Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp " DỊCH TẢ HEO PHÁT TRIỂN VẮC XIN DỊCH TẢ HEO MỚI " MS7 pptx

Bộ Nông nghiệp và PTNT Chính phủ Úc AusAID 014/07VIE DỊCH TẢ HEO PHÁT TRIỂN VẮC XIN DỊCH TẢ HEO MỚI MS7: BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT Chris Morrissy 1 1. Thông tin về cơ quan nghiên cứu Tên dự án Bệnh DTH (CSF): Phát triển vắc xin DTH mới [Mã chương trình: 014/07 VIE] Cơ quan tại Việt Nam Trung tâm nghiên cứu (thuộc Công ty Thuốc Thú y TW- NAVETCO) Trưởng chương trình phía Việt Nam TS. Trẩn Xuân Hạnh Cơ quan Úc Phòng Thí nghiệm Thú y Úc (AAHL) PMB 24, Geelong, VIC 3220, Úc Cán bộ Úc Chris Morrissy Ngày bắt đầu 03/01/2008 Ngày kết thúc (ban đầu) 03/01/2010 Ngày kết thúc (chỉnh sửa) Giai đoạn báo cáo Cơ quan liên hệ Tại Úc: Trưởng chương trình Tên Chris Morrissy Điện thoại: + 61 3 5227 5000 Vị trí Chuyên viên vi rút, AAHL Fax: + 61 3 5227 5555 Cơ quan AAHL, PMB 24, Geelong, VIC 3220, Úc Email: chris.morrissy@csiro.au Tại Úc: Cơ quan điều hành Tên Chris Morrissy Điện thoại: + 61 3 5227 5000 Vị trí Cán bộ quản lý Fax: + 61 3 5227 5555 Cơ quan AAHL, PMB 24, Geelong, VIC 3220, Úc Email: chris.morrissy@csiro.au Tại Việt Nam: Tên TS. Trần Xuân Hạnh Điện thoại: + 84 8 8225955 Vị trí Phó Tổng Giám đốc công ty Thuốc Thú y TW [NAVETCO] Fax: + 84 8 8225060 Cơ quan NAVETCO 29 Nguyễn Đình Chiểu, Q.1, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Email: tranxuananh2002@yahoo.com 2 2. Tóm tắt dự án Việc tiêm phòng để phòng ngừa bệnh DTH là một biện pháp chung của người chăn nuôi heo ở Việt Nam, tuy nhiên bệnh DTH vẫn còn là nguyên nhân gây nhiều thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi heo cả ở mức độ chăn nuôi tập chung và chăn nuôi cá thể. Hiện nay việc sản xuất vắc xin DTH tại Việt Nam dựa vào việc gây bệnh thực nghiệm trên động vật thí nghiệm và đây là nguyên nhân dẫn đến sự thiếu ổn định trong sản xuất vác xin và khó kiểm soát chất lượng của vác xin khi sản xuất bằng phương pháp này. Dự án tập trung phát triển vắc xin DTH thích ứng trên tế bào nhằm mục đích tăng khả năng cung cấp và đảm bảo chất lượng vắc xin sản xuất trong nước. Hơn nữa, vì có ảnh hưởng đến kinh tế và xã hội nên việc cần thiết phải xây dựng những qui trình tiêm chủng vác xin phù hợp với những điều kiện riêng của Việt Nam và như vậy sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phòng chống bệnh DTH ở Việt Nam. Mục đích chính của chương trình: 1. Phát triển vắc xin DTH trên tế bào cho phép sản xuất vắc xin giá rẻ với chất lượng cao. 2. Nâng cao khả năng chẩn đoán bệnh của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam để tăng cường kiểm soát bệnh DTH. 3. Góp phần giáo dục và đào tạo thú y viên, chủ trại chăn nuôi quy mô nhỏ biết cách sử dụng hiệu quả vắc xin DTH trên tế bào. Việc thực hiện thành công các mục tiêu của dự án sẽ nâng cao khả năng kiểm soát bệnh DTH tại Việt Nam, đem lại lợi ích thiết thực đặc biệt cho ngành chăn nuôi heo công nghiệp và hộ gia đình. 3. Tóm tắt quá trình thực hiện Vắc xin DTH nhược độc chủng C được dùng để kiểm sóat và phòng ngừa bệnh DTH trên tòan thế giới. Tại Việt