Từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, với mong muốn tạo ra một bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đề tài này đƣợc đề xuất cho luận văn thạc sỹ với tiêu đề:
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐÀO THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO BỘ XÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH SỬ DỤNG HẠT NANO VÀNG ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2018 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205015851000000 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐÀO THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO BỘ XÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH SỬ DỤNG HẠT NANO VÀNG ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH Chuyên ngành : Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS TRƢƠNG QUỐC PHONG TS TRẦN QUANG HUY Hà Nội – Năm 2018 Luận văn thạc sĩ khoa học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn nghiên cứu dƣới đạo khoa học Thầy hƣớng dẫn hỗ trợ Phịng thí nghiệm kỹ thuật Protein Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội Phịng thí nghiệm Siêu cấu trúc - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng Các kết luận văn hồn tồn trung thực, số liệu tính tốn chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu trƣớc Mọi liệu, hình ảnh trích dẫn tham khảo luận văn đƣợc thu thập sử dụng nguồn liệu tin cậy đƣợc trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2018 Học viên Đào Thị Thanh Huyền Luận văn thạc sĩ khoa học LỜI CẢM ƠN Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Trƣơng Quốc Phong TS Trần Quang Huy – ngƣời thầy ln tận tình giúp đỡ, định hƣớng, góp ý cho tơi suốt q trình thực đề tài nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn Ths Nguyễn Thanh Thủy đồng nghiệp khác hết lòng chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm q báu để tơi thực hồn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên, sinh viên công tác Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Phịng thí nghiệm siêu cấu trúc - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng góp ý kiến quý báu cho tơi, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Và tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đồng hành, động viên tơi mặt để tơi hồn thành luận văn Với điều kiện, khả thời gian thực có giới hạn nên đề tài khơng thể tránh thiếu sót Tơi mong muốn nhận đƣợc góp ý thầy cô bạn để đề tài đƣợc hoàn thiện Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2018 Học viên Đào Thị Thanh Huyền Luận văn thạc sĩ khoa học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 11 1.1 TÌNH HÌNH CHUNG 11 1.1.1 Tình hình nhiễm Escherichia coli Thế giới 11 1.1.2 Tình hình nhiễm E coli Việt Nam 11 1.2 ESCHERICHIA COLI 12 1.2.1 Đặc điểm chung 12 1.2.2 Hình thể tính chất bắt màu 13 1.2.3 Đặc điểm sinh hóa học 13 1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 14 1.2.5 Phân loại E.coli .15 1.2.6 Cơ chế sinh bệnh bệnh cảnh lâm sàng 16 1.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán E coli 18 1.3.1 Phƣơng pháp định danh kinh điển 18 1.3.2 Phƣơng pháp thử nghiệm tạo váng gây ngƣng kết hồng cầu 18 1.3.3 Phƣơng pháp thử nghiệm động vật thực nghiệm 18 1.3.4 Phƣơng pháp miễn dịch gắn men .19 1.3.5 Kỹ thuật sinh học phân tử 19 1.3.6 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 20 CHƢƠNG II PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Vật liệu .25 2.1.1 Hóa chất kháng thể 25 2.1.2 Thiết bị 26 2.2.3 Nguyên lý que thử sắc kĩ miễn dịch .27 Luận văn thạc sĩ khoa học 2.2 Quy trình thực nghiệm 29 2.2.1 Xác định hình thái, kích thƣớc hạt nano vàng 29 2.2.2 Quy trình xác lập điều kiện tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 29 2.3 Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp kháng thể - nano vàng 31 2.3.1 Xác định hàm lƣợng kháng thể 31 2.3.2 Xác định độ pH thích hợp 31 2.3.3 Xác định nhiệt độ cộng hợp 32 2.3.4 Xác định thời gian cộng hợp 32 2.3.5 Xác định điều kiện cố định cộng hợp lên miếng cộng hợp 32 2.3.6 Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp 33 2.4 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 33 2.4.1 Xác định nồng độ kháng thể cố định phù hợp 33 2.4.2 Xác định nhiệt độ cố định phù hợp 34 2.4.3 Lựa chọn đệm cố định kháng thể 34 2.5 Tạo que thử đánh giá đặc tính que thử .34 2.5.1 Lựa chọn vật liệu miếng thấm mẫu 34 2.5.2 Kiểm tra hoạt động que thử 35 2.5.3 Xác định hệ đệm mẫu phù hợp .36 2.5.4 Khảo sát đặc tính que thử .36 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Điều chế hạt nano vàng 41 3.2 Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp kháng thể - nano vàng .41 3.2.1 Xác định nồng độ kháng thể phù hợp 41 3.2.2 Xác định PH phù hợp tạo cộng hợp 43 3.2.3 Xác định nhiệt độ tạo cộng hợp 44 3.2.4 Xác định thời gian tạo cộng hợp .45 3.2.5 