Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm elisa phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng chuẩn đoán rắn độc cắn ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ĐỖ KHẮC ĐẠI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ XÉT NGHIỆM ELISA PHÁT HIỆN NỌC RẮN ĐỘC VÀ ỨNG DỤNG LÂM SÀNG CHẨN ĐOÁN RẮN ĐỘC CẮN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: DỊ ỨNG VÀ MIỄN DỊCH Mã số: 62.72.01.09 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2013 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS TS LÊ VĂN ĐÔNG PGS TS NGUYỄN TRƯỜNG SƠN Phản biện 1: GS TS VĂN ĐÌNH HOA Phản biện 2: PGS TS NGUYỄN LIỄU Phản biện 3: GS TSKH NGUYỄN THU VÂN Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường vào hồi: ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Học viện Quân y ………………………… tháng năm DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Đỗ Khắc Đại, Đỗ Minh Trung, Nguyễn Đặng Dũng Lê Văn Đông (2009), “Nghiên cứu chế tạo xét nghiệm ELISA phát nọc bốn loài rắn độc thường gặp Việt Nam ứng dụng chẩn đoán rắn độc cắn mơ hình thực nghiệm”, Tạp chí Y dược học quân sự, (4), tr 16 - 23 Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Trường Sơn Lê Văn Đông (2011), “Nghiên cứu chế tạo xét nghiệm ELISA kiểu sandwich sử dụng loại kháng thể đặc hiệu phát nọc rắn lục xanh hổ đất”, Tạp chí Y dược học quân sự, (9), tr 30 - 37 Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Trường Sơn, Trần Quang Bính, Lê Khắc Quyến Lê Văn Đông (2012), “Nghiên cứu đánh giá hiệu xét nghiệm ELISA phát nọc rắn lục xanh hổ đất lâm sàng”, Tạp chí Y học Việt Nam, 396(1), tr 112 - 117 ĐẶT VẤN ĐỀ Rắn độc cắn tai nạn nguy hiểm thường gặp nước nhiệt đới, với 2,5 triệu người bị rắn độc cắn khoảng 125.000 người tử vong rắn độc cắn năm [39], [40], [66], [68], [121] Ở nước ta, chuyên gia ước tính năm có khoảng 30.000 người bị rắn cắn phần lớn không báo cáo ghi nhận đầy đủ nạn nhân tử vong trước kịp đến sở y tế cấp cứu điều trị theo biện pháp dân gian [wilken] Thống kê số liệu gần hai nghìn bệnh nhân rắn độc cắn nhập viện, chuyên gia Bệnh viện Chợ Rẫy nhận định số loài rắn độc thường gây tai nạn rắn cắn khu vực Miền Nam nước ta rắn lục xanh (43,3%), hổ đất (23,8%), chàm quạp (19,4%), hổ mèo (10%) hổ chúa (1,2%) [77] Nhiễm độc nọc rắn khơng điều trị kịp thời dẫn đến tử vong để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống nạn nhân sau sống sót [39] Theo Tổ chức Y tế Thế giới, phương pháp điều trị hiệu cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn huyết kháng nọc rắn (HTKNR) [114] Ở Việt Nam, có loại HTKNR thương phẩm sử dụng lâm sàng huyết kháng nọc rắn lục xanh hổ đất Viện vắc xin Sinh phẩm y tế (IVAC) Nha Trang sản xuất Tuy nhiên, việc sử dụng loại huyết kháng nọc rắn đơn đặc hiệu thực hiệu xác định sớm xác lồi rắn độc gây tai nạn rắn cắn [2] Cho đến nay, nước ta việc chẩn đốn lồi rắn độc gây tai nạn rắn cắn để sử dụng HTKNR chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, thường bị hạn chế thực bệnh viện tuyến cuối nơi có chuyên gia nhiều kinh nghiệm Hiện giới có số loại xét nghiệm dùng để phát nọc rắn độc Úc, Ấn Độ Đài Loan thực địa lâm sàng nước Tuy nhiên, đặc điểm địa lý khác nên có phân bố loài rắn khác vùng địa lý Từ đó, xét nghiệm phát nọc lồi rắn độc có khu vực khơng sử dụng để phát nọc lồi rắn có khu vực khác [15], [56] Do vậy, cần phải phát triển xét nghiệm phát riêng nọc rắn loài rắn độc sinh sống Việt Nam mà nước ta chưa có [5] Bộ xét nghiệm phát nọc rắn độc xét nghiệm cấp cứu; Ngồi khả phát nhanh xác nọc độc, xét nghiệm đòi hỏi phải đơn giản, dễ sử dụng, bền vững điều kiện bảo quản sử dụng thực