Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở việt nam dựa trên chỉ thị GBSSI

Sự nghèo nàn trong mô tả đánh giá nguồn gen là cản trở chính trong công tác chọn tạo giống.Hiện nay, những tiến bộ di truyền phân tử hỗ trợ đắc lực cho công tác đánh giá tính đa dạng di

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

9 mẫu thực vật đã được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái thuộc loài

Hedera nepalensis được thu thập tại một số tỉnh thuộc vùng núi phía Bắc, với các mẫu được nghiên cứu bởi nhóm tại Viện Dược liệu Thông tin chi tiết về các mẫu thu thập này được trình bày trong Bảng 2.1.

Một mẫu thuộc loài Hedera helix được sử dụng trong nghiên cứu để đối chiếu, lấy từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu: mẫu lá non, sạch đã được sấy khô và bảo quản trong túi silicagel chống ẩm

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu

Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2018 đến ngày 25 tháng 4 năm 2019 tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

TT Ký hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu Tọa độ địa lý

1 H1 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N-103°47'31.76"E

2 H2 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E

3 H3 Trạm cây thuốc Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E

4 H4 Hồ Thầu, Hoàng Su Phì,

5 H5 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

6 H6 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

7 H15 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E

8 H16 Phó Bảng, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E

9 H21 Sủng Là, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E

10 HH Vườn Thực vật Hoa Nam,

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

For DNA extraction, several effective kits and chemicals are available, including the Dneasy Plant Mini kit from Qiagen (Germany) and the GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini kit from Thermo Scientific (USA) Additionally, the CTAB method, including an improved CTAB solution from Merck, is widely used This solution comprises 3% CTAB, Tris (1M, pH 8), EDTA, NaCl, and deionized water, making it a reliable choice for isolating genomic DNA.

8, EDTA, nước khử ion); Isopropanol; Isoamylalcohol; Chloroform; β- mercaptoethanol

Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật PCR bao gồm dNTP mix và Phusion Polymerase từ Thermo Scientific, cùng với cặp mồi tổng hợp từ Phusa Biochem (Việt Nam) Cặp mồi này đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu quốc tế, với trình tự mồi xuôi F là 5’CAC AAC TGT AAG ATC CTT TCA AA 3’ và mồi ngược R là 5’CAT ACG CAT AGC ATG TAA CTG 3’.

Electrophoresis chemicals include Agarose, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA, Affymetrix), and 5X DNA loading dye (Lonza) Essential tools for DNA analysis are the GeneRuler 100bp DNA Ladder and Lambda DNA/HindIII Ladder from Thermo Scientific, along with Tris base from Bio Basic and acetic acid from Merck.

The article highlights essential laboratory equipment, including the Gel Doc It gel imaging system from the USA, the Cleaver Scientific Ltd electrophoresis system from the UK, and the Prime Thermal Cycler PCR machine also from the UK It features the ESCO biosafety cabinet from Singapore, the EBA 21 centrifuge from Hettich Zentrifugen in Germany, and the VELP shaker from Scientifica, Germany Additionally, it mentions the NP80 spectrophotometer from Nanophotometer, Germany, the Fiocchetti flake ice machine from Italy, and various Panasonic incubators and freezers from Japan, including a -30°C deep freezer and a 4°C refrigerator from FRIMED, Japan.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.1

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA can be isolated using four methods: the Mini-CTAB method (Sanghai-Maroof et al., 1984), an improved CTAB method (Elias et al., 2004), the DNeasy Plant Mini Kit from Qiagen (Germany), and the GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit from Thermo Scientific (USA).

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Quy trình DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) thực hiện theo khuyến cáo của hãng

Quy trình CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 20 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 388 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C và bổ sung 12 àL β-mercaptoethanol

Bước 3: Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút trong khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút, cứ 20 phút đảo mẫu một lần

Bước 4: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 200 àL Chloroform:

Isoamylalcohol được sử dụng với tỷ lệ 24:1 về thể tích Hỗn hợp này cần được trộn đều bằng cách đảo ngược ống trong 1 phút và sau đó sử dụng khối ổn nhiệt kết hợp lắc với tốc độ 400 vòng/phút trong 20 phút Cuối cùng, tiến hành ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút.

