào chất của O perennis (IR66707A) và O rufipogon (OMS1) [31], [24]

Như vậy, nền tảng di truyền của các dòng CMS đã được đa dạng hóa và gia tăng ngày càng nhiều hơn

Các loại lúa lai được đưa ra đồng ruộng đầu tiên của Trung Quốc có năng suất cao, nhưng chất lượng kém Gần đây, các tổ hợp 3 dòng như Boyou

64, Xieyou 63 và Xieyou 64 có chất lượng cao Các tổ hợp You I63 và You I64 có hạt gạo dài và trung bình Các CMS có gạo thơm cũng được tạo ra, như Xiang A và B và các tổ hợp thơm như XiangA/PH 137, Xiang A/F50 và Xiang A/F 117 có năng suất tương tự như các tổ hợp không thơm và được đưa

ra sản xuất [32] Các tổ hợp lai của IRRI, Ấn Độ, Philippines, Bangladesh, Indonesia và Việt Nam đều có chất lượng tương đối cao

Dựa trên đặc tính quang cảm và nhiệt cảm của cây lúa để tạo lúa lai 2 dòng Những giống lúa quang cảm trở nên bất thụ đực khi được trồng trong những ngày dài có ánh sáng từ 14 giờ trở lên, được gọi dòng PGMS (Photoperiod-sensitive genic male sterility) Những giống lúa trở nên bất thụ đực khi được trồng ở những nơi có nhiệt độ hơi thấp, từ 28oC trở xuống, được gọi là dòng TGMS (Temperature-sensitive genic male sterility) Năm 1983, dòng PGMS được tìm thấy ở tỉnh Hubei, Trung Quốc và trong 1987 gen

tương hợp lúa dại giữa lúa Japonica và lúa Indica được nghiên cứu ở Nhật

Bản Trong thời gian qua, các nghiên cứu về kỹ thuật tạo lúa lai 2 dòng đã có những kết quả khả quan, chủ yếu là ở Trung Quốc

Lúa lai một dòng hay còn gọi apomixis (sinh sản vô tính) có thể giúp nông dân sử dụng chính hạt giống của mình cho vụ mùa kế tiếp, mà không bị ảnh hưởng phân ly của lúa lai 2 hoặc 3 dòng Tuy nhiên, công tác nghiên cứu lúa lai một dòng trong 3 thập niên qua chưa có triển vọng nhiều

Một phương pháp lai tạo giống khác đã được các nhà chọn giống

Khóa luận quản trị nhân lực

Myanma và Thái Lan thực hiện đó là phương pháp chọn lọc liên kết với chỉ thị phân tử (MAS) Để cải tiến giống lúa Manawthukha, một giống không thơm và hàm lượng amyloza cao được trồng với một diện tích lớn ở Myanma Các nhà nghiên cứu đã sử dụng giống Basmati 370 là dòng bố mẹ để lai nhập các gen mùi thơm vào giống Manawthukha bằng phương pháp Marker Assisted Backcrossing (MAB) Bốn dòng lai nghịch và một dòng gốc được làm vật dẫn truyền để chuyển các alen badh2 và Wx từ giống Basmati vào giống Manawthukha Hai mươi dòng lúa ở thế hệ BC4F2 đã chọn lọc mang các alen đồng hợp của giống Basmati, được trồng ở các địa điểm khác nhau ở Myanma và Thái Lan và được kiểm tra các đặc điểm nông học, chất lượng gạo Lúa thu hoạch được ở các dòng cải tiến đã có đặc tính mùi thơm và chất lượng gạo tương tự như giống Basmati nhưng có đặc điểm nông học giống như giống Manawthukha ban đầu Các dòng lúa cải tiến có đặc điểm cây cao trung bình, đẻ nhánh tốt, bông dày, chống đổ và có năng suất cao

