TỔNG QUAN
Tổng quan về cây dương đầu
Cây dương đầu Olax imbricata Roxb, thuộc chi Olax trong họ Olacaceae và bộ Santalales, còn được biết đến với các tên gọi như dương đầu kết lợp, cây cát lộ và dây mao trật.
Họ Olacaceae phân bố toàn cầu, chủ yếu ở rừng nhiệt đới, ôn đới ẩm và vùng xavan, bao gồm 25 chi và 250 loài Chi Olax có khoảng 40 loài, chủ yếu ở rừng nhiệt đới châu Á như Trung Quốc, Đông Nam Á (Philippines, Myanmar, Indonesia, Thái Lan, Việt Nam) và một số quốc gia khác như Ấn Độ, Đài Loan, Sri Lanka Ngoài ra, họ này cũng xuất hiện rộng rãi ở nhiều quốc gia châu Phi như Nigeria, Ghana, Zaire, Senegal và một phần ở Nam Phi.
Cây dương đầu O imbricata lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1819 tại Trung tâm đa dạng sinh học tự nhiên Philippines Tại Việt Nam, cây này được tìm thấy đầu tiên ở vùng núi Đakrong, trong khu bảo tồn thiên nhiên Đakrong, tỉnh Quảng Trị O imbricata phân bố rộng rãi từ Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng đến Phú Yên.
Roxb đang được trồng và chăm sóc tại tỉnh Phú Yên [3]
Olax là một chi cây thường xanh, có chiều cao từ 2 đến 6 mét, thường mọc dưới dạng cây bụi đứng hoặc dây leo trong các khu rừng nhiệt đới Cây có thể phát triển thành bụi với chiều cao khoảng 2 cm, thân cây màu nâu và cành non có màu xám hoặc xanh lục Lá cây xếp thành hai dãy đối xứng, có hình dạng trứng hoặc elip thuôn dài, với chiều dài từ 5 đến 10 cm và chiều rộng phù hợp.
2,5 – 3,5 cm với 6 – 9 cặp gân lá đối xứng ở mặt lá [1] Hình ảnh về cây dương đầu được trình bày ở hình 1.1
Lá cây có hai mặt, mặt trên màu lục bóng và mặt dưới màu nhạt, nhám hơn; hình dáng lá bầu dục với cuống tròn Hoa mọc thành chùm nhỏ, lưỡng tính, có ba nhị ở kẽ lá hoặc đầu cành, cánh hoa dài 8 – 10 mm, màu trắng hoặc hơi vàng, với 1 bầu nhụy và vòi nhụy dài 1 cm Cuống hoa xoăn, kích thước 1 – 3 mm, nhụy vàng, thường mọc thành chùm 3 – 7 bông Quả cây hình cầu hoặc dạng trứng ngược, kích thước khoảng 3 - 4 cm, giống quả chanh, với đài hoa nhỏ lớn lên cùng quả và phôi nhỏ có 2 – 4 lá mầm Cây ra hoa từ tháng 4 đến tháng.
10 [1] Hình ảnh các bộ phận của cây dương đầu được trình bảy trong hình 1.2
Rễ cây O imbricata Roxb được sử dụng trong y học, có hình dạng trụ thuôn dần về phía dưới và đôi khi phân nhánh Phần trên của rễ còn sót lại gốc thân, với nhiều sẹo là dấu tích của rễ con, dài từ 5 – 15 cm và đường kính từ 0,7 – 2 cm Bề mặt ngoài của rễ có màu vàng nhạt hoặc vàng nâu nhạt, với nhiều rãnh nhăn theo chiều dọc và vùng xếp ngang Rễ cây có thể chất giòn, mặt bẻ không có xơ, và mặt cắt ngang có màu vàng nhạt, có vân và không có mùi.
