Nghiên ứu hế tạo bộ xét nghiệm sắ ký miễn dịh sử dụng hạt nano vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn esherihia oli gây bệnh

Từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, với mong muốn tạo ra một bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đề tài này đƣợc đề xuất cho luận văn thạc sỹ với tiêu đề:

-

ĐÀO THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU TẠO BỘ XÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH SỬ

DỤNG HẠT NANO VÀNG ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH

VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2018

-

ĐÀO THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU TẠO BỘ XÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH SỬ

DỤNG HẠT NANO VÀNG ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH

VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

1 PGS TS TRƯƠNG QUỐC PHONG

2 TS TRẦN QUANG HUY

Hà Nội – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ đạo khoa học của các Thầy hướng dẫn và sự hỗ trợ của Phòng thí nghiệm kỹ thuật Protein - Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa

Hà Nội và Phòng thí nghiệm Siêu cấu trúc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương - Các kết quả trong luận văn hoàn toàn trung thực, số liệu và tính toán chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu trước đây

Mọi dữ liệu, hình ảnh và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu tin cậy và được trích dẫn rõ nguồn gốc

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan trên

Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm 2018

Học viên

Đào Thị Thanh Huyền

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Trương Quốc Phong

và TS Trần Quang Huy – những người thầy đã luôn tận tình giúp đỡ, định hướng, góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn Ths Nguyễn Thanh Thủy và các đồng nghiệp khác đã hết lòng chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm quý báu để tôi thực hiện và hoàn thiện luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên, sinh viên công tác tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Phòng thí nghiệm siêu cấu trúc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã góp những ý kiến quý báu cho - tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Và tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn đồng hành, động viên tôi về mọi mặt để tôi hoàn thành luận văn

Với điều kiện, khả năng và thời gian thực hiện có giới hạn nên đề tài không thể tránh những thiếu sót Tôi mong muốn nhận được sự góp ý của các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm 2018

Học viên

Đào Thị Thanh Huyền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC HÌNH ẢNH 6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7

LỜI MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 11

1.1 TÌNH HÌNH CHUNG 11

1.1.1 Tình hình nhiễm Escherichia coli trên Thế giới. 11

1.1.2 Tình hình nhiễm E coli ở Việ t Nam 11

1.2 ESCHERICHIA COLI 12

1.2.1 Đặc điểm chung 12

1.2.2 Hình thể và tính chất bắt màu 13

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa học 13

1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 14

1.2.5 Phân loại E.coli 15

1.2.6 Cơ chế sinh bệnh và bệnh cảnh lâm sàng 16

1.3. Các phương pháp chẩn đoán E coli. 18

1.3.1 Phương pháp định danh kinh điển 18

1.3.2 Phương pháp thử nghiệm tạo váng và gây ngưng kết hồng cầu 18

1.3.3 Phương pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm 18

1.3.4 Phương pháp miễn dịch gắn men 19

1.3.5 Kỹ thuật sinh học phân tử 19

1.3.6 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 20

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu 25

2.1.1 Hóa chất và kháng thể 25

2.1.2 Thiết bị 26

2.2.3 Nguyên lý que th sử ắc kĩ miễn dịch 27

2.2 Quy trình thực nghiệm 29

2.2.1 Xác định hình thái, kích thước hạt nano vàng 29

2.2.2 Quy trình xác lập điều kiện tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng- 29

2.3 Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp kháng thể - nano vàng 31

2.3.1 Xác định hàm lượng kháng thể 31

2.3.2 Xác định độ pH thích hợp 31

2.3.3 Xác định nhiệt độ cộng hợp 32

2.3.4 Xác định thời gian cộng hợp 32

2.3.5 Xác định điều kiện cố định cộng hợp lên miếng cộng hợp 32

2.3.6 Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp 33

2.4 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 33

2.4.1 Xác định nồng độ kháng thể cố định phù hợp 33

2.4.2 Xác định nhiệt độ cố định phù hợp 34

2.4.3 Lựa chọn đệm cố định kháng thể 34

2.5 Tạo que thử và đánh giá đặc tính que thử 34

2.5.1 Lựa chọn vật liệu miếng thấm mẫu 34

2.5.2 Kiểm tra hoạ ột đ ng c a que th 35 ủ ử 2.5.3 Xác định hệ đệm mẫu phù hợp 36

2.5.4 Khảo sát đặc tính que thử 36

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Điều chế hạt nano vàng 41

3.2.Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp kháng thể - nano vàng 41

3.2.1 Xác định nồng độ kháng thể phù hợp 41

3.2.2 Xác định PH phù hợp tạo cộng hợp 43

3.2.3 Xác định nhiệt độ tạo cộng hợp 44

3.2.4 Xác định thời gian tạo cộng hợp 45

3.2.5 Xác định thời gian sấy tấm cộng hợp 45

3.3 Nghiên cứu điều kiện cố định kháng thể lên màng lai 46

3.3.1 Xác định hàm lượng kháng thể cố định phù hợp: 46

3.3.2 Xác định nhiệt độ cố định phù hợp 47

3.3.3 Xác định đệm cố định kháng thể lên màng nitrocellulose 47

3.4 Tạo que thử và đánh giá đặc tính que thử 48

3.4.1 Kiểm tra hoạt động que thử 48

3.4.2 Xác định hệ đệm mẫu phù hợp 49

3.4.3 Khảo sát độ lặp lại 50

3.4.4 Khảo sát ngưỡng phát hiện 51

3.4.5 Khảo sát phản ứng chéo 51

3.4.6 Khảo sát thời gian bảo quản que thử 52

3.4.7 Khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu 53

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

4.1 Kết luận 55

4.2 Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình ảnh coli quan sát bằng kính hiển vi điện tửE 13

Hình 2.2 Các chỉ thị được sử dụng trong kỹ thuật sắc kí miễn dịch 24

Hình 2.1 Mô hình que thử nhanh theo nguyên lý kẹp sandwich 27

Hình 2.2 quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 29

Hình 2.2 Hình ảnh Coli được xác định dưới kính hiển vi điện tửE 36

Hình 2.3 Hình ảnh mẫu ngưng kết với kháng th kháng E.coli 37 ể Hình 2.4 Hình ảnh định lượng vi khuẩn E.coli trong mẫu gốc 37

Hình 3.1 Hình thái, kích thước hạt nano vàng dưới kính hiển vi điện tử truyền qua 41

Hình 3.2 Xác định hàm lượng kháng thể gắn với hạt nano vàng 43

Hình 3.3 Xác định ph để tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 44

Hình 3.4 Tối ưu nhiệt độ tạo cộng hợp (4c, 25 c và 37 c) 44  

Hình 3.5 Tối ưu thời gian tạo cộng hợp (30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút) 45