địa, nơi có trang thiết bị tối thiểu Với lý trên, kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzym (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) thường áp dụng cho mục đích Trong dạng xét nghiệm ELISA, ELISA sandwich sử dụng hệ khuếch đại avidin-biotin (AB-ELISA) ELISA sandwich sử dụng kháng thể thứ ba gắn enzym (AbE-ELISA) hai dạng thiết kế ứng dụng nhiều phát triển xét nghiệm phát nọc rắn độc Từ sở lý luận thực tiễn nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu chế tạo xét nghiệm ELISA phát nọc rắn độc ứng dụng lâm sàng chẩn đoán rắn độc cắn Việt Nam” tiến hành nhằm: Chế tạo xét nghiệm AB-ELISA phát nọc độc loài rắn lục xanh, hổ đất, chàm quạp, hổ chúa phát triển xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc độc loài rắn lục xanh hổ đất Việt Nam Đánh giá hiệu phát nọc định loài rắn độc xét nghiệm ELISA bệnh phẩm lâm sàng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TAI NẠN RẮN CẮN VÀ CHẨN ĐOÁN RẮN ĐỘC CẮN 1.1.1 Một số loài rắn độc thường gặp gây tai nạn rắn cắn Việt Nam Việt Nam nước nằm vùng nhiệt đới với địa hình khí hậu khác miền Bắc, Trung, Nam Từ đặc điểm tự nhiên tạo nên đa dạng sinh học nước ta, có đa dạng lồi rắn độc Theo Trần Kiên Nguyễn Quốc Thắng (1995), Việt Nam có trăm lồi rắn, có hàng chục loài rắn độc phân bố cạn nước [8] Trong đó, số lồi rắn độc thường gặp gây tai nạn rắn độc cắn nước ta là: 1.1.1.1 Rắn lục xanh (Trimeresurus albolabris) Hình 1.1 Rắn lục xanh đuôi đỏ *Nguồn: theo Trần Thị Kim Ngân (2011) [9] Rắn lục xanh (Trimeresurus stejnegeri K Schmidt, 1925) lồi rắn có chiều dài m, sống cây, phần trước thể nhỏ phân biệt rõ với cổ, có hố má Mặt lưng màu xanh cây, mặt bụng màu xanh nhạt Dọc bên thân có đường màu trắng hay vàng, cá thể đực đường thường có màu đỏ Mỗi lứa đẻ có từ đến 10 rắn con; rắn sơ sinh trông giống rắn trưởng thành Có nọc độc nguy hiểm [8] Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu 1997 nạn nhân bị rắn độc cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị 10 năm, thấy số nạn nhân bị rắn lục xanh cắn chiếm tỷ lệ 43,3% loài rắn gây tai nạn rắn độc cắn nhiều tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn nghiên cứu [77] 1.1.1.2 Rắn hổ đất (Naja naja kaouthia) Hình 1.2 Rắn hổ đất *Nguồn: theo Lê Văn Đông (2010) [4] Rắn hổ đất (Naja naja kouthia Linnaeus 1758) miền Nam Việt Nam loài rắn cỡ lớn, đầu không phân biệt với cổ, vảy má Rắn có khả bạnh cổ bị kích thích, phía cổ trơng rõ vòng tròn màu trắng Rắn hổ miền Bắc Việt Nam (từ Đà Nẵng trở ra), hai bên vịng trịn có giải màu trắng (gọi gọng kính) Lưng có màu nâu thẫm, vàng lục hay đen, đồng màu có dải hoa văn vạch ngang đơn kép sáng màu Chiều dài thể tới 200 cm [8] Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu 1997 nạn nhân bị rắn độc cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị 10 năm, thấy số nạn nhân bị rắn hổ đất cắn chiếm tỷ lệ 23,8 % tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn nghiên cứu [77] 1.1.1.3 Rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma) Hình 1.3 Rắn chàm quạp *Nguồn theo Lê Văn Đông ( 2010) [4] Rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma, Boie, in Boie, 1827) lồi rắn có chiều dài khoảng 100cm với chín vảy che rắn cân đối phía đỉnh đầu Mõm nhọn chĩa lên phía Sống mũi kéo dài từ mắt đến mõm Thân không dày lắm, vảy trơn nhẵn Hoa văn thân gồm từ 19 đến 31 dấu hình tam giác màu nâu thẫm viền trắng xếp thành đôi đối diện xen kẻ Các đẻ từ 13 đến 30 trứng canh giữ suốt khoảng thời gian từ đến tuần lễ ấp trứng Rắn dài từ 13 - 20cm trông giống rắn trưởng thành [8] Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu 1997 nạn nhân bị rắn