Slide 1 Phươngphápnghiêncứudi truyền Bộ môn Sinh học LÝ THUYẾT SINH HỌC VÀ DI TRUYỀN Cử nhân chính quy 2023 TS Trần Khánh Linh Phương pháp nghiên cứu di truyền ◼ Phân tích phả hệ ◼ Áp dụng kiến thức p[.]
Phươngphápnghiêncứudi truyền Bộ mơn Sinh học Cử nhân quy 2023 LÝ THUYẾT SINH HỌC VÀ DI TRUYỀN TS Trần Khánh Linh Phương pháp nghiên cứu di truyền ◼ Phân tích phả hệ ◼ Áp dụng kiến thức phân tích phả hệ vào tư vấn di truyền trường hợp cụ thể ◼ Nghiên cứu sinh đôi ◼ Áp dụng kiến thức PPNC sinh đôi việc đánh giá tác động di truyền môi trường lên tính trạng hay bệnh người Phương pháp nghiên cứu di truyền ◼ Di truyền tế bào ◼ ◼ Hiểu kỹ thuật phổ biến dùng nghiên cứu di truyền tế bào Một số kỹ thuật di truyền phân tử ◼ Hiểu nguyên tắc tách chiết DNA ◼ Hiểu nguyên tắc điện di ◼ Mô tả chu kỳ nhiệt PCR ◼ Phân biệt PCR giải trình tự DNA Nghiên cứu phả hệ ◼ Mục tiêu ◼ Áp dụng kiến thức phân tích phả hệ vào tư vấn di truyền trường hợp cụ thể ◼ Nội dung ◼ Đặc điểm di truyền gen NST thường ◼ Đặc điểm di truyền gen liên kết với NST giới tính ◼ Bài tập phả hệ Các ký hiệu dùng để lập bảng phả hệ Các ký hiệu dùng để lập bảng phả hệ Các ký hiệu dùng để lập bảng phả hệ Di truyền allele trội NST thường ◼ Xuất hai giới với tỉ lệ tương đối ◼ Cả hai giới truyền tính trạng cho hệ ◼ ◼ ◼ Thế hệ cháu mắc bệnh phải bố/mẹ mắc bệnh (trừ cháu có đột biến mới) khơng gián đoạn hệ Nếu bố/mẹ thể bệnh dị hợp tử, người lại khơng mắc bệnh hệ có ½ mắc bệnh ½ khơng mắc bệnh Allele trội gặp nên phần lớn người bệnh thể dị hợp tử Di truyền allele trội NST thường Waardenburg Syndrome Các tính trạng trội nhiễm sắc thể thường ◼ ◼ Bệnh Huntington ◼ Achondroplasia ◼ Brachydactyly Tăng cholesterol máu ◼ Hội chứng đa ngón Brachydactyly Điện di ◼ Quy trình Chuẩn bị gel agarose, polyacrylamide (0.5 – 2%) Chạy điện di gel agarose (đệm TAE TBE; thị màu) Quan sát DNA sau điện di (EtBr, chụp ảnh gel) Điện di ◼ Thuốc nhuộm DNA ▪ Sử dụng để thấy vị trí DNA / gel sau điện di ▪ Ethidium bromide (EtBr) gắn xen base DNA ▪ DNA - EtBr phát huỳnh quang dạng vạch tia UV ▪ EtBr: chất độc gây đột biến mạnh, có độ nhạy giới hạn ▪ Một số loại thuốc nhuộm mới: SYBR® Gold, SYBR® Green, SYBR® Safe, EvaGreen® Điện di ◼ Thang DNA chuẩn ◼ Dùng để ước lượng kích thước định lượng tương đối DNA gel ◼ Là hỗn hợp nhiều trình tự DNA biết kích thước hàm lượng PCR ◼ Nguyên tắc ◼ ◼ ◼ Tạo số lượng DNA cực lớn từ lượng nhỏ phân tử DNA ban đầu dựa chế chép DNA Dựa chu kỳ tăng giảm nhiệt độ phản ứng biến tính DNA chép DNA DNA tạo từ DNA khuôn ban đầu tiếp tục sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử DNA tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền khuếch đại theo cấp số nhân PCR ◼ Thành phần phản ứng PCR ▪ DNA khuôn ▪ Mồi: R/F primer (RNA); Tm; 16-30 ribonu ▪ DNA polymerase: Taq (Thermus aquaticus),… ▪ dNTP: dATP, dTTP, dCTP, dGTP ▪ Dung dịch đệm: Tris-HCl, KCl, Mg2+ … PCR ◼ R/F primer (RNA) ▪ Mồi “xuôi” (forward primer) “ngược” (reverse primer) đặc hiệu ▪ Mồi thường có kích thước từ 16 đến 30 nucleotide ▪ Mồi tính tốn thiết kế nhờ phần mềm chuyên dụng tổng hợp hóa học để gắn vào hai đầu trình tự cần chép ▪ PCR cần quan tâm tính đặc hiệu mồi nhiệt độ nóng chảy (Tm) PCR ◼ Quy trình (3 bước) chu kỳ PCR ▪ Bước 1: Biến tính hay tách mạch DNA (94oC) ▪ Bước 2: Gắn mồi (40–72oC, thường 55oC) ▪ ▪ Nhiệt độ hạ cho mồi oligonucleotide RNA gắn vào mạch khn ▪ DNA polymerase chịu nhiệt bắt đầu có hoạt tính kéo dài mồi Bước 3: Kéo dài mồi (72oC), nhiệt độ tối ưu cho enzyme DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch Hình Sơ đồ mơ tả chu kỳ nhiệt quy trình PCR PCR ◼ Ứng dụng PCR y học di truyền ▪ Phân tích gen bệnh ▪ Phát đột biến điểm ▪ Xác định mức độ biểu gen ▪ Ứng dụng pháp y hình ▪ Ứng dụng chẩn đốn di truyền Giải trình tự ◼ Ngun tắc ◼ Tương tự PCR khác biệt: ◼ ◼ Dùng mồi có đánh dấu phóng xạ 32P (hoặc dNTP) Chuỗi polynucleotide tổng hợp nhờ đoạn Klenow DNA polymerase I khơng có hoạt tính 5’ → 3’ exonuclease ◼ ddNTP (dideoxynucleoside triphosphate) gắn đầu 3’ → dừng tổng hợp ◼ Giải trình tự: điện di gel polyacrylamide Figure 8-50a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Figure 8-50c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Phương pháp nghiên cứu di truyền ◼ Tóm tắt Phả hệ: tư vấn di truyền trường hợp cụ thể Con sinh đôi: đánh giá tác động di truyền môi trường Di truyền tế bào: nguyên tắc, ứng dụng nhuộm băng G Kỹ thuật di truyền phân tử Tách chiết Điện di PCR Giải trình tự QUAY LẠI TRANG MỤC TIÊU Tài liệu tham khảo Phan Thị Phương Thanh, Lê Nguyễn Uyên Chi (2000) Một số phương pháp nghiên cứu di truyền người Nguyễn Thị Hồng Nhung (Chủ biên), Sinh học Di truyền, (tr 339 – 370) Nhà xuất Y học Lodish, Berk, Kaiser et al (2013) Molecular Cell Biology 7th ed, W.H Freeman & Company