Hình 3.6 Tối ưu thời gian sấy tấm cộng hợp 46

Hình 3.7 Xác định hàm lượng kháng thể cố định 46

Hình 3.8 Xác định nhiệt độ cố định kháng thể lên màng lai 47

Hình 3.9 Kết quả thử nghiệm các loại đệm khác nhau cố định kháng thể lên màng 48

Hình 3.10 Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu 48

Hình 3.11 Kết quả thử nghiệm các dung dịch ly giải mẫu khác nhau 49

Hình 3.12 Kết quả xét nghiệm với 10 mẫu âm tính (n=10) 50

Hình 3.13 Kết quả xét nghiệm với 10 mẫu dương tính (n=10) 50

Hình 3.14 Ngưỡng phát hiện 51

Hình 3.15 Kiểm tra phản ứng chéo của que thử 52

Hình 3.16 Kiểm tra thời gian bảo quản que thử 53

Immunoglobulin Messenger RNA Non-Structural Protein Polyacrylamide Gel Electrophoresis Protein A

Phosphate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Ribonucleic Acid

World Health Organization Tiêm chủng mở rộng

1-Ethyl-3- -dimethylaminopropyl)-carbodiimide (3N-hydroxysuccinimide

Polyethylene glycol

LỜI MỞ ĐẦU

Vi khuẩn tồn tại khắp nơi và giữ vai trò quan trọng trong mọi hệ sinh thái

Đa số các loài vi khuẩn có lợi, nhưng cũng có một số loại gây nên những bệnh nghiêm trọng [1] Nhiễm bệnh do vi khuẩn không chỉ ảnh hưởng rất lớn tới sức khỏe người dân mà còn gây thiệt hại nặng nề đến kinh tế xã hội Vi khuẩn gây bệnh

có thể tồn tại lâu dài trong môi trường và có thể gây bệnh khi có sự tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với con người hay động vật Người hay động vật có thể bị nhiễm bệnh từ môi trường nước, không khí, thực phẩm, dụng cụ cá nhân hay bị côn trùng đốt [1] Không khí là môi trường truyền bệnh của hơn 20 loại vi khuẩn gây viêm não, viêm đường hô hấp, lao hoặc tiêu chảy [2] Nước cũng là môi trường truyền bệnh của rất nhiều mầm bệnh liên quan đến đường tiêu hóa, trong đó có phẩy khuẩn

tả, các loại vi khuẩn như Campylobacter spp Escherichia coli E.coli), Legionella ., (

pneumophila, Salmonella spp… [3] Một số mầm bệnh cũng có thể lây truyền qua

thực phẩm như vi khuẩn Campylobacter, E coli, Salmonella hay Shige lla [4] Hiện nay, an toàn thực phẩm đang là một trong những thách thức, quan tâm hàng đầu trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam Trong gần 325.000 ca nhập viện hằng năm do thực phẩm ở Mỹ, vi khuẩn được xác định là nguyên nhân chính, chiếm tới 60% [5] Theo thống kê của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, chỉ tính trong 6 tháng đầu năm 2016, tiêu chảy là bệnh truyền nhiễm

có số người mắc cao nhất khu vực miền Nam với tổng số 55.528 ca mắc bệnh Bên cạnh đó, gần 1.500 ca mắc các bệnh khác do vi khuẩn gây nên [6] Trong đường tiêu hóa, E coli cộng sinh với cơ thể góp phần tiêu hóa thức ăn, sản xuất một số

Vitamin và giữ cân bằng sinh thái các vi khuẩn Nhưng E coli cũng là vi khuẩn gây bệnh cơ hội quan trọng trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết [11]

E coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết

thương Việc chẩn đoán gặp khó khăn vì các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu Phần lớn các vi khuẩn E.coli không có ảnh hưởng gì đáng kể đến sức khỏe chỉ một

số có thể gây tiêu chảy và tùy vào địa phương, độ tuổi người bệnh mà các vi khuẩn

trên đây có những ảnh hưởng khác nhau như gây tiêu chảy ra máu, trường hợp nghiêm trọng có thể gây nhiễm trùng máu, suy thận …

Vì vậy, việc phát hiện sớm, chính xác tác nhân gây bệnh là yếu tố then chốt

để đưa phương pháp điều trị kịp thời Việc phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh chủ yếu vẫn dựa theo phương pháp truyền thống, thường qua bốn bước: (i) làm giàu

sơ bộ; (ii) làm giàu có chọn lọ ; (iii) phân lậ ; (iv) xác định chủng vi khuẩn bằng c pcác kỹ thuật sinh hóa, huyết thanh hoặc sinh học phân tử [1,7] Nhược điểm chính của các kỹ thuật chẩn đoán truyền thống là phải thực hiện nhiều bước và mất thời gian Thông thường, với các phương pháp chẩn đoán truyền thống, thời gian nhận được kết quả chính xác chủng vi khuẩn nào gây bệnh nào phải mất 8 đến 48 giờ, giới hạn phát hiện tới 105- 106 cfu/mL nếu không làm giàu sơ bộ Trong khi đó, một

số kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử có độ nhạy cao, có thể cho kết quả sau vài giờ Tuy nhiên, kỹ thuật này phải được thực hiện ở phòng xét nghiệm an toàn sinh học bậc 2 trở lên, sinh phẩm cũng như thiết bị chẩn đoán đắt tiền và khó áp dụng

cho tất cả các cơ sở xét nghiệm [8] Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICA immunochromatographic assay) là một trong những kỹ thuật được phát triển để phát hiện tác nhân gây bệnh trong mẫu mà không cần đến những thiết bị chuyên dụng, cho biết kết quả nhanh chỉ sau một bước phân tích [9] ICA có thiết kế đơn giản, có

-độ nhạy và -độ đặc hiệu cao, ổn định theo thời gian trong các điều kiện môi trường khác nhau

Từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, với mong muốn tạo ra một bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đề tài này được đề xuất cho luận văn thạc sỹ với tiêu đề: “Nghiên cứu tạo bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch

sử dụng hạt nano vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh” Mục tiêu chính của đề tài nhằm tạo ra bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch trên cơ sở hạt nano vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn E.coli gây bệnh

Nội dung nghiên cứu đề tài:

- Tạo cộng hợp kháng thể kháng vi khuẩn E.coli và hạt nano vàng

- Nghiên cứu điều kiện cố định kháng thể lên màng lai

- Tạo que thử và đánh giá đặc tính que thử sắc ký miễn dịch sử dụng hạt nano vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh

CHƯƠNG I TỔNG QUAN :

1.1 Tình hình chung

1.1.1 Tình hình nhiễmEscherichia coli trên Thế giới

Tiêu chảy được coi là vấn đề y t toàn c u, là nguyên nhân hế ầ àng đầu gây

b nh t t và t vong cho tr ệ ậ ử ẻ em các nước đang phát triển Căn nguyên gây tiêu chảy thường do các tác nhân vi khu n, vi rút, ký sinh trùng ẩ Escherichia coli E coli) ( là 1 trong những căn nguyên vi khuẩn thường g p [46] ặ

Vi khu n ẩ E coli chủ ế ống trong đườ y u s ng tiêu hóa của con người, chúng là tác nhân chính gây b nh tiêu chệ ảy, thông thường d ễ điều tr và không gây nguy ị

hiểm Tuy nhiên cũng có những ch ng thu c nhóm Enterohaemorrhagic ủ ộ E coli

(EHEC) có th gây tiêu ch y kèm nh ng bi n ch ng n ng ể ả ữ ế ứ ặ như tán huyết, suy th n, ậ

ví d ụ như chủng E coli O157:H7 Vào tháng 05 - 06/2011 ở châu Âu đã xảy ra m t ộ

d ch b nh do ch ng ị ệ ủ E coli ạ l có tên O104:H4 gây ra khiến 54 ngườ ửi t vong, chủng