độc cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị 10 năm, thấy số nạn nhân bị rắn chàm quạp cắn chiếm tỷ lệ 19,4 % tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn nghiên cứu [77] 1.1.1.4 Rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) Hình 1.4 Rắn hổ mèo *Nguồn: theo Lê Khắc Quyến (2003) [77] Rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) loài rắn có đầu khơng phân biệt với cổ, khơng có vảy má Rắn có khả bạnh cổ bị kích thích, phía cổ nhìn rõ hai vòng tròn cân đối hai bên (giống hai mắt kính nên cịn gọi rắn mắt kính) nối với vệt hoa văn hình chữ V (giống gọng kính hình chữ V) Lưng có màu nâu thẫm, vàng lục hay đen, đồng màu Chiều dài thể tới 160 cm, chiều dài trung bình khoảng 90 – 120 cm Rắn non nở có hình dạng giống rắn trưởng thành có khả bạnh cổ [8] Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu 1997 nạn nhân bị rắn độc cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị 10 năm, thấy số nạn nhân bị rắn hổ mèo cắn chiếm tỷ lệ 10 % tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn nghiên cứu [77] 1.1.1.5 Rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah) Hình 1.5 Rắn hổ chúa *Nguồn: theo Lê Khắc Quyến (2003) [77] 98 giếng có phản ứng chéo có cường độ màu yếu so với giếng có phản ứng đặc hiệu Trên thực tế, số trường hợp cho kết dương tính giả bệnh nhân bị lồi rắn khác khơng thuộc lồi rắn có kít cắn, lại có phản ứng chéo với kít chẩn đốn lồi rắn [45], [106] 4.2.5 Độ ổn định xét nghiệm AbE-ELISA So với xét nghiệm AB-ELISA xét AbE-ELISA có độ ổn định tốt với thời gian ổn định tháng điều kiện bảo quản 40C (biểu đồ 3.9) Do vậy, xét nghiệm ứng dụng chẩn đốn rắn độc cắn lâm sàng Bộ xét nghiệm AbE-ELISA có độ ổn định tốt sinh phẩm dùng chế tạo kít sinh phẩm thương mại hóa huyết ngựa đặc hiệu nọc rắn lục xanh hổ đất IVAC sản xuất chứng minh hiệu điều trị lâm sàng cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ hãng Sigma, Mỹ cung cấp Chế phẩm IgG thỏ đặc hiệu loài rắn tạo nghiên cứu dạng phân tử IgG nguyên vẹn không gắn biotin hay enzyme nên có độ ổn định cao 4.3 HIỆU QUẢ PHÁT HIỆN NỌC VÀ ĐỊNH LOÀI RẮN ĐỘC CỦA BỘ XÉT NGHIỆM ELISA TRONG CÁC BỆNH PHẨM LÂM SÀNG 4.3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Trong số 122 bệnh nhân nghiên cứu tỷ lệ bệnh nhân nam cao nữ Kết phù hợp với nghiên cứu Carlos (2010) thống kê 297 trường hợp bệnh nhân bị rắn độc cắn Braxin có đến 206 (69,4%) nam giới [26] Độ tuổi bị rắn cắn nhiều từ 20 đến 39 tuổi, người độ tuổi lao động Kết phù hợp với kết nghiên cứu Fabricio (2010) thống kê bệnh nhân bị rắn cắn từ năm 1998 đến 99 2007 Ecuador [47] Theo Saurabh cộng (2011) nghiên cứu 86 trường hợp bệnh nhân chết rắn độc cắn quận Bankura, Tây Bengal, Ấn Độ từ năm 2006 đến 2008 thấy tỷ lệ nam giới 60,47% chủ yếu độ tuổi từ 20 đến 39 [103] Thời gian kể từ bị rắn cắn đến nhập viện điều trị (thời gan nhập viện): thời gian sớm hay muộn có liên quan tới khả phát nọc rắn độc xét nghiệm ELISA lâm sàng Thời gian dao động lớn, thời gian nhập viện sớm sau 30 phút kể từ bị rắn cắn muộn 192 (khoảng ngày) sau bị rắn cắn Thời gian nhập viện trung bình 15,3 giờ, nhập viện vịng 24 đầu chiếm 78% Theo nghiên cứu khác Ngơ Ngọc Quang Minh Vũ Huy Tru (2005) thời gian nhập viện trung bình 15,3 80% nhập viện trước 24 [5] Thời gian từ bị cắn đến lấy mẫu xét nghiệm trung bình 21,39 (bảng 3.5) Thời gian chẩn đốn xác lồi rắn độc cắn dựa vào lâm sàng muộn tức phải sau 12 kể từ nhập viện [5] Số liệu thống kê trường hợp bệnh nhân nhiễm độc rắn cắn điều trị huyết kháng nọc rắn đặc hiệu bệnh viện Chợ rẫy theo chẩn đoán lâm sàng bảng 3.10 cho thấy tỷ lệ nhóm bệnh nhân bị rắn lục xanh hổ đất cắn 