Bước 6: Hút dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 7: Bổ sung thể tích tương đương Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và 80 àL CTAB 3%

Bước 8: Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 9: Hỳt dịch pha trờn chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 140 àL isopropanol đã làm lạnh ở -20 o C

Bước 10: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 60 phút

Bước 11: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi Bước 12: Bổ sung 0,5mL dung dịch ethanol 70%, búng đều

Bước 13: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút ít nhất 12 giờ

Bước 14: Hũa tan DNA tủa trong 100 àL đệm TE và 2 àL RNase

Quy trình Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 50 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 800 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút (cứ 15 phút đảo mẫu một lần)

Bước 3: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 500 àL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút

Bước 4: Ly tâm lạnh ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 5: Hỳt 500 àL phần dịch bờn trờn và chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 6: Bổ sung 500 àL Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và

Bước 8: Hỳt 500 àL từ từ phần dịch bờn trờn (pha trong) và chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 350 àL isopropanol đó làm lạnh ở -20 o C

Bước 9: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 30 phút

Bước 11: Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút Bước 12: Hũa tan DNA tủa trong 150 àL đệm

Với sự tiến bộ của khoa học, nhiều phương pháp mới đã được phát triển để nâng cao hiệu suất phân lập DNA, bao gồm việc sử dụng các bộ dụng cụ thương mại như DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) Nguyên lý tách DNA tổng số bằng các bộ kit này dựa trên sự thay đổi pH, giúp tăng ái lực của DNA và gắn DNA lên màng silica Quá trình này bao gồm việc ly giải mẫu thực vật, loại bỏ tạp chất, gắn DNA lên màng silica và rửa giải để thu được DNA tinh sạch.

Axit ascorbic, axit diethyldithiocarbamic và 2-mercaptoethanol có khả năng bảo vệ DNA khỏi quá trình oxy hóa và biến tính Để loại bỏ RNA, có thể sử dụng enzyme RNase.

Hình 1.6 Nguyên lí hoạt động màng silica [58]

Hình 1.7 Sơ đồ mô tả quy trình tách chiết DNA sử dụng cột thu silica

Các bước tách chiết DNA sử dụng màng silica cơ bản gồm:

Bước 1 trong quá trình ly giải DNA là phá vỡ thành tế bào thực vật bằng cách sử dụng đệm ly giải và các muối chaotropic Những muối này giúp làm mất tính bền vững của các liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước, từ đó tạo điều kiện cho việc tách DNA ra khỏi tế bào.

Bước 2: Loại bỏ tạp chất: thêm 1 số enzym có khả năng phân hủy protein,

RNASE để loại bỏ RNA

Bước 3 trong quy trình là gắn DNA lên bề mặt hạt silica Quá trình này sử dụng muối hoạt động hoặc cồn để phá vỡ lớp vỏ hydrat hóa xung quanh, cho phép các ion tích điện dương tạo thành cầu nối muối giữa silica tích điện âm và DNA tích điện âm.

Bước 4: Rửa giải là quá trình loại bỏ tạp chất còn sót lại trên màng silica gel và sử dụng ethanol để loại bỏ muối dư Sau khi hoàn thành bước này, chỉ còn DNA gắn trên màng silica gel, và để đảm bảo đã loại bỏ hoàn toàn ethanol, cột sẽ được làm khô bằng ly tâm.