E coli m i này không nh ng gây tiêu ch y v i các bi n ch ng nớ ữ ả ớ ế ứ ặng hơnchủng E coli O157:H7 mà còn có khả năng kháng hầu hết các kháng sinh thường dùng, k c ể ảcarbapenem [48], khi n cho viế ệc điều tr ị vô cùng khó khăn E coli đươc xác định là căn nguyên gây tiêu chảy chính tr em, chi m 20 ở ẻ ế – 40% căn nguyên gây tiêu chảy [21, 22, 23, 24] châu Á, Ở E.coli cũng là tác nhân quan trọng gây tiêu chảy ở

người, thường gây ra sự tiêu chảy ở trẻ em mới thôi bú mẹ ở các nước phát triển và

sự tiêu chảy ở những người đi du lịch

Bên cạnh đấy, ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật ngày càng gia tăng ở các quốc gia đang phát triển và phát triển Ở Nhật Bản năm 1996 có khoảng 800 người bị nhiễm bệnh do Enterohaemorrhagic E coli 1[5 ] Các nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ vi khuẩn E coli gây bệnh ngày càng gia tăng ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là các nước

thuộc khu vực châu Á Tình trạng nhiễm E coli không chỉ xảy ra ở trong bệnh viện mà

còn trong cả cộng đồng [49]

1.1.2 Tình hình nhiễm E coli ở Việ t Nam

Ở Việt Nam, ngộ độc thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hàng

đầu, theo ước tính của Bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đã có 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Từ năm 2001đến năm 2006, cả nước ghi nhận hơn 5.600.000 trường hợp tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó 84 trường hợp tử vong Theo thống

kê của Cục Y tế dự phòng Bộ Y tế, 5 tháng đầu năm 2011 có 10 vụ ngộ độc thực - phẩm tại 7 tỉnh với 138 người mắc, 116 người phải nhập viện cấp cứu, trong đó 4/10 vụ ngộ độc do vi sinh vật và chủ yếu là E.coli Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm E coli sinh ESBL ở trong một số bệnh viện lên đến 65,8% và các vi khuẩn này kháng lại các thuốc kháng sinh thông dụng với tỷ lệ cao Tình trạng nhiễm E coli sinh ESBL ở người khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn tỉnh Thái Bình chiếm

tỷ lệ cao (82,3%) Các vi khuẩn này đã kháng lại các kháng sinh thông dụng với tỷ

lệ từ 23,7% đến 100% Các vi khuẩn không chỉ xuất hiện trong bệnh viện mà nó đã lan rộng ra cộng đồng và chủng vi khuẩn này có thể là nguồn lan truyền các gen kháng kháng sinh nguy hiểm trong cộng đồng [50] Tỷ lệ nhiễm E.coli (tại các chợ

ở 5 tỉnh phía Nam) trong thịt tươi sống là 100% đối với cả 3 nhóm thịt gà, heo và vịt Tỷ lệ nhiễm E.coli trong thủy sản tươi sống là 63,9%; cụ thể phân loại theo mức

độ nguy cơ ô nhiễm, mức 1 chiếm 17%, mức 2 chiếm 53% và mức 3 chiếm 25,5% Đối với mức 3, loại mẫu sò chiếm tỷ lệ cao nhất 58,3%, thấp nhất là hàu và nghêu (12,5%) [47]

Hi n nay thệ ức ăn đường ph phát tri n tràn lan, t phát, dố ể ự ẫn đến không đảm

b o v sinh an toàn th c ph m, luôn tiả ệ ự ẩ ềm ẩn nguy cơ gây ngộ độ c th c ph m Theo ự ẩ

m t nghiên c u mô t c t ngang c a Phộ ứ ả ắ ủ ạm Văn Doanh – Viện V sinh D ch t Tây ệ ị ễNguyên và c ng s , tộ ự ại 98 cơ sở bán thức ăn đường ph t i thành ph Pleiku Gia ố ạ ố –lai t ừ tháng 8/2013 đến tháng 6/2014 K t qu ế ả có 24,5% bàn tay người ch bi n b ế ế ịnhi m vi khu n ễ ẩ E coli, trong đó 6,1% bàn tay nhi m vi khu n ễ ẩ E coli nhóm gây

bệnh đường ru t enteropathogenic ộ E coli.

1.2 Escherichia coli

1.2.1. Đặc điểm chung

E coli là một loại trực khuẩn gram âm, thường tìm thấy bên trong phần dưới

của ruột của các động vật máu nóng Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số

chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ (pyogenic infections) Các chủng gây bệnh được phân loại bởi cơ chế sinh bệnh đặc biệt (specific pathogenic mechanisms) [15]

Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) thuộc:

Lớp: Gammaproteobacteria

Bộ: Eubacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Chi: Escherichiae

Loài: Escherichia coli

E coli còn có tên là Bacteriam coli Commue được ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em [16 ]

Hình 1.1 Hình ảnh E.coli quan sát bằng kính hiển vi điện tử

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa học

E coli lên men nhiều loại đường như glucose, lactose, manitol, trừ EIEC

lactose (-) E coli có khả năng sinh indol, không sinh H2S, không có men

urease[17]

- E coli là loại vi khuẩn hiếu khí hay hiếu kỵ khí tùy tiện Nhiệt độ thích hợp

để nuôi cấy là 37oC, pH 7,4 E coli có thể mọc ở 40oC và sống được ở nhiệt độ 5÷40oC E coli phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường, một số

chủng có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Ở những điều kiện thích hợp E coli phát triển rất nhanh, thời gian phân chia thành một thế hệ mới khoảng 20 đến 30 phút Trong môi trường lỏng (như canh thang), sau 3÷4 giờ E coli đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24giờ làm đục đều và dưới đáy ống có thể có cặn Trên môi trường đặc, sau khoảng 8÷10giờ có thể thấy khuẩn lạc dưới kính lúp, sau 24giờ đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm Hình thái khuẩn lạc điển hình là dạng S: tròn, lồi, ướt, màu xám, bề mặt sáng bóng, bờ đều; nhưng cũng

có thể gặp dạng M (nhầy) hoặc dạng R (khô, nhăn nheo)

- Trên môi trường thạch dinh dưỡng E coli mọc thành các khuẩn lạc tròn ướt (dạng S), màu trắng đục; để lâu các khuẩn lạc trở nên khô nhăn (dạng R), kích thước khóm 2÷3mm Trên thạch máu: có chủng E coli tan huyết β, có chủng E coli

tan huyết dạng α Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt như thạch Endo E coli

mọc thành các khuẩn lạc tím có ánh kim Trên môi trường Macconkey, SS các khuẩn lạc E coli màu hồng đỏ được tạo nên do vi khuẩn E.coli có khả năng lên men lactose Trên các môi trường đường: E coli lên men sinh hơi lactose, glucose, galactose, lên men không đều saccarose, không lên men dextrin và glycogen