Nam, vắc xin DTH chủng C được sản xuất theo phương pháp dùng thú thí nghiệm [thỏ và bê] và điều này gặp những khó khắn về cung cấp số lượng động vật cho sản xuất hoặc động vật được cung cấp không đảm bảo chất lượng. Đây là nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt chất lượng giữa các lô vắc xin, khả năng cung cấp vắc xin hạn chế và đó là những khó khăn liên quan đến việc sản xuất vác xin theo phương pháp truyền thống.Việc thực hiện thành công hướng nuôi cấy tế bào sẽ tránh được những yêu cầu phải chuẩn độ vi rút vác xin trên thú (in vivo) và tránh được nhiễm những tác nhân ngoại lai trong vác xin. Trong Báo cáo Giai đoạn này, chúng tôi ghi nhận thành công những mục tiêu chính của dự án liên quan đến thích ứng thành công, nuôi cấy và xác định được các đặc tính sinh học của vi rút vác xin DTH chủng C trên môi trường tế bào. Đặc biệt, vi rút DTH nhược độc chủng C hiện nay đang được sản xuất trên thú thí nghiệm đã được thích ứng và nuôi cấy thành công sau nhiều đời cấy chuyển trên môi trường tế bào thận heo dòng PK-15A. 3 Việc thích ứng thành công vi rút vắc xin trên môi trường tế bào liên quan đến sự tăng đồng thời hàm lượng vi rút vắc xin từ 10 2,23 TCID 50 /ml ở lần cấy chuyển thứ 1 tăng lên và ổn định khoảng 10 6,33 TCID 50 /ml ở lần cấy chuyển thứ 12. Điều kiện tối ưu để vi rút vắc xin thích ứng tế bào nhân lên trên môi trường tế bào đã được xác định là 0,02 (MOI) và thu hoạch sẽ được thực hiện sau 72 – 96 giờ gây nhiễm và hiệu giá vi rút trung bình đạt 10 6,0 TCID 50 /ml. Sau khi thích ứng vi rút trên tế bào PK-15A, hàm lượng vi rút vẫn giữ ổn định trong khoảng 10 6,0 TCID 50 /ml và việc thích ứng này có liên quan đến những thay đổi về gen giữa vi rút thích ứng trên tế bào và vi rút gốc thích ứng trên động vật. Đặc biệt, việc thích ứng thành công trên tế bào PK-15A liên hệ với giảm độ đồng nhất trình tự nucleotide gen E2, với sự đồng nhất là 99,5% so với vi rút gốc. Như đã theo dõi qua quá trình chuẩn độ vi rút, tính ổn định về di truyền được xác định từ đời tiếp đời thứ 9 đến các đời tiế p đời tiếp theo. Ảnh hưởng của những thay đổi về mặt di truyền của vi rút vác xin DTH sau khi thích ứng trên tế bào PK-15A đã được nghiên cứu thêm liên quan đến những thay đổi có thể xảy ra so với vi rút vác xin gốc về mặt an toàn và hiệu lực của vác xin. Sự so sánh trực tiếp độc lực của giữa vi rút vác xin DTH gốc và vi rút vác xin DTH thích ứng trên tế bào bằng cách kiểm tra trên thỏ cho thấy không có sự khác biệt về độc lực khi theo dõi triệu chứng lâm sàng, nhiễm vi rút huyết và tạo đáp ứng miễn dịch. Thêm vào đó, thử nghiệm được thực hiện ở NAVETCO liên quan đến hiệu lực vắc xin chứng minh khả năng bảo vệ chắc chắn cho heo được tiêm phòng vắc xin DTH sản xuất trên tế bào và không có sự bài xuất hay nhân lên của vi rút độc lực cao sau khi công cường độc cho heo được miễn dịch. 100% heo được tiêm phòng tạo kháng thể tồn tại ít nhất 24 tuần. NAVETCO đã thích ứng thành công vi rút vắc xin DTH chủng C trên tế bào PK-15A và đã sản xuất các lô giống để sản xuất vác xin trên tế bào với qui mô lớn. Vắc xin DTH sản xuất trên tế bào