Bước 5: Giải phóng thu hồi DNA: DNA được giải phóng khỏi màng silica bằng cách giải hấp với dung dịch ion thấp, chẳng hạn như TE hoặc nước

Kiểm tra và định lượng DNA

Kiểm tra sự có mặt của DNA được thực hiện thông qua điện di sản phẩm trên gel agarose 1.2% trong 30 phút với hiệu điện thế 100 V Mẫu 4 µL sản phẩm tách được trộn với 1 µL đệm chứa ethidium bromide trong đệm TAE 1X Các băng DNA sẽ được hiện hình khi soi dưới ánh sáng tử ngoại Định lượng nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được thực hiện bằng cách đo chỉ số.

Tỷ lệ OD260/280 đo lường sự hấp thụ quang của DNA ở bước sóng 260 nm so với 280 nm Giá trị OD260/280 lý tưởng cho DNA tinh khiết thường nằm trong khoảng 1.8-2.0, cho thấy quá trình tách chiết DNA đã thành công.

2.4.2 Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Tất cả các phản ứng đều có đối chứng âm và đối chứng dương Phusion DNA polymerase được sử dụng cho phản ứng PCR với khả năng tạo những mẫu dài với độ chính xác và tốc độ cao chỉ với một enzyme duy nhất ngay cả ở những đoạn gen khó nhân dòng nhất Phusion DNA polymerase đem lại hiệu suất cao nhờ hoạt tính nhân dòng chiều 5’- 3’ và đọc sửa

Enzyme DNA polymerase hoạt động theo chiều 3' - 5', cắt mạch DNA từ đầu mút Khi phát hiện cặp base bổ sung không chính xác, enzyme này sẽ đảo ngược chiều và loại bỏ base không khớp Sau khi cắt bỏ base sai, polymerase có khả năng lắp lại base chính xác và tiếp tục quá trình tái bản DNA.

Sản phẩm PCR được kiểm tra chất lượng bằng cách sử dụng gel agarose 1,5% trong đệm TAE Để xác định kích thước sản phẩm, thang chuẩn GeneRuler 100 bp DNA Ladder được áp dụng.

2.4.3 Tinh sạch và giải trình tự Để thu được kết quả giải trỡnh tự chỳng tụi tiến hành thu 20 àL sản phẩm PCR gửi đi hãng First Base (Malaysia) để tinh sạch và giải trình tự Kết quả giải trình tự được hiển thị bằng phần mềm BioEdit version 7.2.6.1, qua đó xác định được kiểu gen của từng mẫu nghiên cứu

Để đọc kết quả giải trình tự, mỗi nucleotit được biểu thị bằng một đỉnh có màu sắc đặc trưng: A (màu xanh lá cây), C (màu xanh da trời), G (màu đen), và T (màu đỏ) Nếu tại vị trí của mỗi nucleotit chỉ có một đỉnh màu xuất hiện, điều này cho thấy mẫu thực vật có kiểu gen đồng hợp tử Ngược lại, nếu có hai đỉnh màu xuất hiện, mẫu thực vật đó có kiểu gen dị hợp tử.

Hình 2.2 Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit

2.4.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen

Sử dụng phần mềm Sequencher 5.4.6 để chỉnh sửa chuỗi nucleotit, loại bỏ các pic nhiễu ở đầu và cuối chuỗi Phân tích phát sinh loài được thực hiện bằng phương pháp Maximum Likelihood trong phần mềm Mega X, với giá trị bootstrap là 1000 lần lặp lại Để phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân, có thể tham khảo các trình tự gen đã được công bố trên Genbank, bao gồm các loài thuộc chi Hedera và hai loài thuộc chi Merrilliopanax.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tách chiết DNA tổng số

Kết quả điện di DNA từ 10 mẫu nghiên cứu cho thấy tất cả các mẫu đều thu hồi thành công DNA tổng số qua 4 quy trình tách chiết DNA tổng số hiện lên với băng rõ nét tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn DNA, cho thấy rằng DNA ít bị đứt gãy trong quá trình thao tác.

