Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp " PHƯƠNG PHÁP DÙNG QUE THỬ NHANH ĐỂ PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN CORONAVIRUS " docx

1 PHƯƠNG PHÁP DÙNG QUE THỬ NHANH ĐỂ PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN CORONAVIRUS I. Nguyên lý của phản ứng: Thực chất đây là phương pháp miễn dịch sắc ký được phủ với kháng thể đơn dòng đặc hiệu đối với Coronavirus và thuốc thử được có màu cũng được gắn với kháng thể đặc hiệu với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với Coronavirus. Có 2 vùng: vùng thử và vùng đối chứng ở trên bề mặt của que thử . Vạch đầu tiên (vạch T) sẽ được hình thành nhanh chóng khi các tiểu phần Coronavirus có mặt ở trong mẫu. Nếu không có virus, vạch T cũng sẽ không hình thành ở vùng thử. Vạch đối chứng (vạch C) sẽ luôn luôn xuất hiện cho dù có virus hay không và được coi như là đối chứng trong về chất lượng của hệ thống thử. II. Các nguyên liệu có trong bộ kit: - Que thử: 1 lọ có nắp đậy có chứa các que thử đã được làm khô - Có 10 lọ để thu thậ p mẫu, mỗi lọ có chứa 2.5 ml dung dịch pha loãng - 1 bản hướng dẫn III. Các nguyên liệu không đi kèm với bộ kit: - Găng tay - Que gỗ IV. Bảo quản: Bộ kit đã được chế tạo có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng (10-25oC). Không được làm đông lạnh và tránh để ở nhiệt độ trên 30oC. Thời gian bảo quản có thể được tới 18 tháng nếu lọ có chứa các que thử chư a được mở nắp (có thể xem số lô sản xuất và hạn sử dụng được in trên vỏ hộp). Để đảm bảo độ bền của thuốc thử, chú ý nên đóng nắp của hộp đựng các que thử ngay lập tức sau khi đã lấy đủ các que thử theo yêu cầu). Độ bền của que thử chỉ được đảm bảo trong vòng 1 tháng kể từ khi lọ chứa que thử được mở ra. V. Chú ý: 1. Bộ kit này chỉ được dùng cho các chẩn đoán In vitro 2. Bộ kit này chỉ được dùng cho những người đã có kinh nghiệm 3. Không nên hút thuốc, ăn hoặc uống ở gần nơi mẫu hoặc các chất thử của bộ kit được cất giữ 4. Những người trực tiếp tiến hành xét nghiệm nên mặc các quần áo bảo hộ như áo blue và đeo găng tay khi thu thập và tiến hành xét nghiệm, sau đó tay phải đượ c rửa thật kỹ 2 5. Tất cả các chất bị rơi vãi ra đều phải được lau thật kỹ với sodium hypochlorite (0.5%), cồn (70%) hoặc chất sát trùng iodophor 6. Xử lý tất cả các nguyên vật liệu dùng cho xét nghiệm nếu chúng cũng bị lây nhiễm. Tiêu độc tất cả các mẫu và các nguyên liệu nếu chúng bị tạp nhiễm. Phương pháp nên dùng là hấp ở 121oC trong 60 phút hoặc là thiêu huỷ 7. Không nên trộn lẫn các thuốc thủ hoặc các thành phần từ các lô kit khác nhau. Không sử dụng các bộ kit đã quá hạn. VI. Quy trình: 1. Tiến hành lẫy mẫu phân từ trực tràng của bê hoặc lợn. Nếu mẫu phân ở dạng lỏng, tiến hành lấy khoảng 1 thìa đầy (ảnh 1) và tiến hành pha loãng với dung dịch có chứa trong lọ (ảnh 2) 2. Khuấy, lắc kỹ cho tan 3. Nếu mẫu phân dạng rắn (ảnh 3), tiến hành lấy 1 chút bằng que gỗ hoặc các dụng cụ sạch khác (ảnh 4) 4. Nhúng que thử vào trong dung dịch với đầu m ũi tên chúc xuống dưới 5. Đợi khảng 10 phút và đọc kết quả, dựa vào hình ảnh 6 VII. Cách đọc kết quả: 1. Dương tính: Cả vạch C và vạch T đều hiển thị, chứng tỏ sự có mặt của Coronavirus ở trong mẫu phân. Khi nồng độ kháng nguyên rất thấp, đường T có thể được quan sát thấy như 1 cái bóng màu hồng 2. âm tính: chỉ quan sát thấy 1 đường, đó là đường C, và đường T không thấy được hình thành trên que thử, chứng t ỏ coronavirus không có mặt trong mẫu phân và phản ứng là âm tính 3. Nếu đường C không thấy xuất hiện trong vòng 5-10 phút thì phản ứng không được tính và nên làm lại bằng 1 bộ kit mới. 3 PHƯƠNG PHÁP ELISA CHẨN ĐOÁN KHÁNG NGUYÊN ROTAVIRUS, CORONAVIRUS VÀ E. COLI K99 Ở PHÂN BÊ NGHÉ, LỢN I. Nguyên lý của phản ứng: - Các giếng của