I Đặt vấn đề Dừa (Cocos nucifera) là cây thân gỗ thuộc chi Cocos, họ Cau (Arecaceae). Dừa thường được trồng ở vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, phát triển mạnh trên đất cát pha, khả năng chịu mặn tốt, cần nhiều ánh sáng mặt trời và lượng mưa thường xuyên cao (1.500–2.500 mmhàng năm)3.Theo Hiệp hội Dừa Châu Á Thái Bình Dương (APCC) và Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), cây dừa được trồng trên 90 quốc gia vùng nhiệt đới với tổng diện tích 11,908 triệu ha năm 2016, trong đó diện tích dừa của các nước Châu Á – Thái Bình Dương là gần 11 triệu ha, chiếm 85% tổng điện tích dừa thế giới10. 10 quốc gia có diện tích trồng dừa lớn trên thế giới là Indonesia, Philippines, Ấn Độ, Sri Lanka, Brazil, Thái Lan, Papua New Guinea, Malaysia, Việt Nam và Vanuatu. Ba quốc gia hàng đầu là Indonesia, Philippines, Ấn Độ có diện tích trồng hơn 1 triệu ha, chiếm trên 80% sản lượng dừa thế giới. Năm 2020, theo thống kê của Hiệp hội Dừa Bến Tre tổng hợp theo Niên giám thống kê của các tỉnh có số liệu về dừa và Niên giám thống kê của Cộng đồng Dừa Quốc tế (International Coconut Community – ICC) tổng diện tích dừa của Việt Nam là 170 000 ha, với sản lượng 1,72 triệu tấn quả 8. Dừa được trồng chủ yếu tại Bến Tre, Trà Vinh, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cà Mau, Sóc Trăng, Bình Định và một số tỉnh miền Tây, miền Trung khác 8. Dừa là là loại cây trồng có giá trị kinh tế, có thể ra quả tới 60 70 năm. Trồng dừa mang lại sinh kế ổn định cho hàng triệu người ở khu vực Thái Bình Dương và Châu Á, nơi trồng hơn 89% diện tích dừa toàn cầu và 85% sản lượng cùi dừa, thu về hơn 1,08 tỷ USD thu nhập từ xuất khẩu 10. Tất cả các phần của quả và thân cây dừa đều sử dụng được và là nguyên liệu cho nhiều loại sản phẩm khác nhau. Hiện nay đã có hơn 70 chủng loại sản phẩm từ dừa được sản xuất 10. Quả dừa phần lớn là xơ và nước dừa. Sản lượng cơm dừa thế giới năm 2013 là 5,8 triệu tấn. Hầu hết cơm dừa được các nước dùng để sản xuất dầu dừa, chỉ 2% cơm dừa được xuất ra thị trường thế giới. Sản lượng dầu dừa thế giới năm 2013 là 3,65 triệu tấn, tổng lượng xuất khẩu là 1,9 triệu tấn 10. Cơm dừa khai thác tối đa để ép lấy dầu làm nguyên liệu trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, nhiên liệu sinh học, sơn… Nước dừa là nguyên liệu làm thạch dừa, giấm, thậm chí có thể làm dịch truyền, làm thức uống giải khát bổ dưỡng. Gáo, thân, xơ và lá dừa có nhiều cách sử dụng khác nhau như làm than hoạt tính, đồ mỹ nghệ, hàng gia dụng, thảm xơ dừa…và chất đốt. Thực tế, tại Việt Nam và các nước trồng, chế biến các sản phẩm từ dừa thì nước dừa già thải ra từ các nhà máy nạo cơm dừa là rất lớn. Riêng ở Công ty TNHH chế biến dừa Lương Quới mỗi ngày xả thải từ 90.000 đến 100.000 lít nước dừa già. Đa phần nước dừa già sẽ bị thải bỏ gây lãng phí và làm ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Vì vậy việc tận thu nước dừa già để tiếp tục sản xuất thạch dừa là cần thiết, góp phần đa dạng hóa sản phẩm, nâng cao giá trị trái dừa, hạn chế nước thải dừa, hạn chế gây ô nhiễm môi trường. Sản xuất nata de coco phổ biến ở các khu vực sản xuất dừa lớn như Hải Nam (Trung Quốc), Bến Tre (Việt Nam), Pontianak của Indonesia. Tại Bến Tre (Việt Nam), sản lượng trung bình của nata de coco thô nằm trong khoảng 15.000 tấn mỗi năm, giá bán trung bình năm 20102011 ở mức 137,5 USDtấn 6. Giá bán thạch dừa của Thái Lan ra thị trường bên ngoài nằm trong khoảng 2001000 USDtấn 6. Tại Indonesia, giá thị trường trung bình (nội bộ) của tấm nata de coco thô dao động từ 68 đến 75 USDtấn 6. Năm 2021, riêng công ty Vinacoco sản xuất được 15000 tấn thạch dừa, đạt doanh thu 111 tỷ, mang về lợi nhuận trước thuế 21 tỷ và đóng góp hơn 50% lợi nhuận cho tập đoàn GC Food 9. Thạch dừa (nata de coco) là một loại thực phẩm có nguồn gốc từ Philippines. Thạch dừa được sản xuất từ nước dừa già qua quá trình lên men vi khuẩn Acetobacter xylinum. Thạch dừa là sản phẩm ngoại bào trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Thạch dừa là một màng nhầy có chứa Hemicellulose 25. Thạch dừa có bản chất là polisaccharide ngoại bào, mạng polisacharide đan xen chằng chịt nhau theo nhiều hướng không theo quy luật do vi khuẩn lên men chuyển động tự do nên thạch dừa dai, chắc về mọi phía 25. Đây là một loại thực phẩm có màu trắng gần như trong suốt và dai, thường được dùng làm kẹo hoặc dung kèm với đồ uống. Hình 1.1: Thạch dừa Sản xuất thạch dừa là quá trình lên men bề mặt do vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo váng trên bề mặt môi trường nước dừa già 52. II Nguyên liệu 2.1 Nước dừa già Nước dừa già là nguyên liệu chính trong sản xuất thạch dừa. Nước dừa là phần nội nhũ lỏng được tìm thấy trong khoang của hạt. Thành phần của nước dừa phụ thuộc vào một số yếu tố như tuổi, giống, mùa trồng trọt, vị trí địa lý và điều kiện môi trường, bao gồm cả lượng mưa và nhiệt độ. Nước dừa thu hoạch từ những quả có độ tuổi từ 10 12 tháng tuổi được xếp vào loại nước dừa trưởng thành (dừa già). Do trong quá trình trưởng thành, nước dừa được sử dụng để hình thành cùi dừa bên trong trái nên thể tích nước dừa giảm. Nước dừa bao gồm 95% là nước, với một lượng nhỏ carbohydrate, protein, dầu, vitamin và khoáng chất.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ-ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Khoa Cơng nghệ Nơng nghiệp ĐỀ TÀI: CƠNG NGHỆ LÊN MEN THẠCH DỪA HỌC PHẦN CÔNG NGHỆ LÊN MEN VÀ PHÁT TRIỂN SINH PHẨM Họ tên sinh viên: Nghiêm Thị Huế Hà Nội, 2023 MỤC LỤC I Đặt vấn đề II Nguyên liệu 2.1 Nước dừa già 2.2 Vi sinh vật [2][5] 2.2.1 Đặc điểm chủng giống .8 2.2.2 Tiêu chí chọn giống sản xuất III Quy trình cơng nghệ sản xuất thạch dừa [5][2] .11 3.1 Sơ đồ 11 3.2 Giải thích sơ đồ 12 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men .16 IV Đánh giá chất lượng sản phẩm lên men 18 V Tiềm ứng dụng 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 I Đặt vấn đề Dừa (Cocos nucifera) thân gỗ thuộc chi Cocos, họ Cau (Arecaceae) Dừa thường trồng vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, phát triển mạnh đất cát pha, khả chịu mặn tốt, cần nhiều ánh sáng mặt trời lượng mưa thường xuyên cao (1.500–2.500 mm/hàng năm)[3].Theo Hiệp hội Dừa Châu Á - Thái Bình Dương (APCC) Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), dừa trồng 90 