Hình 3.1 Kết quả DNA tổng số điện di trên gel agarose 1,2%

Mẫu lá khô H.nepalensis được phân lập DNA bằng các phương pháp khác nhau như Mini-CTAB, CTAB cải tiến, DNeasy Plant Mini Kit và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit Kết quả cho thấy nồng độ DNA tổng số dao động từ 10,5 đến 437,4 ng/μL Phương pháp Mini-CTAB thu hồi DNA cao nhất với nồng độ trung bình 437,4 ng/μL, trong khi phương pháp CTAB cải tiến đạt nồng độ trung bình 237,7 ng/μL Các phương pháp DNeasy và GeneJET chỉ thu hồi nồng độ DNA trung bình lần lượt là 13,7 và 10,6 ng/μL, thấp hơn hơn 20 lần so với các phương pháp CTAB và CTAB cải tiến.

Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

Kết quả đo OD260/280 từ 1,8 đến 2,0 cho thấy DNA thu được có độ tinh sạch cao, trong khi giá trị dưới 1,8 chỉ ra sự hiện diện của protein, tức là độ tinh sạch thấp Nghiên cứu đánh giá độ tinh sạch nồng độ DNA thông qua chỉ số hấp thụ quang OD260/280, với kết quả đảm bảo độ tinh sạch ở cả 4 phương pháp tách chiết Thông tin về nồng độ và chỉ số OD260/280 được trình bày chi tiết trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2 Chỉ số OD 260/280 của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen GBSSI bằng kỹ thuật PCR27 1 Tối ưu quy trình PCR

3.2.1 Tối ưu quy trình PCR

Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Trong phản ứng PCR, nhiệt độ gắn mồi là yếu tố quyết định hiệu suất phản ứng Chúng tôi đã tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong dải từ 48,2 đến 61,6 °C, với hai mẫu đối chứng âm và dương Kết quả điện di cho thấy ở nhiệt độ từ 48,2 đến 59,2 °C, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 700 bp, với băng không đặc hiệu ở 48,2 đến 50,3 °C Nhiệt độ gắn mồi từ 52 đến 57,5 °C cho sản phẩm điện di sáng, đặc hiệu, phù hợp với kích thước lý thuyết (~700 bp) Do đó, khoảng nhiệt độ tối ưu cho phản ứng khuếch đại gen GBSSI là từ 52 °C đến 57,5 °C.

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kí hiệu trên các làn: nhiệt độ gắn mồi ( 0 C); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương

Kết quả tối ưu nồng độ DNA

Nồng độ DNA tối ưu được xác định với các mức 6,25; 12,5; 25; 50; 100; và 200 ng/µL Hình 3.3 minh họa kết quả điện di của sản phẩm tại những nồng độ này Các băng điện di đều rõ ràng và đặc hiệu từ nồng độ 6,25 đến 200 ng/µL, trong đó có hai băng xuất hiện ở nồng độ cao.

Nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng PCR được xác định là 25 ng/µL, trong khi 50 ng/µL được sử dụng cho băng đặc hiệu và sỏng nhất Kết quả cho thấy 25 ng/µL là lựa chọn lý tưởng cho việc tối ưu hóa phản ứng.

Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kớ hiệu trờn cỏc làn: nồng độ DNA (ng/àL); (-): Đối chứng õm; (+): Đối chứng dương

Kết quả tối ưu nồng độ mồi:

Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn 100 bp; Kí hiệu trờn cỏc làn: nồng độ mồi (àM) tương ứng với 3 mẫu; (-): Đối chứng õm

Nồng độ tối ưu của mồi gen GBSSI được xác định là 0,1; 0,3 và 0,9 àM Kết quả điện di sản phẩm cho thấy nồng độ 0,3 àM tạo ra các băng sỏng, đặc hiệu và ổn định nhất Do đó, nồng độ hoạt động tối ưu được chọn là 0,3 àM.