50% bệnh nhân bị rắn chàm quạp cắn 84,62% Trong đó, theo Ngơ Ngọc Quang Minh Vũ Huy Tru tỷ lệ định sử dụng huyết kháng nọc rắn 65,2 % thực tế điều trị huyết kháng nọc rắn đặc hiệu thấp nhiều 37,7% [5] Theo Harris cộng (2010) nghiên cứu bệnh nhân bị nhiễm độc rắn cắn Bangladesh thấy rằng, số bệnh nhân có biểu nhiễm độc toàn thân thấp nhiều, chiếm tỷ lệ 39,59% [59] Thời gian trung bình từ nhập viện đến bắt đầu sử dụng huyết kháng nọc rắn 12 [5] Như vậy, tổng thời gian từ bị cắn đến sử dụng huyết kháng nọc rắn trung bình 27,3 Thời 100 gian bắt đầu sử dụng huyết kháng nọc rắn điều trị xem muộn so với yêu cầu điều trị nhiễm độc rắn cắn Chính vậy, có xét nghiệm ELISA phát nọc rắn độc ứng dụng lâm sàng giúp cho việc định sử dụng huyết kháng nọc rắn điều trị sớm Trong số 13 bệnh nhân chẩn đoán rắn hổ mèo cắn, khơng có bệnh nhân sử dụng huyết kháng nọc rắn đặc hiệu chưa có huyết kháng nọc rắn đặc hiệu hổ mèo điều trị Có thể thời gian tới, việc sản xuất huyết kháng nọc rắn hổ mèo cần nghiên cứu, để sớm có huyết kháng nọc rắn đặc hiệu điều trị cho nhóm bệnh nhân Phân bố bệnh nhân theo chẩn đốn lồi rắn cắn lâm sàng: tổng số 122 bệnh nhân bị rắn cắn nghiên cứu bệnh nhân bị rắn lục xanh cắn chiếm tỷ lệ cao 59,02% Kết phù hợp với nghiên cứu Lê khắc Quyến (2003) [77] Ngô Ngọc Quang Minh (2005) [5] 4.3.2 Kết xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc định loài rắn độc bệnh phẩm lâm sàng - Kết xét nghiệm AbE-ELISA loại mẫu xét nghiệm: máu, nước tiểu dịch vết cắn Kết xét nghiệm phát nọc rắn độc dương tính mẫu máu 25,2%, mẫu nước tiểu 44,5% mẫu dịch vết cắn 50% (bảng 3.11) Như vậy, xét nghiệm AbE-ELISA nghiên cứu phát nọc rắn độc có tất loại mẫu bệnh phẩm lâm sàng máu toàn phần, nước tiểu dịch vết cắn Theo Lê Văn Đơng tỷ lệ phần trăm xét nghiệm dương tính mẫu máu 52,3% mẫu nước tiểu 66,7% [80] Tỷ lệ cao nghiên cứu chúng tơi Điều sai khác tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân thời gian lấy mẫu xét nghiệm Tỷ lệ xét nghiệm ELISA cho kết dương tính bệnh nhân 101 thời điểm lấy mẫu có biểu nhiễm độc toàn thân cao so với nhóm khơng có biểu nhiễm độc tồn thân Điều giải thích nồng độ nọc độc lưu hành máu cao gây biểu nhiễm nọc độc tồn thân cho kết xét nghiệm với tỷ lệ dương tính cao - Kết xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc rắn lục xanh Kết xét nghiệm ELISA phát nọc rắn lục xanh dương tính bệnh nhân có chẩn đốn lâm sàng: rắn lục xanh cắn đạt tỷ lệ cao 62,5 % Chỉ có trường hợp có kết xét nghiệm ELISA dương tính với nọc rắn lục xanh mẫu bệnh phẩm bệnh nhân có chẩn đốn lâm sàng: khơng phải rắn lục xanh cắn, bệnh nhân Danh Xi M vào viện điều trị ngày sau trốn viện Do vậy, không ghi nhận liệu bệnh nhân có phải sử dụng huyết kháng nọc rắn đặc hiệu điều trị hay không (bảng 3.12) Kết xét nghiệm ELISA dương tính hay âm tính phụ thuộc vào nồng độ nọc độc có mẫu xét nghiệm bệnh nhân Nồng độ nọc độc phụ thuộc vào lượng nọc độc xâm nhập vào thể nạn nhân sau bị cắn thời gian lấy mẫu xét nghiệm Nồng độ nọc rắn độc phát mẫu bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân bị rắn độc cho kết dao động khác Hung Dong-Zong (2003) tiến hành xét nghiệm ELISA định lượng phát nọc rắn hổ Đài Loan từ 31 mẫu huyết lấy từ 27 bệnh nhân bị rắn hổ Đài Loan cắn nhiễm độc mức độ khác thấy rằng: nhóm bệnh nhân nhiễm độc nặng, nồng độ nọc rắn độc huyết dao động từ 228 – 1270 ng/ml [56] Một xét nghiệm ELISA định lượng khác chế tạo Margaret O’Leary (2006) có độ nhạy phát nọc rắn độc mức ng/ml Kết xét nghiệm ELISA định lượng phát nọc rắn độc có 13 mẫu huyết bệnh nhân bị rắn nâu nước Úc cắn lại dao động khoảng – 95 ng/ml [82] Kết xét nghiệm ELISA định lượng