Ở Việt Nam, chương trình lúa lai được bắt đầu thực hiện vào những

năm 1980 dưới sự chỉ đạo trực tiếp của Bộ Nông nghiệp Một số tổ hợp lai

của Trung Quốc như Sán Ưu 63 (Shanyou 63), Sán Ưu Quế (Shanyou gui 99), Nhị Ưu 63 (Jinyou 63), Nhị Ưu 838, Bác Ưu 64 (Boyou 64), Bác Ưu 693, Bồi Tạp Sơn Thanh (Peiai 64S/Sơn Thanh) và Bồi Tạp dòng 49 (Peiai 64S/Dòng 49), Trang Nông 15 đã được trồng đại trà trong nước Những tổ hợp lai tạo bản xứ như HR1, HYT56, HYT57, VN01/D212, AMS24A/Que99, MS24A/IR9761-19, v.v cũng được trồng rộng rãi ở miền Bắc

Các nhà chọn giống Việt Nam đã cố gắng lai tạo giống cao sản có hương thơm với các vật liệu bố mẹ cho gen thơm từ giống Basmati và Khao Dawk Mali, tuy nhiên chưa thành công Một số ứng dụng đột biến gel trên giống Nàng thơm Chợ Đào, Tám thơm, hoặc sử dụng chúng làm bố mẹ trong lai tạo Có thể do khả năng kết hợp kém nên việc chọn lọc con lai rất khó

Khóa luận quản trị nhân lực

khăn Đặc biệt trong trường hợp tổ hợp lai OM1262 = MTL61/Basmati 370, OM1277 = OM86-9/Basmati, OM1262 = IR66/Basmati, con lai được chọn ở thế hệ thứ 10, 11 vẫn chưa cho quần thể ổn định, mặc dù dạng hình chấp nhận (PACP) khá tốt, hàm lượng amyloza trung bình, gạo hạt thon dài [6]

Trong năm 2002, khoảng 500.000 ha lúa lai được trồng ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam Trong đó, sử dụng khoảng 80% hạt giống lai nhập nội

từ Trung Quốc, Việt Nam chỉ tự túc được 20% nhu cầu hạt giống lúa lai trong

nước Đến nay, Việt Nam cũng chưa có chính sách và quy hoạch tích cực cho

việc tự cung đối với nguồn hạt giống lai

Khóa luận quản trị nhân lực

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bảng 2.6: Danh sách các giống lúa thu thập dùng trong nghiên cứu

1 Mao chệt Quảng Ngãi C39

2 Nếp ông táo Long An C40

3 Nàng thơm đặc sản TPHCM C41

4 Nàng thơm chợ đào Long An C42

5 OM 3536 Vĩnh Long C44

6 Nàng Nhen An Giang C45

7 Thơm Lài An Giang C46

 Hoá chất tách chiết ADN

- Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như: Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN, Labscan

- Đệm tách chiết ADN của mẫu lá:

- Đệm CTAB (pha 100ml)

28 ml NaCl 5M

10 ml Tris HCl 1M(pH 8)

20 l EDTA 0,1M(pH 8) 2g CTAB

0,5g Natri bisulfit

2g PVP

- Phenol : chloroform : isoamyl acohol 70% (25:24:1)

- Ethanol 100% (hoặc Isopropanol) và Ethanol 70%

 Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR:

- Đệm PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2 , 5 mM KCl) hoặc đệm PCR 1X của Quiagen hoặc Invitrogen

- MgCl2 của Fermentas hoặc Invitrogen

- dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP (hoặc dUTP)) của Fermentas,

Invitrogen

- Mồi, ADN Ultralow marker của hãng Fermentas, Invitrogen

- Taq polymerase của Fermentas

 Hoá chất chạy điện di:

- Điện di gel agarose gồm các hoá chất: TAE, Chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide, agarose…

- Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: Dung dịch acrylamide, APS, Temed, Chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide …

Khóa luận quản trị nhân lực

 Các mồi SSR dùng trong nghiên cứu:

Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng 15 cặp mồi SSR để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau đã được McCouch và cs công bố (McCouch etal; 2002) (Bảng 2.7):

Khóa luận quản trị nhân lực

Bảng 2.7: Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu

Kích thước (bp)