quốc gia vùng nhiệt đới với tổng diện tích 11,908 triệu năm 2016, diện tích dừa nước Châu Á – Thái Bình Dương gần 11 triệu ha, chiếm 85% tổng điện tích dừa giới[10] 10 quốc gia có diện tích trồng dừa lớn giới Indonesia, Philippines, Ấn Độ, Sri Lanka, Brazil, Thái Lan, Papua New Guinea, Malaysia, Việt Nam Vanuatu Ba quốc gia hàng đầu Indonesia, Philippines, Ấn Độ có diện tích trồng triệu ha, chiếm 80% sản lượng dừa giới Năm 2020, theo thống kê Hiệp hội Dừa Bến Tre tổng hợp theo Niên giám thống kê tỉnh có số liệu dừa Niên giám thống kê Cộng đồng Dừa Quốc tế (International Coconut Community – ICC) tổng diện tích dừa Việt Nam 170 000 ha, với sản lượng 1,72 triệu [8] Dừa trồng chủ yếu Bến Tre, Trà Vinh, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cà Mau, Sóc Trăng, Bình Định số tỉnh miền Tây, miền Trung khác [8] Dừa là loại trồng có giá trị kinh tế, tới 60 - 70 năm Trồng dừa mang lại sinh kế ổn định cho hàng triệu người khu vực Thái Bình Dương Châu Á, nơi trồng 89% diện tích dừa toàn cầu 85% sản lượng cùi dừa, thu 1,08 tỷ USD thu nhập từ xuất [10] Tất phần thân dừa sử dụng nguyên liệu cho nhiều loại sản phẩm khác Hiện có 70 chủng loại sản phẩm từ dừa sản xuất [10] Quả dừa phần lớn xơ nước dừa Sản lượng cơm dừa giới năm 2013 5,8 triệu Hầu hết cơm dừa nước dùng để sản xuất dầu dừa, 2% cơm dừa xuất thị trường giới Sản lượng dầu dừa giới năm 2013 3,65 triệu tấn, tổng lượng xuất 1,9 triệu [10] Cơm dừa khai thác tối đa để ép lấy dầu làm nguyên liệu ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, nhiên liệu sinh học, sơn… Nước dừa nguyên liệu làm thạch dừa, giấm, chí làm dịch truyền, làm thức uống giải khát bổ dưỡng Gáo, thân, xơ dừa có nhiều cách sử dụng khác làm than hoạt tính, đồ mỹ nghệ, hàng gia dụng, thảm xơ dừa…và chất đốt Thực tế, Việt Nam nước trồng, chế biến sản phẩm từ dừa nước dừa già thải từ nhà máy nạo cơm dừa lớn Riêng Công ty TNHH chế biến dừa Lương Quới ngày xả thải từ 90.000 đến 100.000 lít nước dừa già Đa phần nước dừa già bị thải bỏ gây lãng phí làm nhiễm mơi trường nghiêm trọng Vì việc tận thu nước dừa già để tiếp tục sản xuất thạch dừa cần thiết, góp phần đa dạng hóa sản phẩm, nâng cao giá trị trái dừa, hạn chế nước thải dừa, hạn chế gây ô nhiễm môi trường Sản xuất nata de coco phổ biến khu vực sản xuất dừa lớn Hải Nam (Trung Quốc), Bến Tre (Việt Nam), Pontianak Indonesia Tại Bến Tre (Việt Nam), sản lượng trung bình nata de coco thơ nằm khoảng 15.000 năm, giá bán trung bình năm 2010-2011 mức 137,5 USD/tấn [6] Giá bán thạch dừa Thái Lan thị trường bên nằm khoảng 200-1000 USD/tấn [6] Tại Indonesia, giá thị trường trung bình (nội bộ) nata de coco thô dao động từ 68 đến 75 USD/tấn [6] Năm 2021, riêng công ty Vinacoco sản xuất 15000 thạch dừa, đạt doanh thu 111 tỷ, mang lợi nhuận trước thuế 21 tỷ đóng góp 50% lợi nhuận cho tập đoàn GC Food [9] Thạch dừa (nata de coco) loại thực phẩm có nguồn gốc từ Philippines Thạch dừa sản xuất từ nước dừa già qua trình lên men vi khuẩn Acetobacter xylinum Thạch dừa sản phẩm ngoại bào trình trao đổi chất vi khuẩn Acetobacter xylinum Thạch dừa màng nhầy có chứa Hemicellulose [2][5] Thạch dừa có chất polisaccharide