Xác định thời gian sấy cộng hợp 45 3.3 Nghiên cứu điều kiện cố định kháng thể lên màng lai 46 3.3.1 Xác định hàm lƣợng kháng thể cố định phù hợp: 46 Luận văn thạc sĩ khoa học 3.3.2 Xác định nhiệt độ cố định phù hợp 47 3.3.3 Xác định đệm cố định kháng thể lên màng nitrocellulose .47 3.4 Tạo que thử đánh giá đặc tính que thử .48 3.4.1 Kiểm tra hoạt động que thử 48 3.4.2 Xác định hệ đệm mẫu phù hợp .49 3.4.3 Khảo sát độ lặp lại 50 3.4.4 Khảo sát ngƣỡng phát .51 3.4.5 Khảo sát phản ứng chéo 51 3.4.6 Khảo sát thời gian bảo quản que thử 52 3.4.7 Khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu .53 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 4.1 Kết luận 55 4.2 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 63 Luận văn thạc sĩ khoa học DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh E.coli quan sát kính hiển vi điện tử 13 Hình 2.2 Các thị đƣợc sử dụng kỹ thuật sắc kí miễn dịch 24 Hình 2.1 Mơ hình que thử nhanh theo nguyên lý kẹp sandwich 27 Hình 2.2 quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 29 Hình 2.2 Hình ảnh E.Coli đƣợc xác định dƣới kính hiển vi điện tử 36 Hình 2.3 Hình ảnh mẫu ngƣng kết với kháng thể kháng E.coli 37 Hình 2.4 Hình ảnh định lƣợng vi khuẩn E.coli mẫu gốc .37 Hình 3.1 Hình thái, kích thƣớc hạt nano vàng dƣới kính hiển vi điện tử truyền qua 41 Hình 3.2 Xác định hàm lƣợng kháng thể gắn với hạt nano vàng 43 Hình 3.3 Xác định ph để tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng .44 Hình 3.4 Tối ƣu nhiệt độ tạo cộng hợp (4c, 25c 37c) 44 Hình 3.5 Tối ƣu thời gian tạo cộng hợp (30 phút, 60 phút, 90 phút 120 phút) 45 Hình 3.6 Tối ƣu thời gian sấy cộng hợp 46 Hình 3.7 Xác định hàm lƣợng kháng thể cố định 46 Hình 3.8 Xác định nhiệt độ cố định kháng thể lên màng lai 47 Hình 3.9 Kết thử nghiệm loại đệm khác cố định kháng thể lên màng 48 Hình 3.10 Kiểm tra hoạt động que thử với điều kiện thiết lập ban đầu 48 Hình 3.11 Kết thử nghiệm dung dịch ly giải mẫu khác 49 Hình 3.12 Kết xét nghiệm với 10 mẫu âm tính (n=10) 50 Hình 3.13 Kết xét nghiệm với 10 mẫu dƣơng tính (n=10) 50 Hình 3.14 Ngƣỡng phát 51 Hình 3.15 Kiểm tra phản ứng chéo que thử .52 Hình 3.16 Kiểm tra thời gian bảo quản que thử 53 Luận văn thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT E coli Escherichia coli AuNPs Gold nanoparticle (hạt nano vàng) BSA Bovine Serum Albumin cDNA Complementary DNA CRS Congenital Rubella Syndrome ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FP Fusion Peptide Ig Immunoglobulin mRNA Messenger RNA NSP Non-Structural Protein PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis Pr A Protein A PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid WHO World Health Organization TCMR Tiêm chủng mở rộng EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide NHS N-hydroxysuccinimide PEG Polyethylene glycol Luận văn thạc sĩ khoa học LỜI MỞ ĐẦU Vi khuẩn tồn khắp nơi giữ vai trò quan trọng hệ sinh thái Đa số lồi vi khuẩn có lợi, nhƣng có số loại gây nên bệnh nghiêm trọng [1] Nhiễm bệnh vi khuẩn không ảnh hƣởng lớn tới sức khỏe ngƣời dân mà gây thiệt hại nặng nề đến kinh tế xã hội Vi khuẩn gây bệnh tồn lâu dài mơi trƣờng gây bệnh có tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với ngƣời hay động vật Ngƣời hay động vật bị nhiễm bệnh từ mơi trƣờng nƣớc, khơng khí, thực phẩm, dụng cụ cá nhân hay bị trùng đốt [1] Khơng khí môi trƣờng truyền bệnh 20 loại vi khuẩn gây viêm não, viêm đƣờng hô hấp, lao tiêu chảy [2] Nƣớc môi trƣờng truyền bệnh nhiều mầm bệnh liên quan đến đƣờng tiêu hóa, có phẩy khuẩn tả, loại vi khuẩn nhƣ Campylobacter spp., Escherichia coli (E.coli), Legionella pneumophila, Salmonella spp… [3] Một số mầm bệnh lây truyền qua thực phẩm nhƣ vi khuẩn Campylobacter, E coli, Salmonella hay Shigella [4] Hiện nay, an toàn thực phẩm thách thức, quan tâm hàng đầu giới, đặc biệt nƣớc phát triển có Việt Nam Trong gần 325.000 ca nhập viện năm thực phẩm Mỹ, vi khuẩn đƣợc xác định nguyên nhân chính, chiếm tới 60% [5] Theo thống kê Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, tính tháng đầu năm 2016, tiêu chảy bệnh truyền nhiễm có số ngƣời mắc cao khu vực miền Nam với tổng số 55.528 ca mắc bệnh Bên cạnh đó, gần 1.500 ca mắc bệnh khác vi khuẩn gây nên [6] Trong đƣờng tiêu hóa, E coli cộng sinh với thể góp phần tiêu hóa thức ăn, sản xuất số Vitamin giữ cân sinh thái vi khuẩn Nhƣng E coli vi khuẩn gây bệnh hội quan trọng vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đƣờng tiết niệu, viêm đƣờng mật; đứng hàng đầu nguyên gây nhiễm khuẩn huyết [11] E coli gây nhiều bệnh khác nhƣ viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thƣơng Việc chẩn đốn gặp khó khăn triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu Phần lớn vi khuẩn E.coli ảnh hƣởng đáng kể đến sức khỏe số gây tiêu chảy tùy vào địa phƣơng, độ tuổi ngƣời bệnh mà vi khuẩn