- E coli cho phản ứng Indol dương tính, phản ứng Methyl Red (phản ứng

MR) dương tính, Voges Proskauer (phản ứn- g VP) âm tính, citrat âm tính, H2S âm tính, hoàn nguyên nitrat thành nitrit, lysine decarboxylase dương tính[18]

1 4 2 Cấu trúc kháng nguyên

Vi khuẩn đường ruột E coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp Dựa vào tính chất kháng nguyên, người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết thanh (serotype) khác nhau [19] :

- Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau Đặc tính của kháng nguyên O là:

 Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2 giờ

 Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%

 Bị hủy bởi formol 5%

 Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ

- Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ

- Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5% Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết H

- Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có hơn 100 loại khác nhau và nằm ngoài kháng nguyên O Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein Nếu kháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn thì sẽ ngăn cản phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E coli bám vào tế bào biểu mô trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay

đường tiết niệu

- Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): có dạng hình sợi, dài khoảng 4

m, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 – 7 nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng nguyên O, H, K, F Dựa vào đó, người ta có thể định danh vi khuẩn

1.2.5 Phân loại E.coli

Có nhiều cách phân loại E coli Cách phân loại theo týp huyết thanh được dùng nhiều nhất, cách phân loại này dựa trên cấu trúc kháng nguyên O, K và H có trên bề mặt tế bào vi khuẩn, trên 700 týp huyết thanh khác nhau của E coli đã được

tìm thấy Cách phân loại thứ hai dựa vào sự ly giải bởi phage đặc hiệu, có khoảng

50 týp phage

Dựa vào tính chất gây bệnh, E coli được chia làm 5 loại [20 ]:

(1) E coli sinh độc tố Shiga (STEC- Shiga toxigenic E coli hay VTEC-

Verotoxigenic E coli và EHEC Enterohemorrhagic E coli )

(2) E coli gây bệnh đường ruột (EPEC- Enteropathogenic E coli).

(3) E coli sinh độc tố đường ruột (ETEC- Enterotoxigenic E coli )

(4) E coli bám dính kết tập ở ruột (EAEC hay EaggEC- Enteroaggregative

E coli)

- Enteroinvasive

(5) E coli tấn công hay xâm lấn đường ruột (EIEC E coli).

1.2.6 Cơ chế sinh bệnh và bệnh cảnh lâm sàng

Tất cả mọi người đều có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn E coli vì các nguyên nhân sau: (i) Uống nước bị ô nhiễm: Ở một số vùng nông thôn, người dân vẫn còn thói quen sử dụng nước từ giếng khoan hoặc từ sông, suối, ao, hồ trong nấu nướng

và sinh hoạt hàng ngày… Đây chính là nguồn lây nhiễm vi khuẩn E.coli cao nhất Ngay cả ở các thành phố lớn nếu nguồn nước máy cung cấp không được xử lý tốt vẫn có thể gây bùng phát một đợt dịch bệnh do nhiễm vi khuẩn E.coli sau khi người dân sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm; (ii) Ăn uống không đảm bảo vệ sinh: Vi khuẩn

E.coli có thể còn tồn tại trong các thức ăn chưa được nấu chín, sữa không tiệt trùng,

nước trái cây hoặc rau củ quả tươi Khi chúng ta ăn những loại thực phẩm này vào thì rất dễ bị nhiễm bệnh; (iii) Lây truyền từ người sang người: Chẳng hạn như những người bị nhiễm bệnh làm việc trong nhà hàng và không rửa tay đúng cách sau khi đi vệ sinh có thể lây truyền bệnh cho khách hàng và các nhân viên khác; (iv) Tiếp xúc với động vật nhiễm mầm bệnh: Vi khuẩn E.coli có thể lây lan trong các trang trại, các vườn thú và hội chợ Đặc biệt khi chúng ta tiếp xúc với thú cưng trong nhà bị nhiễm bệnh thì có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn E.coli rất cao; (v) Sức đề kháng kém, bị giảm acit dạ dày: Trẻ em, người cao tuổi, những người phẫu thuật dạ dày hoặc đang dùng thuốc giảm axit dạ dày là những đối tượng dễ bị nhiễm khuẩn

vì lý do này

Triệu chứng nhiễm E coli thường xuất hiện 3 4 ngày sau khi tiếp xúc với vi khuẩn Tuy nhiên, các triệu chứng có thể xuất hiện sớm nhất là 24 giờ hoặc muộn nhất là 1 tuần sau đó Chúng ta không nên bỏ qua những dấu hiệu sau:

Đau bụng hoặc co cứng bụng trầm trọng Cơn đau thường kéo đến một cách đột ngột không bào trước

- Tiêu chảy nước, bắt đầu một vài giờ sau khi cơn đau bắt đầu

- Đi phân có máu đỏ tươi khoảng một ngày sau đó do vi khuẩn sinh ra các chất độc làm tổn hại niêm mạc đường ruột

- Buồn nôn và nôn ói

- Sốt nhẹ,

- Mệt mỏi , do mất nước và chất điện giải

Những triệu chứng trên thường dễ bị nhầm lẫn với các căn bệnh đường tiêu hóa khác Do vậy nếu tự chuẩn đoán bệnh tại nhà thì rất dễ bị nhầm lẫn Vi khuẩn

E.coli được biết đến là thủ phạm gây ra nhiều căn bệnh như:

- Tiêu chảy cấp: Phần lớn những người nhiễm vi khuẩn E.coli thường bị

tiêu chảy đầu tiên Người bệnh có biểu hiện đi phân nhày nước kèm theo máu Tình trạng đau bụng, nôn mửa, sốt cao và mất nước cũng khó tránh khỏi khi bị tiêu chảy do nhiễm khuẩn E.coli

- Viêm đại tràng: Loại vi khuẩn này cũng được liệt kê vào danh sách các

tác nhân gây ra bệnh viêm đại tràng Chúng có thể khiến người bệnh bị rối loạn tiêu hóa, thường là tiêu chảy, đi ngoài ra máu và mất nước nghiêm trọng nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời

Các bệnh lý khác: Vi khuẩn E.coli có khả năngdi chuyển đến hệ tiết niệu hay xâm nhập vào trong máu và được truyền đi khắp cơ thể gây ra hàng loạt các căn bệnh như: Nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm thận, viêm phổi, nhiễm trùng máu, viêm màng não…

Có thể thấy việc nhiễm vi khuẩn E.coli khá nguy hiểm và chúng ta không nên xem nhẹ công tác phòng ngừa loại vi khuẩn này lây lan thành dịch bệnh trong cộng đồng Các chuyên gia y tế cho biết cách tốt nhất để phòng bệnh giữ gìn vệ sinh môi

trường sống sạch sẽ; chỉ nên ăn các thức ăn đã được nấu chín, uống nước đun sôi để nguội và tuyệt đối không nên ăn các thức ăn không đảm bảo vệ sinh được bày bán ngoài lề đường Thêm vào đó việc trang bị một số kiến thức cơ bản để biết được vi khuẩn E.coli là gì, các nguyên nhân gây nhiễm khuẩn E.coli và triệu chứng gặp phải khi bị nhiễm bệnh cũng có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh

1.3 Các phương pháp ch n ẩ đoán E coli

Có nhiều phương pháp xác định E coli đã được sử dụng từ trước đến nay Các phương pháp dưới đây chỉ được nêu tóm tắt nguyên lý và các ưu điểm, nhược điểm của các phương pháp đó

1.3.1 Phương pháp định danh kinh điển

Bệnh phẩm phân được cấy trên môi trường ức chế chọn lọc cho các vi khuẩn đường ruột như Endo, Mac Conkey, DCL, SMAC Việc xác định - E coli dựa vào các tính chất sinh vật hóa học

Sử dụng test Indole dương tính ở 99% chủng E coli Đây là test đơn giản nhất để phân biệt E coli Dùng kháng huyết thanh mẫu đặc hiệu với các yếu tố kháng nguyên O, H, K để định loại E coli Tuy nhiên phương pháp này thường chỉ có giá trị phân biệt E coli với các thành viên khác trong họ vi khuẩn đường ruột [25 Do ]

sự đa dạng về cấu trúc kháng nguyên của E coli nên độ nhạy và độ đặc hiệu của

phản ứng này bị hạn chế Phương pháp này cũng tốn kém và mất rất nhiều thời gian

vì có quá nhiều týp huyết thanh của E coli, mặt khác một số chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác có thể phản ứng chéo [25]

1 2 3 Phương pháp thử nghi m tạo váng và gây ngưng kế ồ ệ t h ng c u ầ

Thử nghiệm này thường được dùng để sàng lọc Độ nhạy và độ đặc hiệu của thử nghiệm tạo váng trên môi trường lỏng trong chẩn đoán EAEC khoảng 90% Thử nghiệm này cho kết quả nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở các phòng xét nghiệm vi sinh bệnh viện [26]

1.3 3 Phương pháp thử nghi ệm trên độ ng v t th c nghi m ậ ự ệ

Một số thử nghiệm trên súc vật dựa trên đặc điểm độc lực của ETEC đã được

thực hiện như phương pháp quai ruột dùng để phát hiện độc tố ruột ST, phương pháp thực nghiệm trên chuột đang bú, thử nghiệm Sereny…[27] Những phương pháp này không những tốn kém mà còn thiếu sự tiêu chuẩn hóa [28]

1.3.4 Phương pháp miễ n d ch g n men ị ắ

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là kỹ thuật miễn dịch được

sử dụng tương đối rộng rãi để xác định các độc tố LT và ST của ETEC cũng như dùng để phát hiện nhanh các chủng E coli khác thuộc nhóm EPEC và EHEC [25]

Kỹ thuật ELISA dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên (KN) + kháng thể (KT) + kháng thể gắn enzym + chất phát triển màu Có nhiều kỹ thuật ELISA được

sử dụng, có thể được liệt kê như sau:

- ELISA gián tiếp (indirect ELISA)

- ELISA kẹp (Sandwich ELISA)

- ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) 2.5 Phương pháp nuôi cấy trên

tế bào

Các tế bào Hela, Hep 2… được dùng để xác định khả năng và cơ chế gây bệnh của E coli, đặc biệt là khả năng sinh độc tố và các gen quy định các yếu tố độc lực Thử nghiệm bám dính trên tế bào Hep 2 hiện nay vẫn được coi là “tiêu -chuẩn vàng” để xác định EAEC Phương pháp này cũng có giá trị nhất định trong phân biệt các nhóm E coli bám dính và gây tiêu chảy [25] Phương pháp này không được sử dụng phổ biến vì rất phức tạp và tốn kém, đòi hỏi người thực hiện phải có nhiều kinh nghiệm và chỉ thực hiện được ở một số rất ít những phòng xét nghiệm chuẩn

-1.3.5 Kỹ thu t sinh h c phân t ậ ọ ử

Sự ra đời của kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã đưa lại một cuộc cách mạng trong nghiên cứu phân tích gen và hệ gen bởi vì kỹ thuật này có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA đích quan tâm [29],[30 ]

Hiện nay kỹ thuật PCR đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới để phát hiện các gen độc tố của E coli gây bệnh Tại Việt Nam, các kỹ thuật PCR đang bước đầu

được sử dụng để phát hiện các gen độc tố của E coli, nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ em [28 ].

1.3.6 Kỹ thu t s c ký mi n d ậ ắ ễ ị ch

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICA-immunochromatographic assay) được phát triển dựa trên tương tác đặc hiệu kháng nguyên kháng thể và kỹ thuật sắc ký Kỹ - thuật này dùng để phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh trong mẫu mà không cần đến những thiết bị chuyên dụng hay phòng thí nghiệm [1] ICA thể hiện những ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật chẩn đoán truyền thống nhờ khả năng cho biết kết quả nhanh chỉ sau một bước phân tích[12 ]

Ngoài ra, ICA có thiết kế đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, ổn định theo thời gian trong các điều kiện môi trường khác nhau Theo nguồn Scopus [https://www.scopus com], từ năm 1964 đã có hơn 1.800 công trình công bố liên quan đến kỹ thuật sắc ký miễn dịch Mặc dù kỹ thuật này đã được biết đến vào những năm đầu thập niên 60, nhưng sau đó 30 năm, kỹ thuật này mới được quan tâm và phát triển mạnh mẽ cho tới ngày nay

Phương pháp miễn dịch ắc ký dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyêns kháng thể mà một trong hai thành phần này được gắn cộng hợp để phát hiện thành phần kia Sau đó, phức hợp này chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng và được tóm bắt bằng kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện[18]

-Đây là phương pháp cho kết quả nhanh, dễ thực hiện, được phát hiện từ năm

1956 và sử dụng hạt latex Trong 20 năm gần đây, ứng dụng công nghệ kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) và cải tiến nguyên liệu thành phần: sử dụng hạt nano kim loại làm thành phần cộng hợp (ví dụ: hạt vàng - Au) và màng nitrocellulose (NC) đảm bảo hoạt động mao dẫn, đồng thời sử dụng kỹ thuật gia công băng nhúng và/hoặc hộp thử, phương pháp ICA đang được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán: sản xuất que thử phát hiện kháng nguyên bề mặt cho hàng chục loại vi sinh vật khác nhau, phát hiện độc tố và độc chất, phát hiện kháng sinh tồn dư trong thực phẩm, ví dụ: que thử phát hiện kháng nguyên bề mặt

(HBsAg) của virus viêm gan B, que thử phát hiện V Cholerae O1 và O139 trong

mẫu bệnh phẩm lâm sàng [31], [32 ] Một số ưu và nhược điểm của que thử nhanh dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch được tóm tắt [12]:

Que thử nhanh dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch được chế tạo gồm 4 phần chính: (1) vùng nhận mẫu; (2) vùng cộng hợp; (3) màng nitrocellulose; và (4) vùng thấm hút [12 ]