ngoại bào, mạng polisacharide đan xen chằng chịt theo nhiều hướng không theo quy luật vi khuẩn lên men chuyển động tự nên thạch dừa dai, phía [2][5] Đây loại thực phẩm có màu trắng gần suốt dai, thường dùng làm kẹo dung kèm với đồ uống Hình 1.1: Thạch dừa Sản xuất thạch dừa trình lên men bề mặt vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo váng bề mặt môi trường nước dừa già [5][2] II Nguyên liệu 2.1 Nước dừa già Nước dừa già nguyên liệu sản xuất thạch dừa Nước dừa phần nội nhũ lỏng tìm thấy khoang hạt Thành phần nước dừa phụ thuộc vào số yếu tố tuổi, giống, mùa trồng trọt, vị trí địa lý điều kiện môi trường, bao gồm lượng mưa nhiệt độ Nước dừa thu hoạch từ có độ tuổi từ 10 - 12 tháng tuổi xếp vào loại nước dừa trưởng thành (dừa già) Do trình trưởng thành, nước dừa sử dụng để hình thành cùi dừa bên trái nên thể tích nước dừa giảm Nước dừa bao gồm 95% nước, với lượng nhỏ carbohydrate, protein, dầu, vitamin khống chất Bảng 2.1: Thành phần hóa học nước dừa dựa công bố khác (1, 4, 7, 11): Nguồn Loại dừa (1) (4) Non Trọng lượng trung bình dừa (g) Tuổi dừa (11) Xanh non Bánh tẻ (7) Già Gìa (đã qua hấp khử trùng ) 206 (nước) Nguồn dừa Deerfield Beach, FL Proximates Nước g/100g Khô Năng lượng Protein Tổng Lipid Tro Cacbohidrat 5.01 19 kcal 0.72 0.2 0.39 3.71 Non Già 565 393 tháng 12 tháng Dominican Republic g/100g 94.1 94.45 5.82 5.55 94.99 0.12 0.07 0.87 4.76 0.52 0.15 0.47 4.41 Chất xơ Đường Tổng mg/ml Sucrose Glucose Fructose Rượu đường 9.18 7.25 5.25 Không đơn vị 0.8 15 mg/ml 0.01 0.05 mg/ 100g Mannitol Sorbitol Myo-inositol Scyllo-inositol Ion vô g/100g 2.61 Ca 9.16 0.93 3.93 4.3 mg/ml 21.6 13.8 9.18 8.9 7.25 2.46 5.25 2.51 mg/100g mg/100g 0.01 30 37 312 250 312 Na Zn Cu Mn Se Cl S Al B Vitamin Vitamin C, Thiamin (B1) Riboflavin (B2) Niacin (B3) 105 105 0.1 0.04 0.142 0.001 105 Folate, total 10.7 2.02 2.48 0.06 2.61 2.55 0.51 1.48 1.43 0.01 0.05 0.29 25 20 0.04 183 24 0.52 3.42 15 0.01 30 37 mg/ml 5.23 0.8 24 0.04 15.2 mg/l Fe Mg P K Pantothenic acid (B5) Pyridoxine (B6) Không phát g/100g 1.1 183 24 mg/100g 2.4 0.03 0.057 mg/l 0.08 0.64 0.043 0.52 0.032 Vết Vết 0.01 0.03 mg/100g 27.3 0.02 6.4 4.66 203 1.75 0.07 0.01 0.12 31.64 0.02 9.44 12.77 257.5 16.1 0.02 0.03 0.08 0.58 0.07 0.06 0.06 0.08 mg/100dm3 7.41 Vết 0.01 Không phát Không phát Folic acid Folate, food Biotin Nicotinic (Niacin) acid Acid amin Alanine β-Alanine γ-Aminobutyric acid 0.003 0.00 0.02 0.02 0.64 0.64 µg/ml g/100g 312 0.037 mg/g defatted sample µg/ml 16.4 127 177 1.9 34.6 0.118 14.7 25.6 168 16.8 0.07 11.3 17.1 35.9 10.1 9.4 80 1.3 70.8 45.4 9.7 3.5 6.3 6.2 4.4 3.5 37.3 21.4 16.9 198 1.13 3.88 20.7 0.13 0.81 5.4 10.4 11.4 25.3 1.6 0.76 78.7 13.4 13.9 5.2 104.9 18 8.8 3.44 3.75 0.43 0.11 3.39 0.26 0.66 4.72 0.22 0.67 0.27 0.58 3.41 0.21 12 820 Arginine 133 Asparagine and 60 glutamine Aspartic acid 65 Asparagine Cystine 0.97 Glutamic acid 240 Glutamine Glycine 13.9 Homoserine 5.2 Histidine Vết Isoleucine 18 Leucine 22 Lysine 150 Methionine Ornithine 22 Phenylalanine 12 Pipecolic acid Proline 97 Serine 111 Tyrosine 16 Tryptophan 39 Threonine 44 Valine 27 Dihydroxyphenylalin e Hydroxyproline