biểu hiện các tính chất sinh học tốt, ổn định sau những đời cấy chuyển và cho kết quả an toàn và hiệu lực khi thử nghiệm trên động vật (heo). Khả năng cung cấp trong tương lai của vắc xin DTH mới trên thị trường sẽ tăng cường kiểm soát bệnh DTH tại Việt Nam. 4. Tiến độ dự án đến nay [liên quan đến báo cáo Giai đoạn 7] Báo cáo kỹ thuật về phát triển vắc xin DTH trên tế bào • Kỹ thuật nuôi cấy tế bào để thích ứng vi rút DTH chủng C Các dòng tế bào bao gồm tế bào thận heo [PK-15A], dịch hoàn heo [ST] và dịch hoàn cừu [LT] được dùng để kiểm tra khả năng nhân lên của vi rút vắc xin DTH chủng C. Các dòng tế bào này được kiểm tra chất lượng tại AAHL và cho thấy không chứa các tác nhân ngoại lai khác như BVDV và PCV. Kiểm tra sơ khởi tại AAHL cho thấy tế bào thận heo dòng PK-15A đã cho vi rút DTH nhân lên tốt hơn so với các dòng còn lại và theo đó dòng tế bào này đã được chọn sử dụng trong tương lai. 4 Tế bào PK-15A đạt chuẩn được AAHL chuyển giao cho NAVETCO và một ngân hàng tế bào PK-15A được thành lập để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo liên quan đến sản xuất vác xin trên tế bào. Do đó, tất cả kết quả thu được liên quan đến quá trình thích ứng và nghiên cứu đặc tính của vi rút vắc xin DTH chủng C trên tế bào đều được ghi nhận sau các lần chuyển giao dòng tế bào PK-15A và thiết lập được ngân hàng tế bào tại NAVETCO. Thêm vào đó, các dòng tế bào và các lô giố ng vi rút sản xuất ra trong quá trình thích ứng vi rút vác xin DTH trên môi trường tế bào PK-15A đã được kiểm tra chất lượng trong hệ thống đảm bảo chất lượng nội bộ đã được công nhận. Điều này cũng nhờ vào hoạt động tập huấn sớm thực hiện bởi AAHL và như vậy cho phép sau đó phát triển thành công khả năng trong việc nuôi cấy tế bào và tăng năng lực chuẩn đoán bệnh DTH c ủa NAVETCO. • Thích ứng vi rút DTH chủng C trên nhiều dòng tế bào Vi rút DTH chủng C hiện đang được sử dụng trong sản xuất vắc xin DTH dùng thú thí nghiệm tại NAVETCO đã được chọn như là giống gốc để thích ứng và phát triển trên môi trường tế bào. Như đã đề cập ở trên, nghiên cứu thăm dò tại AAHL cho thấy tế bào dòng PK-15A thích hợp cho vi rút DTH nhân lên hơn dòng tế bào ST hay LT. Do đó, những cố gắng sau đó ở NAVETCO đã tập trung thực hiện việc thích ứng và nghiên cứu đặc tính của vi rút DTH chủng C trên tế bào dòng PK-15A. Việc thích ứng thành công vi rút DTH chủng C qua các lần cấy chuyển trên tế bào PK- 15A đã được chứng minh rõ ràng sau khi được xác định bằng phản ứng hóa mô miễn dịch đặc hiệu như chỉ ra trong phụ lục 1. Đặc biệt, sự thích ứng thành công qua các lần cấy chuyển trên tế bào PK-15A tại NAVETCO đã kèm theo với sự tăng lên liên tục số lượng vi rút thông qua kết quả chuẩn độ vi rút, từ 10 2,23 TCID 50 /ml ở lần cấy chuyển thứ 1 tăng lên ổn định khoảng 10 6,33 TCID 50 /ml ở lần cấy chuyển thứ 12 trong. Phụ lục 2. • Đặc tính của vi rút DTH chủng C Sau khi thích ứng thành công, đặc tính phát triển, kiểu gen và tính chất sinh học của vi rút DTH chủng C thích ứng tế bào đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu tại NAVETCO xác định nồng độ gây nhiễm thích hợp (MOI) đã