Vùng nhận mẫu (sample pad): Được cấu tạo bởi màng cellulose hoặc sợi

thủy tinh với chức năng tiếp nhận mẫu (ở dạng dung dịch lỏng) và dẫn chúng tới vùng khác của que thử Với một số que thử được thiết kế đặc biệt thì vùng nhận mẫu có thêm quá trình tiền xử lý (đối với mẫu chứa nhiều tạp chất hoặc thành phần khó phân tích) Quá trình tiền xử lý mẫu thường bao gồm việc tách các thành phần tạp chất có trong mẫu, điều chỉnh nhiệt độ và độ pH

Dễ chế tạo, chi phí chế tạo rẻ

Ổn định với các điều kiện môi trường

khác nhau, thời gian bán hủy lâu

Dễ sử dụng, linh hoạt, không cần

Khả năng tái lập thay đổi theo lô sản xuất

Khó để thiết kế que thử để phân tích nhiều đối tượng cùng lúc

Ảnh hưởng bởi ái lực phân tử sinh học thấp với chất phân tích và dễ phản ứng chéo

Đôi khi mẫu cần xử lý trước > mất thời gian

-Tốc độ dịch chuyển mẫu trên que thử khó điều khiển

Thời gian phân tích phụ thuộc vào bản chất mẫu phân tích

Vùng cộng hợp (conjugate pad): Là vùng chứa các phức hợp phân tử sinh

học gắn với chất chỉ thị màu Vật liệu được sử dụng để thiết kế gắn kết tạo thành phức hợp luôn phải đảm bảo cho phức hợp có thể dễ dàng di chuyển khi tiếp xúc với mẫu Các phức hợp đã được gắn chất chỉ thị màu thường ổn định tại vùng này trong suốt thời gian sống của que thử Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đáng kể đến kết quả phân tích bao gồm: mật độ phức hợp gắn chất chỉ thị sinh học, độ khô hay khả năng phức hợp bứt ra khỏi tấm cellulose Vật liệu để thiết kế vùng phức hợp này có thể là sợi thủy tinh, cellulose hoặc polyesters Bản chất của các vật liệu rất quan trọng, ảnh hưởng tới dòng chảy, sự bắt cặp phức hợp với mẫu cũng như độ nhạy của que thử

Màng nitrocellulose (NC): Đây là thành phần rất quan trọng ảnh hưởng đến

độ nhạy của que thử Màng NC trong kỹ thuật sắc ký miễn dịch được sử dụng như một chất nền mà trên đó các phức hợp miễn dịch được hình thành và biểu thị sự có mặt hay không có mặt của chất phân tích Kích thước lỗ màng NC sử dụng trong kỹ thuật này dao động từ 3 đến 20 μm tùy thuộc vào đối tượng cần phân tích Trong kỹ thuật sắc ký miễn dịch, màng NC được sử dụng là do khả năng hấp thụ protein cao

và không bị ảnh hưởng bởi các chất hóa học Hơn nữa, màng NC có khoảng rỗng đủ lớn cho dòng chảy đi qua có tốc độ hợp lý Màng NC thường được gắn trực tiếp trên

đế polyester Để đạt hiệu suất phân tích tối ưu, người thiết kế cần phải có những hiểu biết nhất định về sự tương tác giữa chất phân tích với màng NC và khoảng cách giữa các vùng, các vạch (phản ứng và đối chứng) [36]

Vùng hút thấm (absorbent pad): Vùng này hoạt động giống như một bể

chứa ở cuối của que thử, chúng có vai trò giúp duy trì tốc độ dòng chảy của dung dịch mẫu trên màng NC Khả năng hút thấm đóng vai trò cực kì quan trọng đối với kết quả đầu ra của quá trình phân tích

Yếu tố quyết định chất lượng của que thử được thiết kế dựa trên kỹ thuật sắc

ký miễn dịch là các phần tử nhận biết sinh học (molecular recognition probes), có thể là các kháng thể hoặc kháng nguyên Trong phần lớn các nghiên cứu, kháng thể thường được sử dụng như là phần tử nhận biết sinh học, được gắn ở vị trí vạch phản

ứng (T test line) và vạch đối chứng (C – control line) của que thử Các kháng thể này dùng để nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên (chất cần phân tích trong mẫu hay phần tử đích) theo cơ chế chọn lọc hoặc thay thế Trong đó, các phần

-tử đích tự do sẽ cạnh tranh hoặc thế chỗ khi tương tác với kháng thể Ái lực giữa kháng nguyên với kháng thể phụ thuộc vào nồng độ, sự tương tác miễn dịch giữa chúng được thực nghiệm trong khoảng từ 107 n 10đế 10 M-1 [33] Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể có thể xảy ra theo bất kỳ tỷ lệ nào Tuy nhiên, phản ứng thể hiện rõ nhất khi số phần tử kháng nguyên tương đương với kháng thể Giới hạn phát hiện của que thử có thể đạt ngưỡng nano mole hay pico mole khi thay đổi một

số đại lượng vật lý như tăng cường thứ cấp (silver enhancement) thông qua việc thay đổi độ nhạy của chất chỉ thị màu hoặc là ủ mẫu trước khi phân tích, ngoài ra cn phụ thuộc vào từng đối tượng phân tích [34,35 ]

t ch

Chấ ỉ thị

Trong kỹ thuật sắc kí miễn dịch, nhiều loại vật liệu được sử dụng làm chất chỉ thị màu (label) như: hạt nano vàng, latex, nano bạc, chấm lượng tử… Chất chỉ thị màu khi được lựa chọn phải đảm bảo khả năng biểu thị màu ở nồng độ thấp và vẫn duy trì được tính chất ngay cả khi gắn kết với các phần tử nhận biết sinh học Chất chỉ thị tốt là chất dễ dàng gắn kết với phần tử nhận biết sinh học tạo thành phức hợp

và ổn định theo thời gian trong các điều kiện môi trường khác nhau Giới hạn phát hiện của chất chỉ thị có thể đạt tới nồng độ 10-9 M [37] Hình 1.2 khái quát về một

số chất chỉ thị được sử dụng trong kỹ thuật sắc ký miễn dịch Trong số những công

bố liên quan đến sắc ký miễn dịch tra cứu từ nguồn Scopus, phần lớn các công trình

sử dụng chất chỉ thị là keo nano vàng Nano vàng có ái lực cao đối với các phần tử sinh học và có thể dễ dàng được chức năng hóa Nano vàng có thể điều chế bằng những phương pháp khác nhau để đạt được sự ổn định, tính biểu thị quang học cao,

có ái lực cao với protein và các phần tử sinh học khác [38] Nhờ tính chất quang đặc biệt (hiệu ứng plasmon bề mặt), hạt nano vàng có khả năng làm tăng độ nhạy của que thử Ngoài ra, phức hợp nano vàng và kháng thể có thể ổn định trong điều kiện bảo quản khô, thời gian tồn tại tới 24 tháng Dưới các điều kiện tối ưu về pH và độ

đặc hiệu của kháng thể, kích thước hạt nano vàng cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tăng độ nhạy và thời gian phát hiện của que thử Do vậy, trong kỹ thuật sắc ký miễn dịch, việc chọn lựa kích thước hạt nano vàng làm chất chỉ thị cũng cần phải cân nhắc để tối ưu hóa, phù hợp với từng mục đích nghiên cứu và ứng dụng [12]