Pipecolic acid Hợp chất nitơ µmol/ml 0.014 0.165 0.034 0.017 0.028 0.053 0.032 0.013 0.037 31.7 22.5 173.2 33 13 10.2 0.03 0.037 0.022 0.008 0.026 0.044 4.1 7.3 0.9 31.9 45.3 6.4 21.6 65.8 3.1 12.9 85 0.52 0.64 0.95 1.06 2.9 5.6 16.2 20.6 26.3 15.1 27.4 15.5 0.2 0.91 0.33 0.82 4.1 0.26 8.2 Ethanolamine Acid hữu Tartaric Malic Citric Acetic Pyridoline Succinic Shikimic and quinic acids Phytohormones Auxin 1,3- Diphenylurea Cytokinin Tính chất hóa học pH 0.01 meq/mL meq/mL 34.31 9.36 0.37 0.39 mg/ ml 0.43 mg /100 DM 1.6 2.4 34.3 0.37 11.9 0.31 0.39 0.18 0.27 0.28 0.18 14.08 317 0.38 307 24.8 1.3 0.57 mg/ L 0.07 5.8 mg/mL 0.07 4.6-5.6 4.7 ± 0.1 5.2 ± 0.1 Đường: Đường nước dừa bao gồm carbohydrate, cụ thể sucrose, glucose fructose Đây loại đường góp phần tạo nên vị nước dừa Trong nước dừa non đường tồn chủ yếu dạng glucose fructose (đường khử) Trong nước dừa già, hàm lượng đường tổng khoảng 4%, cần bổ sung đường trình lên men.Vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả sử dụng loại đường nước dừa già để lên men tạo cấu trúc thạch dừa Protein: Nước dừa chứa lượng nhỏ protein, chiếm khoảng 0.5 %, acid amin không cân đối, không đủ cung cấp nitơ cho vi khuẩn hoạt động, Vì cần cung cấp thêm nito cho vi khuẩn trình lên men Vitamin: Trong nước dừa già có vitamin C, đủ vitamin nhóm B: B1, B2, B3, B5, B6, B7 B9 với hàm lượng nhỏ, đủ cung cấp cho vi sinh vật hoạt động Khoáng chất: Nước dừa giàu khoáng chất cần thiết như: K, Mg, P, S, Fe, Ca, Na, Zn, Mn, B… Ngồi ra, nước dừa cịn thấy số kích thích sinh trưởng auxin, 1,3diphenieriea…; acid hữu Citric, Acetic, Malic, Pyridoline… Nước dừa sử dụng sản xuất thạch dừa lấy từ nhà máy nạo sấy cơm dừa, vận chuyển cần đảm bảo vệ sinh, tránh nhiễm vi sinh từ bên Nước dừa phải trái dừa 10 - 12 tháng tuổi hàm lượng đường cao Trước vận chuyển cần kiểm tra nước trong, khơng có mùi, màu sắc lạ 2.2 Vi sinh vật [2][5] Giống vi sinh vật sử dụng sản xuất thạch dừa vi khuẩn Acetobacter xylinum 2.2.1 Đặc điểm chủng giống Acetobacter xylinum vi khuẩn lactic Theo Bergey, A xylinum thuộc hệ thống phân loại sau: Lớp: Schizomycetes, Bộ: Pseudomonadales, Họ: Pseudomonadaceae, Loài: Acetobacter xylinum (1) Đặc điểm hình thái: Vi khuẩn Acetobacter xylinum vi khuẩn hình que, kích thước khoảng – µm, tế bào đứng riêng lẻ xếp thành chuỗi, chúng khơng có khả di động, không sinh bào tử Các tế bào bọc chất nhày tạo váng nhăn có chứa Hemicenllulose, bắt màu với thuốc nhuộm Iot H2SO4 Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hố dị dưỡng Tế bào chúng thường tìm thấy giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, đất Hình 2.1: Vi khuẩn Acetobacter xylinum (2) Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển nhiệt độ 28 – 32 ℃, pH < có thể, pH < tích lũy 4,5% acid acetic Acid axetic sinh trình hoạt động vi khuẩn, vượt mức cho phép chúng gây ức chế vi khuẩn hoạt động Ở 37 ℃, pH < tế bào suy thối hồn tồn điều kiện mơi trường tối ưu Acetobacter xylinum có khả chịu pH thấp, thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế nhiễm khuẩn lạ 10 Nguồn carbohydrate mà A xylinum sử dụng cho khả tạo sinh khối cao glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất thấp sử dụng glycerol, lactose, sucrose, maltose; hiệu suất sử dụng sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol acetat Vi khuẩn Acetobacter xylinum hấp thụ đường Gucose từ môi trường nuôi cấy; tế bào glucose kết hợp với axit béo tạo thành tiền chất nằm màng tế bào Sau khỏi tế bào tiền chất enzyme polyme hóa thành xenlulose Vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo lớp xenlulose dày môi trường lên men nước dừa già bổ sung chất dinh dưỡng cần thiết 2.2.2 Tiêu chí chọn giống sản xuất A xylinum ni cấy nhiều loại mơi trường khác ví dụ như: - Môi trường nước dừa già: Acid axetic 5ml, (NH4)2SO4 8g, (NH4)2HPO4 2g, Saccharose 20g, nước dừa già 1000ml, - Môi trường nước dốt dừa: (NH4)2SO4 0,6%, (NH4)2HPO4 0,6%, Saccharose 6%, tỷ lệ cơm dừa/nước dừa (g/ml) 1/10 - Môi trường nước ép dứa: (NH4)2SO4 0,8%, (NH4)2HPO4 0,6%, Saccharose 6%, tỷ lệ dứa/nước dứa (g/ml) 1/10 3/10 Trong sản xuất, chủng Axetobacter xylinum phải có khả sử dụng nhiều loại đường khác glucose, lactose, maltose, galactose để tạo màng cenlulose dai phía bề mặt mơi trường Chủng sản phải có khả cạnh tranh ức chế vi sinh vật tạp nhiễm cao; bị thối hóa; khơng sinh độc tố; giống có khả tạo cellulose với hàm lượng lớn, chịu nồng độ chất khô cao (nồng độ chất khơ thích hợp cho q trình hình thành dừa 11.5-12◦Bal 11 III Quy trình cơng nghệ sản xuất thạch dừa [5][2] 3.1 Sơ đồ Quy trình cơng nghệ sản xuất thạch dừa tóm tắt sau: 12 3.2 Giải thích sơ đồ (1) Nhân giống vi khuẩn Acetobacter xylinum cho sản xuất: Giống Acetobacter xylinum nuôi môi trường ống thạch nghiêng Trước cấy giống, ống nghiệm chứa môi trường tiệt trùng 121 ℃, pH < có thể, 20 ℃, pH < Thành 13 phần mơi trường ni cấy 8g (SA) (NH4)2SO4, 2g (NH4)2HPO4 (DAP), 20 g Saccharose, 20g aga, 1000ml nước dừa Sau cấy giống, giữ ống nghiệm tủ ấm đến ngày Lựa chọn ống nghiệm cho chủng giống phát triển tốt, bảo quản – ℃, pH < Sau tiến hành nhân giống cấp 1,2 tùy theo quy mô sản xuất Tuy nhiên lúc giống nhân lên môi trường dịch thể Giống cấy theo tỷ lệ 10%, sử dụng lắc sục khí 18 - 20 Sau giống đưa vào sản xuất tùy vào quy mơ mà nhân giống cấp cho đủ lượng giống sản xuất - Nhân giống cấp 1: môi trường nhân giống cấp khơng có aga, pH điều chỉnh 3.8 - acid axetic Môi trường khử trùng 100 ℃, pH < có thể, 30 phút Giống cấp nhân lên bình tam giác 100ml môi trường nguội đến 30 ℃, pH < có thể, tiến hành cấy giống, lắc sục khí 18 - 20 giờ, ni nhiệt độ phòng Khi xuất lớp váng trắng, lên bề mặt mơi trường nhân giống cấp - Nhân giống cấp 2: Môi trường nhân giống cấp môi trường nhân giống cấp Tuy nhiên giống cấp ni bình tam giác 250ml (2) Quá trình lọc nước dừa già Nước dừa già sau vận chuyển từ nhà máy nạo sấy cơm dừa đến nhà máy sản xuất thạch dừa cần trải qua trình lọc để loại bỏ tạp chất thô xơ dừa, mụn dừa, cơm dừa Trong trình lên men, vi khuẩn Acetobacter xylinum chủ yếu biến đổi đường glucose thành cellulose, nên hạn chế thành phần khác để tránh gây tạp nhiễm Để lọc nước dừa già cần thùng chứa lớn có gắn bơm, có cửa đỉnh để bơm nước dừa già vào bồn lọc, cửa đáy để tháo dịch lọc sang thiết bị trùng, có trang bị lớp lưới