Selvanayagam (1999) phát nọc rắn độc 102 mẫu bệnh phầm lấy từ tử thi bị chết sau nhiễm độc rắn cắn lại thấp, cao 1,95 ng/ml mẫu bệnh phẩm lấy xung quanh vết cắn Không giống kết số nghiên cứu khác công bố, nồng độ nọc độc phát mẫu máu tử thi nghiên cứu Selvanayagam lại thấp, trung bình từ 0,1 – 0,3 ng/ml [44] Một nghiên cứu khác Victor Morais cộng (2012) 29 bệnh nhân bị rắn độc cắn Uruguay cho thấy nồng độ nọc độc trung bình máu bệnh nhân 57 ng/mL [117] Nghiên cứu không tiến hành xét nghiệm ELISA định lượng với mẫu bệnh phẩm lâm sàng Do đó, khơng có liệu nồng độ nọc rắn độc dao động khoảng mẫu bệnh phẩm nghiên cứu Trong số 50 bệnh nhân có chẩn đốn lâm sàng: khơng phải rắn lục xanh cắn có 49 trường hợp có kết xét nghiệm ELISA âm tính với nọc rắn lục xanh Như vậy, coi chẩn đoán lâm sàng sau bệnh nhân viện xác 100% kít xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc rắn lục xanh chế tạo có độ đặc hiệu 98% Trên lâm sàng, người ta phân chia bệnh nhân bị rắn lục xanh cắn thành hai nhóm: nhóm có nhiễm độc tồn thân (là bệnh nhân có rối loạn đơng máu) nhóm nhiễm độc nhẹ khơng có nhiễm độc tồn thân (là bệnh nhân khơng có rối loạn đơng máu) Trong đó, nhóm bệnh nhân có nhiễm độc tồn thân 100% định sử dụng huyết kháng nọc rắn đặc hiệu điều trị Kết xét nghiệm ELISA phát nọc rắn lục xanh dương tính nhóm bệnh nhân bị rắn lục xanh cắn có rối loạn đơng máu cao chiếm tỷ lệ là: 81,1% (bảng 3.13) Kết hoàn toàn phù hợp với thực tế lâm sàng bệnh nhân bị rắn lục xanh cắn có rối loạn đơng máu thường có nồng độ nọc rắn lục xanh máu nước tiểu cao bệnh nhân bị rắn lục xanh cắn khơng có rối loạn đơng máu Do vậy, xét nghiệm ELISA phát nọc rắn lục xanh có tỷ lệ dương tính cao mẫu xét nghiệm lấy từ nhóm bệnh nhân bị rắn lục xanh cắn có 103 rối loạn đơng máu Chỉ có tỷ lệ thấp chiếm 18,9% số bệnh nhân bị rắn lục xanh cắn có rối loạn đơng máu mà kết xét nghiệm ELISA âm tính Trong số này, có bệnh nhân có thời gian lấy mẫu xét nghiệm sau 45 phút kể từ bị rắn cắn, trường hợp bệnh nhân đến viện sớm vòng 30 phút sau bị rắn cắn Như vậy, trường hợp âm tính lấy mẫu xét nghiệm sớm theo Sueli cộng (2010) nghiên cứu thay đổi nồng độ nọc rắn B Alternatus máu chuột nhắt cho thấy nọc rắn độc bắt đầu xuất huyết sau 30 phút tiêm nọc độc lại giảm dần sau [108] Ngồi cơng trình công bố Sueli cộng sự, chưa thấy có tài liệu khác nghiên cứu vấn đề Thời gian bắt đầu xuất nọc rắn độc máu bệnh nhân bị rắn cắn phụ thuộc vào nhiều yếu tổ như: loại nọc rắn độc, lượng nọc rắn độc đáp ứng thể bệnh nhân nên có sai số sinh học cá thể khác Để có câu trả lời xác vấn đề cần có nghiên cứu thử nghiệm phát nọc rắn độc quy mô lớn cụ thể theo ca bệnh Sáu bệnh nhân cịn lại thuộc nhóm bị rắn lục xanh cắn có rối loạn đơng máu mà xét nghiệm ELISA phát nọc rắn lục xanh âm tính có thời gian lấy mẫu sớm sau 32 kể từ bị rắn cắn trung bình sau 47,6 kể từ bị rắn cắn Đây khoảng thời gian bệnh nhân có biểu triệu chứng rối loạn đông máu lâm sàng Kết xét nghiệm ELISA âm tính nọc độc chứa độc tố có xu hướng bám vào thụ thể chúng mơ đích khác độc tố thần kinh bám vào thụ thể synap thần kinh, độc tố máu bám vào yếu tố đơng máu vào tế bào thành mạch Chỉ độc tố bám vào thụ thể chúng phát huy tác dụng độc, độc tố tập trung chủ yếu quan đích khơng lưu hành tự máu nước tiểu, có lẽ lý làm cho nồng độ nọc độc tự máu nước tiểu xét nghiệm không cao dẫn đến kết 104 xét nghiệm ELISA trở nên âm tính Như vậy, phải việc lấy mẫu bệnh nhân xét nghiệm trước 45 phút sau 32 kể từ bị rắn cắn cho tỷ lệ xét nghiệm ELISA phát nọc rắn lục xanh dương tính khơng cao Vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu lớn để đưa kết luận xác Ở bệnh nhân