Hình 2.2 Các chỉ thị được sử dụng trong kỹ thuật sắc kí miễn dịch

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Hóa chất và kháng thể

- Dung dịch hạt nano vàng: Phòng thí nghiệm Proteomic thuộc Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học thuộc trường Đại học Bách Khoa điều chế hạt nano vàng

- Đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0.2g; Na2HPO4 1.44g; KH2PO4 0.24g Dẫn H2O đến 100 ml

- Dung dịch BSA (Sigma, Mỹ)

- Dung dịch thuốc thử Bradford

- Kháng thể đa dòng IgG thỏ kháng E coli được cung cấp bởi công ty Abcam; kháng thể đa dòng dê kháng thỏ được cung cấp bởi Arista Biologicals (Mỹ)

- Vi khuẩn E.coli O157 được nuôi cấy trên thạch dinh dưỡng và chuẩn độ 108cfu/mL, cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

- Vỏ nhựa (Xuất xứ Trung Quốc)

- Miếng thấm hút (Hãng Biotech –Absorbent pad H5076, size 20x30 cm)

- Đĩa ELISA (Xuất xứ Trung Quốc)

2.1.2 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội:

- Máy AUTOKUN (Sản xuất tại Ấn Độ, phân phối bởi công ty BCE Việt Nam)

- Máy CAMAG (Sản xuất tại Thụy Sĩ, phân phối bởi công ty BCE Việt Nam)

- Kim tiêm (phụ kiện đi kèm theo máy CAMAG)

- Lò lai phân tử (UVP Hybrid, Mỹ)

- Cân kỹ thuật TE 612 (Sartorius, CHLB Đức)

- Cân phân tích CPA 324S (Sartorius, CHLB Đức)

- Tủ cấy vô trùng Class II Type A2 (ESCO)

- Tủ lạnh sâu – 20oC (Sanyo, Nhật Bản)

- Tủ lạnh sâu – 80oC (Sanyo, Nhật Bản)

- Micropipette các loại (Biohit)

- Máy đo pH (Mettler Toledo)

- Máy ly tâm Eppendorf (Eppendorf 5415C, CHLB Đức)

- Máy khuấy từ

- Máy votex Delta Mixer (Taitex, Nhật Bản.)

2.2.3 Nguyên lý que th s ử ắc kĩ miễ n d ch ị

Việc thiết kế định dạng cho que thử nhanh dựa trên phương pháp sắc ký miễn dịch phụ thuộc vào kích thước và bản chất của chất cần phân tích Thiết kế theo nguyên lý kẹp sandwich: Kỹ thuật này được thiết kế sao cho chất cần phân tích (tác nhân gây bệnh) sẽ bị giữ lại ở vạch phản ứng và bị kẹp giữa phần tử dò (kháng thể thứ nhất) và phần tử nhận biết sinh học (kháng thể thứ hai) gắn chất chỉ thị màu (Hình 2.1) Kháng thể thứ nhất là kháng thể đa dòng IgG thỏ kháng E coli (KT2) được gắn cộng hợp với các hạt nano vàng dạng keo và cố định trên miếng cộng hợp Một kháng thể khác là kháng thể đa dòng dê kháng thỏ (KT1) được phủ lên vị trí kiểm tra của que thử [12]

Khi que thử tiếp xúc với mẫu, kháng nguyên sẽ đi theo dòng chảy dẫn tới vùng cộng hợp và phản ứng đặc hiệu với kháng thể được gắn trên miếng cộng hợp, hình thành nên phức hợp kháng nguyên - kháng thể chất chỉ thị màu Nhờ lực mao -

Hình 2.1 Mô hình que thử nhanh theo nguyên lý kẹp sandwich

dẫn, phức hợp này di chuyển dọc theo que thử tới vạch phản ứng, tại đó phức hợp bị giữ lại bởi kháng thể đã được cố định, kháng nguyên sẽ bị kẹp giữa các kháng thể Khi đó, dưới tác dụng của ánh sáng và sự tập trung của các chất chỉ thị với mật độ cao, vạch màu sẽ xuất hiện (hiện tượng sắc ký) Độ đậm nhạt của màu tại vạch phản ứng phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên có trong mẫu phân tích Lượng dư kháng thể không bắt cặp với kháng nguyên sẽ tiếp tục di chuyển theo dòng chảy và bị giữ lại bởi kháng thể khác (kháng thể đa dòng dê kháng kháng thể thỏ) tại vạch đối chứng Tương tự như ở vạch phản ứng, màu cũng sẽ xuất hiện tại vạch đối chứng do

có sự tập trung của chất chỉ thị Như vậy, mẫu được coi là dương tính khi xuất hiện màu ở cả hai vạch phản ứng và đối chứng; mẫu âm tính khi chỉ xuất hiện màu ở vạch đối chứng Sự xuất hiện màu ở vạch đối chứng đảm bảo khả năng hoạt động bình thường của que thử Ưu điểm của kỹ thuật kẹp sandwich là mẫu không cần tinh sạch trước khi phân tích; kỹ thuật này làm cho que thử nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu cao do sử dụng hai kháng thể đặc hiệu với chất cần phân tích (kháng nguyên), phù hợp với các mẫu phức tạp

Chấ t ch th s d ng trong nghiên c u này ỉ ị ử ụ ứ

Hạt nano vàng được tạo ra ở dạng lỏng bằng cách khử hydro tetraclorua vàng (HAuCl4 ), Au3+ bị khử thành Au2+ Sau khi hòa tan HAuCl4 trong nước cho khuấy

từ nhanh, đun sôi ở 280oC đồng thời bổ sung tác nhân khử vào, vàng bắt đầu dần dần kết tủa dưới dạng hạt nhỏ hơn nano mét và lớn dần lên khi dung dịch trở nên siêu bão hòa Các tác nhân ổn định và chất hoạt động bề mặt được bổ sung vào để ngăn các hạt vàng kết đám với nhau Hạt nano vàng được chức năng hóa bề mặt với các nhóm chức hữu cơ tạo nên liên kết vô cơ – hữu cơ, làm chúng được bao phủ bởi một lớp phân tử hữu cơ tích điện

Các hạt keo vàng với các nhóm chức năng gắn trên bề mặt như SH, - NH2 , - COOH có ứng dụng rất lớn trong công nghệ sinh học Chúng có thể kết hợp với các phân tử sinh học thông qua các nhóm chức để tạo thành chất đánh dấu

2.2 Quy trình th nghi m ự c ệ

2.2.1 Xác định hình thái, kích thước hạt nano vàng

Dung dịch nano vàng được nhỏ lên trên lưới đồng 200 lưới đã phủ màng collodion-cacbon trong 5 phút, sau đó dung dịch thừa được hút sạch và để khô trong không khí trước khi quan sát trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM1010 (JEOL) tại điện thế 80 kV

2.2.2. Quy trình xác lập điều kiện tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng -

Kháng thể được gắn lên bề mặt hạt nano vàng dựa trên sự hấp phụ vật lý giữa kháng thể và hạt nano vàng trong điều kiện pH, nhiệt độ nhất định Kháng thể được nhỏ vào dung dịch chứa các hạt nano vàng ở pH thích hợp Sau đó, bovine serum albumin (BSA) được nhỏ thêm vào dung dịch nhằm lấp đầy các vị trí trống trên bề mặt hạt nano sau khi các phân tử kháng thể đã gắn lên bề mặt hạt (hình 2.2) BSA giúp ngăn chặn việc bắt cặp không đặc hiệu trên bề mặt hạt vàng khi phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên kháng thể xảy ra.-