lọc để loại bỏ tạp chất Khi lọc dùng áp suất đẩy dung dịch qua màng lọc, phần cặn giữ lại màng lọc, phần nước dưa qua màng lọc, gọi dịch lọc (3) Qúa trình bổ sung dinh dưỡng Dinh dưỡng nước dừa già chưa cân đối cho trình lên men, cần bổ sung nguồn nitơ, cacbon vào dịch lọc thiết bị khử trùng Dinh dưỡng bổ sung bao gồm: 8g (NH4)2SO4, g (NH4)2HPO4 20g saccharose 1000ml nước dừa già (4) Qúa trình tiệt trùng, làm nguội Tiệt trùng dịch lọc 10-15 phút thiết bị gia nhiệt nhằm tiêu diệt vi sinh vật khơng cần thiết cho q trình lên men, bao gồm vi sinh vật gây bệnh; bất hoạt số enzyme Tuy nhiên trình tiệt trùng, số thành phần hóa học bị biến đổi vitamin 14 Sau tiệt trùng, cần đưa dung dịch 28 – 30 ℃, pH < có thể, nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Acetobacter xilynum hoạt động (5) Chỉnh pH Vi khuẩn Acetobacter xilynum ưa pH acid (pH = 3.5 - 4.5), khoảng pH số vi sinh vật hoại sinh khác khơng phát triển Trong q trình chỉnh pH lượng acid tính tốn sẵn, kiểm tra pH qua đầu dị pH (6) Qúa trình lên men Qúa trình lên men hiếu khí vi khuẩn Acetobacter xilynum môi trường nước dừa già bổ sung dinh dưỡng nhằm thu sản phẩm trao đổi bậc celllulose Lên men thạch dừa khay trình lên men tĩnh Trong trình lên men xảy nhiều trình biến đổi: - Sinh học: tăng nhanh số lượng tế bào vi khuẩn hoạt động trao đổi chất nhằm tạo sản phẩm ngoại bào - Lý học: trình tỏa nhiệt trình trao đổi chất vi khuẩn - Hóa lý: Sự tạo thành bao nhầy quanh vi sinh vật, bên chứa sợi cenlulose - Hóa sinh: trình biến đổi quan trọng trình lên men Quan trọng trình vi khuẩn Acetobacter xilynum chuyển hóa saccharose thành cenlulose, sử dụng glucose biến đổi tạo thành cenlulose theo đường sau: 15 Hình 3.1: Con đường chuyển hóa glucose thành cellulose nhờ vi khuẩn Acetobacter xylinum Tóm tắt chế tạo thành thạch sau [5]: Vì nước dừa già có chứa đường saccharose, vi khuẩn A xylinum tiết enzyme invertase để thủy phân đường saccharose thành đường glucose fructose Sau vi khuẩn tiếp tục tiết enzyme isomerase để thực phản ứng đồng phân hóa, chuyển hóa fructose thành glucose Song song với đó, vi khuẩn tiết chất nhầy bao bọc xung quanh chúng, đồng thời hấp thụ glucose thực q trình chuyển hóa glucose thành Glucose-6-photphate tác dung enzyme Glucokinase; sau Glucose-6photphate tác dụng enzyme phosphoglucomutase chuyển hóa thành Glucose-1-photphate; Glucose-1-photphate tiếp tục chuyển hóa thành UDP-glucose tác dụng enzyme UDP-glucose cyrophospholyase, cuối UDP-Glucose polime hóa chuyển hóa thành sợi cellulose nhờ enzyme cellulose synthase bao nhầy sợi xuất khỏi tế bào vi khuẩn liên kết với tạo thành khối gel lên bề mặt môi trường nuôi cấy 16 17 Trong q trình lên men, pH có thay đổi Axetobacter xylinum vi khuẩn ưa acid nhẹ, lên men, pH điều chỉnh 3.5 - acid axetic 40% Trong khoảng ngày đầu lên men pH tăng nhẹ, sau giảm dần đến ngày thứ 10 đạt giá trị Các q trình đồng hóa, dị hóa vi khuẩn sinh số sản phẩm trung gian acid hữu acid dicacbixylic không bay hơi, ketoacid carboxylic bay hơi; đơi có acid fomic (7) Cắt nhỏ Sau lên men miếng thạch thô tiếp tục chuyển sang phịng vơ trùng để tiếp tục cắt nhỏ miếng thạch hơn, miếng thạch