3.2.2 So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình

Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu quy trình chúng tôi tiến hành chạy phản ứng PCR với các thành phần và điều kiện chi tiết trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ hoạt động

(25 àL) Điều kiện (chu trình nhiệt)

Nước khử ion 14,75 *Biến tính đầu: 98 o C – 30 giây

*Giữ sản phẩm ở 4 o C Đệm 5x 1x 5,0 dNTPs 2 mM 0,2 mM 2,5

Hình 3.5 Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% sử dụng DNA tổng số từ quy trình khác nhau Làn M: O Gene Ruler Ladder DNA

31 marker, Làn (-): đối chứng âm Làn H: sản phẩm PCR từ các mẫu có kí hiệu tương ứng

Chúng tôi đã tiến hành PCR gen GBSSI trên 10 mẫu DNA được tách chiết từ 4 quy trình khác nhau Quy trình Mini-CTAB chỉ cho 3/10 mẫu lên băng, bao gồm H3, H4, H21 Trong khi đó, quy trình CTAB cải tiến cho hiệu quả cao hơn với 5/10 mẫu, gồm H2, H3, H4, H6, HH Đặc biệt, DNA từ 2 bộ kit GeneJET Mini Kit và DNeasy Plant Mini Kit cho kết quả tốt nhất với 9/10 mẫu lên băng rõ nét Kết quả cho thấy hiệu quả nhân dòng gen qua PCR từ DNA thu được từ các kit cao hơn so với quy trình Mini-CTAB và CTAB cải tiến.

Độ tương đồng của trình tự gen GBSSI được khuếch đại

Trình tự vùng gen GBSSI đã được xác nhận cho 9/10 mẫu nghiên cứu, với chiều dài khoảng 618 bp Để phân tích đa hình di truyền của gen GBSSI, chúng tôi đã so sánh 9 mẫu nghiên cứu với 15 trình tự của các loài khác trong cùng chi.

Hedera cùng với 2 loài khác thuộc chi Merrilliopanax đã công bố trên Genbank với chiều dài khoảng 560 bp Bảng 3.4

Bảng 3.4 Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên loài/thứ Mã số

Phân loại H.nepalensis và H.sinensis vẫn đang gây tranh cãi, đặc biệt về sự khác biệt di truyền giữa H.helix và H.nepalensis Để giải quyết vấn đề này

32 hiện ở Hình 3.6 Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự

Kết quả phân tích GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu H.nepalensis, H.sinensis và H.helix cho thấy sự tương đồng lên tới 99.7%, chỉ có sự khác biệt ở 8/618 nucleotit Các mẫu được phân chia thành 3 nhóm: nhóm I gồm H1, H2, H4, H5, H6 hoàn toàn giống nhau; nhóm II gồm H3 và HH có 3 nucleotit khác biệt tại vị trí 13, 421 và 603 so với nhóm I; nhóm III bao gồm H16, H21 với 1 vị trí nucleotit khác ở nhóm I tại vị trí 243 và 263.

Hình 3.6 So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotit sai khác (phía trên bên phải) giữa trình tự GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với

9 mẫu thu thập ở Việt Nam có trình tự tương đồng với so với H.nepalensis

Trình tự nucleotit của H.helix và H.sinensis khác biệt rõ rệt so với 9 mẫu nghiên cứu, cho thấy sự sai khác từ 2 đến 5 nucleotit so với các mẫu H1, H2, H4, H5, H6, và 268 nucleotit khác biệt so với mẫu H1 Đặc biệt, H.nepalensis cũng có sự khác biệt 268 nucleotit so với mẫu H1, điều này chỉ ra sự đa dạng di truyền trong các mẫu nghiên cứu.

Kết quả phân tích khoảng cách di truyền cho thấy rằng khoảng cách di truyền giữa các mẫu H.nepalensis ở Việt Nam đối với gen GBSSI không cao Sự khác biệt di truyền lớn nhất được ghi nhận giữa các mẫu H.helix và H.sinensis với giá trị khoảng cách di truyền là 1,91 Hầu như không có sự khác biệt di truyền giữa các mẫu H1, H2, H4, H5, H6, H16, H21 và H.nepalensis.