Hình: Quy trình gắn kháng thể với hạt Nano vàng

Việc tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng được thực hiện như sau:-

Hình 2.2 Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch hạt nano vàng

Bước 2: Kháng thể được thêm vào dung dịch trên, trộn nhanh và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 2 giờ-

Bước 3: Thêm 10 µl 10% BSA trong 20mM sodium borate vào dung dịch AuNPs

đã gắn kháng thể Đảo đều rồi ủ tiếp 15 phút ở nhiệt độ phòng BSA có tác dụng lấp đầy các vùng không liên kết bởi kháng thể, nhằm ngăn chặn sự bắt cặp không đặc hiệu với kháng nguyên

Bước 4: Dung dịch gắn được ly tâm ở 12000 rpm/5 phút ở 4C, thu tủa, loại bỏ phần dịch nổi Phần tủa chính là các hạt vàng đã gắn kháng thể và được block bằng BSA

Bước 5: Rửa phần tủa thu được lặp lại 2 lần với 20mM sodium borate chứa 1% BSA, sau đó thu lại bằng li tâm ở 12000 rpm/5 phút, thu tủa, loại bỏ dịch

Bước 6: Hòa tan trong đệm chứa: 2% BSA, 3% sucrose, 0.6 M NaCl, 0.2% Tween 20 Các bước chính trong tạo cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng:

Gắn kháng thể lên bề mặt hạt nano vàng tạo cộng hợp (Ab – AuNPs)

Che phủ chỗ trống trên bề mặt hạt nano

vàng bằng dung dịch BSA Rửa cộng hợp bằng BSA

Hòa tan cộng hợp trong đệm

Cố định cộng hợp lên miếng cộng hợp

2.3. Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp kháng thể - nano vàng 2.3.1. Xác định hàm lượng kháng thể

Kháng thể thỏ đóng vai trò bắt giữ kháng nguyên và là cầu nối giữa kháng nguyên và hạt nano vàng Lượng kháng thể sử dụng để tạo cộng hợp sẽ ảnh hưởng đến số lượng phân tử kháng thể hấp phụ lên bề mặt của hạt nano vàng Ngoài ra, lượng kháng thể tối ưu cũng sẽ phụ thuộc vào từng đối tượng vì nó liên quan đến độ nhạy hay ngưỡng phát hiện của phép thử đó Đối với dạng que thử được dùng để phát hiện kháng nguyên với hàm lượng nhỏ trong mẫu thì lượng kháng thể cộng hợp sẽ cần nhiều hơn, và ngược lại đối với những đối tượng cần phát hiện có mật độ lớn thì lượng kháng thể sử dụng sẽ ít hơn Thêm nữa, kháng thể là một trong những nguyên liệu có giá thành cao và là yếu tố tiên quyết để quyết định giá thành của sản phẩm nên việc tìm nồng độ kháng thể phù hợp là rất cần thiết Để tìm nồng độ kháng thể phù hợp, nghiên cứu thực hiện bằng cách pha loãng dịch kháng thể ở các nồng độ khác nhau (1 μg/µL; 0,75 μg/µl; 0,5 μg/µl; 0,25μg/µl; 0,1μg/µl) sau đó bổ sung vào dung dịch chứa nano vàng Màu của hỗn hợp sẽ thay đổi phụ thuộc vào nồng độ kháng thể

2.3.2. Xác định độ pH thích hợp

Nguyên tắc chung cho pH tối ưu có thể gắn với hiệu suất cao nhất dựa trên điểm đẳng điện PI của loại kháng thể đó Các hạt nano vàng sẽ gắn một cách hiệu quả với protein khi pH của dung dịch gần với điểm đẳng điện PI của protein đó Khi

ở pH cao hơn, hiệu suất gắn sẽ cao hơn nhưng điều này sẽ làm biến tính protein và làm cho phản ứng đặc hiệu trở nên kém và có thể mất tính đặc hiệu của kháng thể lên hạt vàng

Một điều đáng lưu ý là khi có quá nhiều protein gắn lên bề mặt hạt nano vàng sẽ là một bất lợi: một số protein liên kết yếu có thể tách khỏi bề mặt hạt nano Điều này sẽ làm các hạt có gắn protein trở nên kém hiệu quả vì các protein tự do sẽ cạnh tranh với các miền gắn trên hạt nano

Các hạt keo vàng kích thước nano mét được tổng hợp tồn tại ở dạng huyền phù bởi lực đẩy tĩnh điện lẫn nhau được sinh ra và duy trì bởi mạng lưới điện tích

chống lại lực đẩy tĩnh điện và khiến cho các hạt nano trần này co cụm và cuối cùng

là kết tủa khỏi dung dịch huyền phù Việc gắn kết với protein hoặc các tác nhân làm bền khác với bề mặt hạt nano tồn tại trong trạng thái sol bằng việc ngăn cản việc kết tủa bởi muối trên hạt nano vàng Việc gắn kết protein với hạt nano vàng phụ thuộc vào độ pH của dung dịch nano và dung dịch protein

Để tìm pH tối ưu cho việc gắn kháng thể lên hạt nano vàng, chúng tôi tiến hành như sau:

- Chuẩn bị 4 ống effpendof chứa 20 µl dung dịch nano vàng, sau đó các dung dịch được điều chỉnh pH thay đổi từ pH 5 tới pH 8

- Tạo miếng cộng hợp và kiểm tra tín hiệu vạch trên que pH tối ưu nhất cho phản ứng gắn là tại pH cho phép kháng thể gắn với bề mặt hạt nano vàng để ngăn cản sự hình thành kết tủa bởi muối

2.3.3. Xác định nhiệt độ cộng hợp

Kháng thể có bản chất là protein nên nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của chúng ngoài ra nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến việc gắn kháng thể lên bề mặt Để nghiên cứu nhiệt độ phản ứng tạo cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng, phản ứng tạo cộng hợp đã được tiến hành ở các nhiệt độ khác nhau 4 C, 25 C, 37 C   

2.3.4. Xác định thời gian cộng hợp

AuNPs nếu để lâu dưới ánh sáng và nhiệt độ cao các hạt nano vàng cũng sẽ tiếp diễn quá trình oxi hóa, cùng với điều này kháng thể bản chất là protein nên cũng dễ bị phân hủy và biến tính trong điều kiện phòng 25 C Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng tạo cộng hợp giữa kháng thể hạt vàng, tiến hành -

ở các thời gian 30, 60, 90, và 120 phút ở nhiệt độ phòng 25C

2.3.5 Xác định điều kiện cố định cộng hợp lên miếng cộng hợp

Conjugate pad được tạo ra bằng cách nhỏ 10 µl dung dịch tạo cộng hợp giữa kháng thể hạt vàng lên trên bề mặt miếng conjugate pad nguyên Sau đó tiến hành -