có kích thước 1*1.5*2.5 cm (8) Ngâm Na2CO3 3.5 %, 15 phút Sau lên men cò dư acid axetic điều chỉnh pH gây mùi vị khơng ngon, cần ngâm Na2CO3 3.5 %, 15 phút khay đựng thạch dừa thơ Sau đem thạch rửa với nước lạnh Phản ứng trung hòa acid axetic: CH3COOH + Na2CO3 => CH3COONa + CO2 + H2O (9) Qúa trình xả nước lạnh Xả nước lạnh nhằm loại bỏ hết hóa chất cịn sót lại dính thạch dừa thơ Thạch dừa thơ đưa lên băng chuyền xả nước thông qua hệ thống ống phun liên tục (10) Qúa trình đun sơi 18 Sau xả nước lạnh, thạch dừa thơ đun nóng nồi gia nhiệt để miếng thạch hơn, miếng thạch lúc khơng có hương vị Trong giai đoạn người ta thường bổ sung số chất tạo dai CMC để cấu trúc miếng thạch chúng liên kết bó sợi cellulose vào (11) Qúa trình ngâm đường Thạch dừa thơ trong, không mùi, nhiên không vị nên cần ngâm đường 70 80% bồn ngâm có gia nhiệt 60 - 70℃, pH < để đường khuyếch tán, ngấm vào sâu miếng thạch làm tăng vị sản phẩm (12) Bổ sung hương vị Thạch sau ngâm đường bổ sung số hương vị để hồn thiện sản phẩm (13) Đóng gói Thạch dừa đóng gói túi nhựa hộp nhựa (14) Thanh trùng Sau đóng gói tiến hành trùng hệ thống trùng tunnel nhiệt độ 60 - 70℃, pH < 20 - 30 phút nhằm tiêu diệt vi sinh vật bất lợi, sau chúng làm nguội hệ thống (15) Dán nhãn sản phẩm Sau hồn tất q trình sản xuất, thạch dừa dán nhãn để hoàn thiện sản phẩm trước đưa thị trường 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Ảnh hưởng (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 Tỷ lệ dinh dưỡng môi trường nuôi cấy có ý nghĩa định đến sinh trưởng của vi sinh vật (NH 4)2SO4, (NH4)2HPO4 bổ sung vào môi trường lên men thạch dừa nhằm cung cấp nito, photpho cho vi khuẩn Acetorbacter xilynum Nitơ, photpho tham gia cấu trúc acid nucleic, photpholipid, ATP, ADP, NADP, số vitamin…và tham gia cấu trúc hemicellulose Nếu bổ sung (NH 4)2HSO4 không cân đối ảnh hưởng đến kết tạo thành hemicellulose vi khuẩn Acetorbacter xilynum 19 Bảng 3.1: Ảnh hưởng (NH4)2HSO4 đến hình thành thạch dừa [5] Nồng độ (NH4)2HSO4 (%) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Khối lượng thạch dừa thơ trung bình từ 400ml mơi trường sau 15 ngày (g) 111 128.7 135.5 148.65 1168.2 210.35 178.9 174.85 170.45 163.9 150.4 Ảnh hưởng loại đường Trạng thái thạch dừa chịu ảnh hưởng nhiều đường Acetobacter sử dụng loại đường glucose, sucrose, lactose, maltose, galactose Việc sử dụng loại đường khác làm nguyên liệu sản xuất cho thạch dừa có trạng thái khác Việc sử sử nguyên liệu đường glucose cho khối lượng thạch dừa cao nhất, trạng thái thạch dừa thu tốt Tuy nhiên thực tế sản xuất người ta sử dụng sacrose giá thành rẻ, suất cao Bảng 3.2: Ảnh hưởng đường đến hình thành thạch dừa pH=5 [5] Đường Độ dày-Trạng thái Glucose Saccharose Lactose Maltose Dextrin Galactose Không bổ sung đường Dày,chắc Dày, Màng mỏng, mềm Màng mỏng, mềm Màng mỏng, mềm Màng mỏng, mềm Màng mỏng, mềm Khối lượng thạch dừa sau 15 ngày lên men (g) 198.5 193.79 84.5 86.35 81.2 50.45 50 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH: Nhiệt độ tối ưu thích hợp cho lên men thạch dừa 28 - 32 ℃, pH < nhiệt độ 35 ℃, pH < 15℃, pH < khơng có khả tạo thạch dừa pH ảnh hưởng đến suất 20