rắn lục xanh cắn khơng có rối loạn đơng máu, kết xét nghiệm ELISA phát nọc rắn lục xanh dương tính chiếm tỷ lệ 42,9 % Điều thời điểm lấy mẫu xét nghiệm, nồng độ nọc độc lưu hành máu nước tiểu nằm ngưỡng phát xét nghiệm nên xét nghiệm cho kết dương tính Trong đó, nồng độ ngưỡng phát huy biểu nhiễm độc tồn thân sau thải trừ qua đường nước tiểu Mặt khác, khả huy động chế bù trừ thể nên bệnh nhân không bị rối loạn đông máu lâm sàng Điều cho thấy xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc rắn lục xanh nghiên cứu có khả phát tốt nọc rắn lục xanh mẫu bệnh phẩm lâm sàng, bệnh nhân bị rắn lục xanh cắn khơng có biểu nhiễm độc toàn thân - Kết xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc rắn hổ đất Kết xét nghiệm ELISA dương tính với nọc rắn hổ đất mẫu bệnh phẩm bệnh nhân có chẩn đốn lâm sàng: rắn hổ (hổ đất hổ mèo) cắn 68,4 % (bảng 3.14) Tuy số mẫu xét nghiệm nhóm bệnh nhân bị rắn hổ (hổ đất hổ mèo) cắn chưa nhiều, kết cho thấy có phản ứng chéo xảy bệnh nhân có chẩn đốn lâm sàng rắn hổ mèo cắn, xét nghiệm lại cho kết dương tính với nọc rắn hổ đất Đây điểm hạn chế kết không mong muốn gặp phải nghiên cứu hay nói cách khác xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc rắn hổ đất nghiên cứu chưa thể phân biệt nọc rắn hổ 105 đất hổ mèo Mặc dù kết khơng mơng muốn gặp phải, phát thú vị nghiên cứu Với việc sử dụng huyết ngựa đặc hiệu loài rắn hổ đất thương phẩm làm kháng thể bắt giữ xét nghiệm ELISA mà xét nghiệm lâm sàng lại xuất phản ứng chéo với nọc rắn hổ mèo Chính kết sở đề xuất hướng nghiên cứu mới, sử dụng huyết kháng nọc rắn hổ đất để điều trị cho bệnh nhân bị rắn hổ mèo cắn, bệnh nhân bị rắn hổ mèo cắn chưa có huyết kháng nọc rắn đặc hiệu điều trị Carlos (2010) sở nghiên cứu phản ứng chéo xảy huyết kháng nọc rắn crotalic với thành phần độc tố (kháng nguyên phản ứng chéo) thuộc loài rắn B Jararacussu đề xuất sử dụng huyết kháng nọc rắn crotalic điều trị cho bệnh nhân bị cắn loài rắn B Jararacussu [24] Từ kết nghiên cứu này, tìm liệu khoa học để giải thích lại có tượng xảy lâm sàng Trong năm 2007 Kasem Kulkeaw cộng xác định độc tố đơn lẻ có nọc rắn hổ đất Thái Lan thuộc 12 nhóm [70] Trong đó, có tới 31 thành phần độc tố giống nọc rắn hổ đất hổ mèo (theo liệu phân tích năm 2007) [54] Đây độc tố gây triệu chứng lâm sàng bị hai loại rắn cắn Ở Thái Lan, người ta chế tạo loại huyết kháng nọc rắn dùng chung cho bệnh nhân bị hai loại rắn cắn Như vậy, xét nghiệm ELISA phát nọc rắn hổ đất nghiên cứu có khả phân biệt bệnh nhân bị rắn hổ cắn (common cobra) với bệnh nhân bị loài rắn gây độc thần kinh khác cắn Những bệnh nhân có chẩn đốn lâm sàng: khơng phải rắn hổ cắn có kết xét nghiệm ELISA âm tính hay nói cách khác khơng thấy xuất kết xét nghiệm dương tính giả thực xét nghiệm ELISA phát nọc rắn hổ lâm sàng (nếu chẩn đoán lâm sàng xác) 106 - Kết xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc rắn độc theo thời gian lấy mẫu xét nghiệm Đề tài tiến hành phân chia mẫu bệnh phẩm lấy theo ba mốc thời gian trước giờ, từ – 24 sau 24 kể từ bị rắn cắn để khảo sát hiệu phát nọc rắn độc theo thời gian Kết cho thấy, xét nghiệm ELISA dương tính với mẫu máu nước tiểu thời điểm trước sau bị rắn cắn tương đương nhau, với tỷ lệ 35% 39,1% (bảng 3.15) Như vậy, kết nghiên cứu cho thấy nọc rắn độc xuất máu nước tiểu trước kể từ bị rắn cắn Cụ thể sau hai kể từ bị rắn cắn phát nọc rắn độc nước tiểu Theo Sueli cộng (2010) nghiên cứu thay đổi nồng độ nọc rắn B Alternatus nước tiểu chuột nhắt cho thấy: nọc độc phát nước tiểu sau đến kế từ tiêm độc tố nọc rắn tăng dần lên sau đó, sau ngày thứ không phát nọc độc nước tiểu [108] Trong khoảng thời gian từ đến 24 sau bị cắn tỷ lệ xét nghiệm ELISA dương tính mẫu nước tiểu cao mẫu máu với tỷ lệ 51,5% 30,9% (bảng 3.15) Điều hoàn toàn phù hợp vì: nước tiểu đường thải trừ nọc độc khỏi thể Nồng độ nọc độc bệnh nhân nhiễm độc nặng có xu hướng cao bệnh nhân khơng có nhiễm độc nặng, kết thải trừ nhiều nước tiểu làm cho tỷ lệ xét nghiệm nước tiểu cho kết dương tính cao Mặt khác, nước tiểu có có chế tái hấp thu nước cô đặc nên nồng độ nọc độc nước tiểu thời điểm lấy mẫu có lượng nọc độc đủ cao cho kết xét nghiệm dương tính mẫu máu cho kết xét nghiệm âm tính Sau 24 kể từ bị rắn cắn có khả phát nọc độc mẫu nước tiểu với tỷ lệ xét nghiệm dương tính 32,1% Kết phù hợp với kết công bố Sueli (2010) thời gian tồn nọc độc 107 nước tiểu ngày đầu kể từ tiêm nọc độc [108] Chỉ có trường hợp (chiếm tỷ lệ 3,7%) cho kết xét nghiệm dương tính mẫu máu thứ 28 sau bị rắn cắn Như vậy, sau 24 tỷ lệ xét nghiệm ELISA dương tính với nọc độc mẫu máu thấp Kết nghiên cứu cho thấy nên lấy mẫu máu xét nghiệm phát nọc rắn độc vòng 24 đầu kể thừ bị rắn cắn Sau 24 giờ, nên lấy mẫu nước tiểu dịch vết cắn (nếu có) để xét nghiệm phát nọc rắn độc Nghiên cứu thu thập mẫu dịch vết cắn để xét nghiệm ELISA phát nọc rắn độc với tỷ lệ xét nghiệm ELISA dương tính 2/4 mẫu Vì số lượng mẫu khơng nhiều nên nghiên cứu chưa thể đưa kết luận tỷ lệ xét nghiệm ELISA phát nọc rắn độc dương tính theo thời gian - Hiệu xác định loài rắn độc cắn xét nghiệm AbE-ELISA với xác định loài rắn cắn lâm sàng Nghiên cứu xác định độ nhạy độ đặc hiệu xét nghiệm AbE-ELISA lâm sàng số lý sau: Thứ chẩn đốn xác định loài rắn cắn lâm sàng hầu hết khơng có tiêu chuẩn vàng Thứ hai, bệnh nhân bắt xác rắn cắn mang đến bệnh viện việc nhận biết xác lồi rắn lúc (tùy thuộc vào kiến thức kinh nghiệm bác sĩ lâm sàng) Trên thực tế, tỷ lệ bệnh nhân bắt xác rắn cắn có đem rắn đến bệnh viện nhập viện lại Theo số liệu khơng thức khoa Bệnh nhiệt đới, Bệnh viên chợ rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ khoảng 10 % Có số trường hợp, bệnh nhân nhập viện với rắn bắt lại rắn gây tai nạn cho Điều đa dạng sinh học loài rắn độc, 108 nhiều loài rắn sống khu vực bệnh nhân bị rắn cắn điều kiện đêm tối việc bắt nhầm rắn gây tai nạn hồn tồn Thứ ba, khơng có tiêu chuẩn vàng chẩn đốn xác định lồi rắn cắn lâm sàng nên việc sử dụng huyết kháng nọc rắn đặc hiệu điều trị mà bệnh nhân khỏi bệnh không xem tiêu chuẩn vàng Bởi vì, có số trường hợp bệnh nhân nhiễm độc nhẹ dù có hay khơng có huyết kháng nọc rắn đặc hiệu điều trị bệnh nhân khỏi bệnh sau thời gian định Từ phân tích nêu trên, nên nghiên cứu sử dụng hệ số KAPPA để đánh giá độ phù hợp chẩn đốn xác định lồi rắn độc cắn xét nghiệm AbE-ELISA bệnh nhân vào viện so với xác định loài rắn độc cắn lâm sàng bệnh nhân viện Kết tính toán hệ số KAPPA bảng 3.12 cho thấy, sử dụng xét nghiệm AbE-ELISA làm cơng cụ chẩn đốn xác định loài rắn lục xanh cắn bệnh nhân vào viện có độ phù hợp với chẩn đốn lâm sàng bênh nhân viện với KAPPA = 0,56 Kết tính tốn hệ số KAPPA bảng 3.14 cho thấy, chẩn đốn xác định lồi rắn hổ cắn xét nghiệm AbE-ELISA bệnh nhân vào viện so với chẩn đoán lâm sàng bệnh nhân viện có độ phù hợp cao (KAPPA = 0,78) 4.3.3 Sự phù hợp kết xét nghiệm ELISA phát nọc rắn độc với điều trị HTKNR đặc hiệu lâm sàng Bệnh nhân có mã số nghiên cứu 74, 78 79 có kết xét nghiệm dương tính với nọc rắn lục xanh (hình 3.5) Trên lâm sàng, bệnh nhân chẩn đoán là: rắn lục xanh cắn có rối loạn đơng máu sử dụng huyết kháng nọc rắn lục xanh IVAC sản xuất để điều trị với số lượng từ đến 10 lọ Như vậy, lấy kết điều trị làm tiêu chuẩn vàng chẩn đoán xác định loài rắn độc cắn bệnh nhân viện ba bệnh nhân 109 74, 78 79 bị rắn lục