Chín mẫu bao gồm các loại H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21 và HH đã được nhân dòng và giải trình tự gen GBSSI thành công Phân tích gen cho thấy có sự khác biệt về 8 nucleotit giữa các mẫu trong đoạn gen dài 618 bp.

Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI

Trước khi xây dựng cây phát sinh chủng loại cho GBSSI, mô hình tiến hóa được tính toán bằng phần mềm Mega X Mô hình tối ưu được xác định là mô hình 3 tham số Tamura (T92) với phân phối Gamma, cho kết quả BIC = 7042,115; AICc = 6657,293; -lnL = 3277,457; R = 1.45 Phân tích bootstrap được thực hiện với 1000 lần lấy lại mẫu, với mức độ tin cậy đánh giá như sau: cao (>85%), trung bình (65-85%), và thấp (C), 368 (A=>T) và 269 (A=>C), trong khi loài H3 có năm vị trí khác biệt, bao gồm nucleotit thứ 13, 368, 369, 420 và 603 Những vị trí này có thể là đặc trưng riêng cho loài H.nepalensis ở Việt Nam hoặc liên quan đến sự hình thành thứ loài mới trong khu vực Nghiên cứu của chúng tôi đã đóng góp vào việc bổ sung dữ liệu phân loại cho một số loài thuộc chi này.

Hedera Cụ thể, phân loại được loài H.nepalensis tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc,

Việt Nam có sự hiện diện của nhiều loài như H.algeriensis, H.maroccana, H.caucasigena, H.cypria, H.maderansis, H.pastuchovii, H.azorica, H.canariensis và H.Hibernica Những loài này cho thấy rằng GBSSI là một chỉ thị hữu ích trong việc phân loại các loài.

H.nepalensis với các loài khác trong chi Hedera

Dây thường xuân, có tên khoa học là Hedera nepalensis K Koch, lần đầu tiên được mô tả và đặt tên bởi K Koch trong hệ thống phân loại vào năm 1880.

1853 Năm 1929, tác giả Wien gộp một loài khác là Hedera sinensis vào cùng loài

Hedera nepalensis K Koch được coi là một tên đồng danh của Hedera sinensis, nhưng nghiên cứu của Jun Wen vào năm 2002 đã phân loại loài này thành hai thứ: H.nepalensis var.sinensis và H.nepalensis var.nepalensis Hai thứ này có thể phân biệt qua số lượng thùy lá, với var.nepalensis có 5 thùy và var.sinensis có 3 thùy, cùng với sự khác biệt về số lượng thùy bên Tuy nhiên, một số mẫu của H.nepalensis var.sinensis lại cho thấy sự biến đổi về số lượng thùy lá, dẫn đến sự trùng lặp giữa hai thứ này Để khắc phục khó khăn trong phân loại hình thái, phân tích di truyền là phương pháp hiệu quả Phân tích đa dạng di truyền cho thấy hai thứ loài này khác nhau về mức độ đa dạng, và cây phát sinh chủng loại từ chỉ thị GBSSI chỉ ra rằng H.nepalensis và H.sinensis tách biệt thành hai nhánh với độ tin cậy cao, đặc biệt là nhánh H.nepalensis (99%).

Tiêu đề	Lựa Chọn Quy Trình Tách Chiết DNA Tổng Số Và Bước Đầu Phân Tích Đa Dạng Di Truyền Nguồn Gen Dây Thường Xuân (Hedera Nepalensis K.Koch) Ở Việt Nam Dựa Trên Chỉ Thị GBSSI
Tác giả	Nguyễn Thị Thu Thảo
Người hướng dẫn	PGS.TS. Đinh Đoàn Long, ThS. Phạm Thị Hồng Nhung
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Ngành Dược học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	54
Dung lượng	1,18 MB