thu được khả năng nhân lên tốt nhất của vi rút, như chỉ ra trong phụ lục 3. Kết quả trình bày trong Phụ l ục 3cho thấy MOI bằng 0,02 và thời gian thu hoạch 72-96 hrs sau khi nhiễm vi rút là tốt nhất trong sản xuất vắc xin. Kết quả chuẩn độ vi rút với hiệu giá khoảng 10 6,0 TCID 50 /ml được dùng cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo. Sự thay đổi gen của vi rút vắc xin DTH chủng C đã thích ứng cũng được kiểm tra trong suốt quá trình tiếp đời vi rút trên tế bào PK-15A tại NAVETCO. Vi rút giống gốc chuẩn thích ứng trên thỏ được dùng để đối chứng, kết quả [trình bày trong Phụ lục 4] cho thấy vi rút DTH chủng C thích ứng tế bào có trình tự nucleotide của đọan gen E2 đồng nhất với vi rút DTH chủng C gốc là 99,8 – 99,6 %. Quan sát quá trình thích ứng cho thấy có kèm theo với sự tăng lên đồng thời hàm lượng vi rút [trình bày trong Phụ lục 2 ở trên] và 5 vi rút đã thích ứng ổn định về mặt di truyền từ đời thứ 9 [99,5% độ đồng nhất trình tự nucleotide]. Cơ sở quan trọng dùng vi rút DTH chủng C thích ứng trên tế bào PK 15 A để làm vác xin là tính an tòan và tính hiệu lực được xác định bằng phương pháp công cường độc cho heo sau khi tiêm vác xin sản xuất bằng chủng thích ứng này. Kết quả nghiên cứu của NAVETCO cho thấy heo tiêm vắc xin DTH sản xuất trên tế bào không bài xuất vi rút và vắc xin này có độc lự c giống như vác xin được sản xuất dùng giống gốc (thích ứng trên thỏ) phụ lục 5. Hiệu lực và khả năng tạo kháng thể sau khi tiêm vắc xin DTH sản xuất trên tế bào đã được nghiên cứu. Kết quả thử nghiệm tiến hành tại NAVETCO liên quan đến hiệu lực vắc xin thông qua xác định các chỉ tiêu như: triệu chứng lâm sàng, nhiễm vi rút huyết, bài xuất vi rút và đo hàm lượng kháng thể khi công cường độc cho ở 21 ngày sau khi tiêm vác xin được trình bày trong Phụ lục 6. Ý nghĩa quan trọng là heo tiêm vác xin được bảo hộ hòan tòan sau khi công cường độc với vi rút DTH có độc lực chuẩn và quan sát trên các heo miễn dịch được công độc không thấy có sự nhân lên của vi rút cường độc hoặc bài thải vi rút. Thêm vào nữa, 100% heo được tiêm vắc xin có đáp ứng miễn dịch và miễn dịch được xác định ở ngày thứ 2 sau khi tiêm vác xin sau đó tăng có ý nghĩa và duy trì trong 24 tuần. [Phụ lục 6]. Tóm lại những số liệu thu nhận được chứng minh cơ sở của việc thích ứng thành công và sự ổn định của vi rút DTH chủng C thích ứng nuôi cấy trên tế bào PK 15A. Đặc biệt tính an tòan và hiệu lực của vác xin cũng đã được xác nhận và đây là cơ sở để sử dụng vác xin này. • Quy trình phòng thí nghiệm Báo cáo trước đó cho thấy khả năng thành công và phát triển bền vững của kỹ thuật nuôi cấy tế bào và phù h ợp với đòi hỏi về đảm bảo chất lượng tại NAVETCO. Trong suốt giai đọan thực hiện dự án này, việc nâng cao năng lực kỹ thuật tại NAVETCO đã thực hiện thành công và đã được áp dụng để đánh giá hiệu lực của vác xin DTH hiện có để kiểm tra khả năng thực hiện trong hệ thống đảm bảo chất lượng của họ nhằm tạo thuận lợi cho việc kiểm tra vác xin DTH sản xuất trên tế bào sau này. Đặc biệt, quy trình kiểm tra chất lượng trước đây được dùng để xác định hiệu lực và độ an toàn vắc xin đã được dùng. Ví dụ, đánh giá về an tòan và hiệu lực của vác xin sản xuất trên tế bào, vi rút dùng công độc là vi rút DTH cường độc chuẩn quốc gia. Đây cũng là chủng cường độc dùng để đánh giá vác xin DTH sản xuất dùng động vật. Trong những thí nghiệm tại NAVETCO, heo con 3 tuần tuổi sinh từ nái đã tiêm phòng được dùng. Heo được nuôi tại NAVETCO đến khi hàm lượng kháng thể mẹ truyền xuống thấp và được xác định có huyết thanh âm tính với kháng thể và kháng nguyên DTH heo trước khi được sử dụng để thí nghiệm ở 8 – 10 tuần tuổi. Tất cả các kiểm tra độc lực, an 6 toàn và hiệu lực vắc xin được tiến hành tại NAVETCO và tuân theo các tiêu chuẩn đảm bảo chất lượng tại NAVETCO. Thực hiện thành công tăng cường năng lực của NAVETCO liên quan đến việc sản xuất vác xin DTH với chủng vi rút vác xin DTH thích ứng trên tế bào trong hệ thống đảm bảo chất lượng ở NAVETCO được trình bày ở phụ lục 7.Tài liệu này là trang chính của SOP sản xuất vắc xin trên tế bào đang được thực hiện tại NAVETCO. Thông tin chi tiết liên quan đến các SOP và tài liệu đảm bảo chất lượng để hỗ trợ việc thực hiện các giai đoạn dự án và việc chuyển giao có thể tham khảo tại NAVETCO nếu cần. 5. Kết luận Việc thành công sớm về khả năng cấy chuyển được vi rút nuôi cấy trên tế bào, cũng như tăng cường được khả năng chẩn đóan bệnh DTH ở NAVETCO đã tạo thuận lợi cho việc hòan thành các giai đoạn của dự án. Đặc biệt, NAVETCO đã thích ứng thành công vi rút vắc xin DTH chủng C trên tế bào PK-15A theo tiêu chuẩn đảm bảo chất lượng và đã xác định được đặc tính của vi rút thích ứng này trong điều kiên in vitro và in vivo. Vắc xin sản xuất trên tế bào đạt được hàm lượng khoảng 10 6,0 TCID 50 /ml và các lô giống gốc đã được sản xuất đảm bảo chất lượng và đã kiểm tra đạt các tiêu chuẩn. thêm. Quá trình giải mã gen của vi rút vắc xin thích ứng tế bào cho thấy sự khác biệt nhỏ trình tự nucleotide qua quá trình thích ứng và cấy chuyển trên tế bào PK-15A. Tuy nhiên, không có sự khác biệt khi so sánh độc lực giữa vi rút vắc xin gốc so với vi rút thích ứng trên tế bào khi thử nghiệm trên thỏ. Hơn thế nữa, thử nghiệm được tiến hành tại NAVETCO về hiệu lực cho thấy khả năng bảo vệ hoàn toàn của heo được tiêm vắc xin DTH sản xuất trên tế bào , không có sự nhân lên và bài xuất vi rút cường độc sau khi công cường độc cho heo tiêm vác xin. 100% heo tiêm phòng tạo kháng thể. Vắc xin DTH sản xuất trên tế bào có tính hiệu lực và an toàn Các lô giống đạt chất lượng đã được sản xuất với mục đích để sản xuất vác xin đạt an tòan, hiệu lực khi cần thiế t. . Bộ Nông nghiệp và PTNT Chính phủ Úc AusAID 014/07VIE DỊCH TẢ HEO PHÁT TRIỂN VẮC XIN DỊCH TẢ HEO MỚI MS7: BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT Chris. Báo cáo kỹ thuật về phát triển vắc xin DTH trên tế bào • Kỹ thuật nuôi cấy tế bào để thích ứng vi rút DTH chủng C Các dòng tế bào bao gồm tế bào thận heo [PK-15A], dịch hoàn heo [ST] và dịch. 1 1. Thông tin về cơ quan nghiên cứu Tên dự án Bệnh DTH (CSF): Phát triển vắc xin DTH mới [Mã chương trình: 014/07 VIE] Cơ quan tại Việt Nam Trung tâm nghiên cứu (thuộc Công ty Thuốc