đĩa nhựa 96 giếng được phủ hỗn hợp của 3 loại kháng thể khác nhau: kháng thể kháng Rotavirus (protein VP7), kháng thể kháng Coronavirus (protein E2-gp90) và kháng thể kháng E. Coli (yếu tố bám dính K99). Các kháng thể này đảm bảo cho việc phát hiện các tác nhân gây bệnh tương ứng từ phân. - Mẫu phân được pha loãng bằng dung dịch đệm pha loãng (Dilution Buffer) và được ủ trên đĩa nhựa. - Sau bướ c rửa, conjugate được thêm vào các giếng tương ứng. Các conjugate này là các kháng thể đơn dòng được gắn men peroxidase, đặc hiệu với từng loại tác nhân gây bệnh nhất định. - Sau bước rửa tiếp theo, cơ chất enzyme (TMB) được thêm vào các giếng. Trong trường hợp có một hoặc một vài tác nhân gây bệnh cần tìm trong mẫu thì các conjugate tương ứng còn lại được cố định ở các giếng tương ứng và enzyme xúc tác cho sự biến đổi của các sắc tố không màu thành s ản phẩm có màu xanh. Các mẫu đối chứng âm và đối chứng dương được tiến hành kèm theo để dễ dàng đánh giá kết quả của phản ứng đạt được. Kết quả có thể đọc được bằng mắt thường. Sự xuất hiện màu sẫm hơn ở các giếng phản ứng so với giếng đối chứng âm chứng tỏ sự có mặt của tác nhân gây bệnh trong mẫu đượ c phân tích. II. Những lưu ý khi sử dụng: - Phản ứng này chỉ có thể được sử dụng cho chẩn đoán trong phòng thí nghiệm và chỉ được dùng trong thú y. - Các hoá chất thử phải được giữ ở 5 0 C (±3 0 C). Các hoá chất thử không thể được đảm bảo nếu quá hạn bảo quản hoặc nếu chúng không được giữ trong đúng điều kiện bảo quản. III. Cách tiến hành phản ứng: 1. Pha loãng mẫu đối chứng và mẫu phân theo tỷ lệ 1/2 trong dung dịch đệm pha loãng (Dilution buffer 8) theo trình tự như sau: (Tuỳ theo trạng thái phân mà có thể pha loãng mẫu phân bằng dung dịch đệm pha loãng (Dilution Buffer 8) thành 1/4 hoặc thậm chí tới 1/10): Nhỏ: - 50µl dung dịch đệm pha loãng (Dilution Buffer 8) vào mỗi giếng - 50µl mẫu đối chứng dương (nguyên chất) vào giếng A1 - 50µl mẫu đối chứng âm (nguyên chất) vào giếng B1 - 50µl mẫu phân cần phân tích (nguyên chất) vào mỗi giếng còn lại (xem hình vẽ 1a và 1b) 4 - Việc phân bố mẫu trên đĩa phản ứng phụ thuộc vào nghiên cứu được tiến hành và số mẫu cần kiểm tra. Ví dụ: Trường hợp 1: Tìm trong mỗi mẫu cả 3 chỉ tiêu: Rotavirus, Coronavirus và E. coli K99 A + + + 7 7 7 B - - - 8 8 8 C 1 1 1 D 2 2 2 E 3 3 3 F 4 4 4 G 5 5 5 H 6 6 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Trường hợp 2: Chỉ kiểm tra một chỉ tiêu ở các mẫu A + 7 B - 8 C 1 D 2 E 3 F 4 G 5 H 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2. Phủ kín đĩa và ủ ở 21 0 C (±5 0 C) trong 30 phút (±3 phút). 3. Rửa các giếng trong đĩa 3 lần bằng dung dịch rửa (Wash Solution), trong quá trình rửa tránh hình thành bọt trong các giếng. Sau mỗi lần rửa đều đổ hết dung dịch rửa đi và vẩy khô hoặc đập vào 1 cái khăn lau khô. - Cách pha dung dịch rửa: Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc (Concentration X20 Wash Solution) theo tỷ lệ 1/20 với nước cất. 4. Nhỏ vào mỗi giếng 100µl conjugate tương ứng theo chỉ tiêu định kiểm tra. Ví dụ: + = ĐC dương - = ĐC âm 1 = mẫu số 1 2 = mẫu số 2 3 = mẫu số 3 4 = mẫu số 4 5 = mẫu số 5 6 = + = ĐC dương - = ĐC âm 1 = mẫu số 1 2 = mẫu số 2 3 = mẫu số 3 4 = mẫu số 4 5 = mẫu số 5 6 = 5 Trường hợp 1: Tìm trong mỗi mẫu cả 3 chỉ tiêu: Rotavirus, Coronavirus và E. coli K99 A R C K R C K B R C K R C K C R C K D R C K E R C K F R C K G R C K H R C K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Trường hợp 2: Chỉ kiểm tra một chỉ tiêu ở các mẫu (VD: Rotavirus) A R R R B R R R C R R R D R R R E R R R F R R R G R R R H R R R 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5. Phủ kín đĩa và ủ ở 21 0 C (±5 0 C) trong 30 phút (±3 phút). 6. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa. 7. Thêm 100µl dung dịch Revelation Solution 5 vào mỗi giếng. 8. Phủ kín đĩa và ủ trong 10 phút ở 21 0 C (±5 0 C), tránh ánh sáng. 9. Đọc kết quả: - Kết quả được xem là đáng tin cậy nếu: + Giếng đối chứng dương có màu xanh rõ ràng + Giếng đối chứng âm không có màu hoặc có màu xanh nhạt - Đánh giá kết quả: + Mẫu được xem là dương tính nếu xuất hiện màu xanh đậm hơn màu ở giếng đối chứng âm + Mẫu được xem là âm tính nếu có màu nhạt hơn hoặc tương đương màu của mẫu đối chứng âm. R= conjugate kháng Rotavirus C= conjugate kháng Coronavirus K= conjugate kháng E. coli K99 R= conjugate kháng Rotavirus 6 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN TRỨNG CẦU TRÙNG (Coccidial Occysts) TRONG PHÂN CỦA TRÂU, BÒ, LỢN I. Cơ sở khoa học: Coccidia là những ký sinh trùng đơn bào ký sinh nội bào bắt buộc. Loài duy nhất gây bệnh đáng kể ở lợn con theo mẹ là Isospora suis. Tuy nhiên việc phân tích phân có thể không tìm thấy trứng, thậm chí cả trong thời kỳ ỉa chảy nặng. II. Nguyên liệu – dụng cụ: - Buồng đếm trứng giun Whitlock - Nước muối sinh lý vô trùng - Pippet nhựa - Kính hiển vi - Dung dịch đường bão hoà Sheathers* III. Phương pháp tiến hành: 1. Lấy một lượng nhỏ phân cho vào 400µl nước muối sinh lý trong ống eppendorf 2. Thêm 1µl dung dịch đường bão hoà Sheathers 3. Trộn đều lượng có trong ống eppendorf 4. Để lắng 5. Hút chuyển 500µl dịch nổi vào buồng đếm trứng giun Whitlock 6. Kiểm tra trứng và mỡ phân ở vật kính có độ phóng đại 100 lần * Cách chuẩn bị dung dịch đường bão hoà Sheathers: Đường: 454 gm Nước cất: 355 ml Đun sôi 1 phút. Để nguội và thêm 6 ml dung dịch formaldehyde 40% ** Dung dịch formadehyde 40% Pha loãng 40 ml dung dịch 37% formaldehyde (nguyên chất) vào 60 ml nước cất. 7 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN TRỨNG CRYPTOSPORIDIUM TRONG MẪU PHÂN I. Cơ sở khoa học: Cryptosporidiosis được gây ra bởi các ký sinh trùng đơn bào thuộc giống Cryptosporidium và có thể nhiễm vào đường hô hấp hoặc tiêu hoá của nhiều loài động vật có xương sống. Cryptosporidium gây ra sự nhiễm trùng cấp tính hoặc nhiễm trùng có giới hạn không xuất hiện triệu chứng ở động vật trưởng thành và người có khả năng miễn dịch, nhưng ở gia súc non đặc biệ t là loài nhai lại có thể gây tử vong. II. Phương pháp tiến hành: 1. Chuẩn bị mẫu: - Đánh dấu mẫu trên phiến kính - Dùng tăm bông phết một lượng nhỏ phân lên phiến kính - Để tiêu bản khô tự nhiên - Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn 2. Cách nhuộm: - Đặt tiêu bản vào bồn chứa dung dịch Carbol fuschin đặc trong ít nhất 30 phút - Rửa kỹ dưới vòi nước chảy - Khử màu bằng acid alcohol 3% cho tới khi tiêu b ản có màu hồng nhạt (khoảng 10 giây) - Rửa dưới vòi nước - Nhuộm bằng dung dịch methylene blue (10 giây) - Rửa dưới vòi nước - Để khô tự nhiên 3. Đọc kết quả: - Dùng một lamen phủ lên phần tiêu bản đã khô và xem dưới vật kính X10 - Loài Cryptosporidium nhiễm vào lớp tế bào rìa bàn chải của tế bào biểu mô ruột. Trứng của Cryptosporidium rất nhỏ (4-5um) và bắt màu đỏ.Trên tiêu bản chúng luôn luôn có dạng tròn, bắt màu hồng sáng trên nền xanh. . 1 PHƯƠNG PHÁP DÙNG QUE THỬ NHANH ĐỂ PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN CORONAVIRUS I. Nguyên lý của phản ứng: Thực chất đây là phương pháp miễn dịch sắc ký được phủ với kháng thể đơn dòng. hợp của 3 loại kháng thể khác nhau: kháng thể kháng Rotavirus (protein VP7), kháng thể kháng Coronavirus (protein E2-gp90) và kháng thể kháng E. Coli (yếu tố bám dính K99). Các kháng thể này. với Coronavirus và thuốc thử được có màu cũng được gắn với kháng thể đặc hiệu với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với Coronavirus. Có 2 vùng: vùng thử và vùng đối chứng ở trên bề mặt của que thử .