xanh cắn Kết xét nghiệm AbE-ELISA ba bệnh nhân dương tính với nọc rắn lục xanh (hồn tồn phù hợp với lâm sàng) Hơn nữa, dựa vào kết xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc rắn lục xanh, chẩn đốn xác lồi rắn lục xanh cắn bệnh nhân này, bệnh nhân vào viện, đợi đến lúc bệnh nhân viện có chẩn đốn xác định Bệnh nhân có mã số nghiên cứu 44 cho kết xét nghiệm ELISA dương tính với nọc rắn hổ đất mẫu dịch vết cắn với cường độ màu đậm, nhiên kết mẫu máu nước tiểu lại âm tính (hình 3.6) Thời điểm xét nghiệm bệnh nhân thứ 20 sau bị rắn cắn, lâm sàng bệnh nhân không sử dụng huyết kháng nọc rắn hổ đất điều trị bệnh viện Chợ rẫy Lý do, bệnh nhân truyền huyết đặc hiệu nọc rắn hổ đất trước đến bệnh viện Chợ Rẫy lúc truyền có biểu sốc phản vệ nên dừng truyền chuyển đến Bệnh viện Chợ rẫy để điều trị Như vậy, bệnh nhân không phát nọc độc máu nước tiểu bệnh nhân sử dụng huyết kháng nọc rắn đặc hiệu trước Trong đó, lại phát nọc rắn độc mẫu dịch vết cắn với mật độ quang học đo lớn mẫu chứng dương Điều cho thấy, việc truyền huyết kháng nọc rắn đặc hiệu có hiệu trung hịa độc tố mơ xung quanh vết cắn Kết phù hợp với nghiên cứu Geoffrey (2010) đánh giá hiệu điều trị huyết kháng nọc rắn Acanthophis bệnh nhân bị loài rắn cắn thấy rằng: sau truyền huyết kháng nọc rắn đặc hiệu khơng cịn phát nọc rắn độc máu so với trước truyền bệnh nhân tiến triển tổn thương chỗ [50] 110 KẾT LUẬN Từ kết thu phân tích nêu trên, đề tài rút kết luận sau: Đã chế tạo xét nghiệm AB-ELISA phát nọc độc loài rắn lục xanh, hổ đất, chàm quạp, hổ chúa phát triển thành công xét nghiệm AbE-ELISA phát nọc độc loài rắn lục xanh hổ đất Việt Nam với thông số kỹ thuật sau: - Bộ xét nghiệm AB-ELISA có khả phát phân biệt nọc độc chuẩn loài rắn độc: lục xanh, hổ đất, chàm quạp hổ chúa pha máu toàn phần, huyết tương, nước tiểu dung dịch đệm với ngưỡng phát dao động từ 0,4 – 3,2 ng/ml tùy theo loại nọc rắn loại mẫu pha Độ ổn định xét nghiệm không tháng kể từ ngày sản xuất điều kiện bảo quản 40C - Bộ xét nghiệm AbE-ELISA có khả phát phân biệt nọc độc chuẩn rắn lục xanh hổ đất pha máu toàn phần, huyết tương, nước tiểu dung dịch đệm với ngưỡng phát dao động từ 0,5 – 4,0 ng/ml tùy theo loại nọc rắn loại mẫu pha Độ ổn định xét nghiệm đạt tháng kể từ ngày sản xuất điều kiện bảo quản 40C Qua phân tích 115 mẫu máu, 119 mẫu nước tiểu mẫu dịch vết cắn 122 bệnh nhân rắn độc cắn điều trị Bệnh viện Chợ Rẫy cho thấy, hiệu phát nọc định loài rắn độc xét nghiệm ELISA bệnh phẩm lâm sàng sau: - Bộ xét nghiệm AbE-ELISA có khả phát nọc rắn lục xanh hổ đất tất loại mẫu xét nghiệm lâm sàng bao gồm: máu toàn phần, nước tiểu dịch vết cắn với tỷ lệ xét nghiệm dương tính lần 111 lượt là: 25,2%; 44,5% 50 % Tỷ lệ phát nọc rắn lục xanh nhóm bệnh nhân có chẩn đốn lâm sàng rắn lục xanh cắn 62,5% Tỷ lệ cao nhóm bệnh nhân rắn lục xanh cắn có nhiễm độc tồn thân có sử dụng huyết kháng nọc rắn lục xanh điều trị 81,1% Tỷ lệ phát nọc rắn hổ (hổ đất hổ mèo) nhóm bệnh nhân có chẩn đoán lâm sàng rắn hổ cắn 68,4% - Chẩn đốn xác định lồi rắn lục xanh xét nghiệm AbE-ELISA vào viện phù hợp với chẩn đoán lâm sàng viện với KAPPA = 0,56 Chẩn đốn xác định lồi rắn hổ (hổ đất hổ mèo) xét nghiệm AbEELISA vào viện phù hợp với chẩn đoán lâm sàng viện với KAPPA = 0,78 112 KIẾN NGHỊ Nên ứng dụng xét nghiệm AbE-ELISA chẩn đốn lồi rắn độc sở cấp cứu điều trị rắn độc cắn, góp phần mở rộng việc định sử dụng sớm HTKNR, giảm bớt tỷ lệ tử vong di chứng cho nạn nhân rắn độc cắn nước ta Để có xét nghiệm AbE-ELISA thương phẩm, cần tiếp tục nghiên cứu phát triển hoàn thiện xét nghiệm AbE-ELISA để xác lập độ nhạy độ đặc hiệu xét nghiệm dựa panel mẫu nhiều loại nọc độc khác