Một số nghiên cứu về thành phần hóa học cây dương đầu
Những nghiên cứu về hóa học trên chi Olax chỉ mới được quan tâm trên một số loài như Olax andronensis, Olax glabriflora, Olax puttacorum, Olax phyllanthi, Olax
Hình 1.2 Mặt cắt ngang của gốc rễ cây O imbricata Roxb Hình 1.3 Các bộ phận khác của cây O imbricata Roxb
Gần đây, có thêm nhiều tài liệu nghiên cứu về cây O imbricata và Olax subscorpioidea Các báo cáo khoa học về chi Olax đã chỉ ra sự hiện diện của nhiều nhóm hợp chất quan trọng, bao gồm hợp chất phenolic, flavonoid glycoside, saponin, alkaloid và anthraquinone.
In 2019, Võ Thị Ngà and her research team isolated phenolic compounds, including 1-(3,4-dihydroxyphenyl)-8-(3-hydroxy-4-O-β-D-glucopyranosylphenyl)octan-5-ol-4-one (1), (4E)-1-(3,4-dihydroxyphenyl)-4-(3-hydroxy-4-O-β-D-glucopyranosylphenyl)hept-4-en-6-ol-3-one (2), and 1-O-(4-hydroxy-2,6-dimethoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranose (3).
O-(4-hydroxy-2-methoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β- D - glucopyranose (4); leonuriside A [4] (5); vanillic acid [5] (6) [6]
Riêng về phần hợp chất nhóm flavonoid thì được tìm thấy đặc biệt nhiều trong chi
Chi Olax chứa các hợp chất flavonoid chủ yếu ở lá và trái Năm 2015, Festus B.C Okoye và cộng sự đã nghiên cứu dịch chiết methanol từ lá cây Olax mannii tại Zaria, Nigeria Kết quả cho thấy, qua các phương pháp sắc ký, ba hợp chất mới đã được phân lập, bao gồm kaempferol-3-O-[α-D-apiofuranosyl-(1→2)-α-L-arabinofuranoside]-7-O-α-L-rhamnopyranoside, kaempferol 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinofuranoside]-7-O-α-L-rhamnopyranoside, và kaempferol-3-O-[β-D-arabinopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranoside]-7-O-α-L-rhamnopyranoside.
Vào năm 2016, Festus B.C Okoye và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu từ phân đoạn butanol của dịch chiết methanol lá cây Olax mannii Oliv, trong đó họ đã phân lập được hai hợp chất mới Hai hợp chất này được xác định là kaempferol 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→2) α-L-arabinofuranoside]-7-.
O-α-L-rhamnopyranoside (10) và kaempferol 3-O-[α-L-apiofuranosyl (1→2) β-D- galactopyranoside]-7-O-α- L -rhamnopyranoside (11) [8]
Ngoài ra còn có những nhóm hợp chất flavonoid đã được biết đến trước đó, bao gồm
14 hợp chất, trong đó bao gồm 2 hợp chất kaempferol 3-O-α- L -arabinofuranosyl-7-
O-α-L-rhamnopyranoside (12), kaempferol-3-O-β- D -xylopyranosyl-7-O-α-L- rhamnopyranoside (17) được xác định bởi Kimiko Nakano và các cộng sự vào năm 1983 [9]; 1 hợp chất kaempferol 3,7-O-α- L -dirhamnopyranoside (13) được xác định bởi Yahara và các cộng sự vào năm 2000 [10]; 1 hợp chất kaempferol 3-
(14) được phát hiện bởi Shao và các cộng sự vào năm 2003 [11]; 1 hợp chất quercetin 3,7-O-α- L -dirhamnopyranoside (15) được phát hiện bởi Fang và các cộng sự vào năm 2005 [12]
Vào năm 2011 Halabalaki cùng các cộng sự cũng đã xác định được 5 hợp chất bao gồm kaempferol 7- O-α-L-rhamnopyranoside (16), kaempferol 3- O-α-L- rhamnopyranoside (18), quercetin 3-O-β- D -xylopyranoside (19), morin 3- O-α-L- rhamnopyranoside (20), kaempferol 3- O-β-D-xylopyranoside (21), morin 3- O-β-
D-xylopyranoside (22) Ngoài ra còn 2 hợp chất là kaempferol 3- O-β- D -glucopyr- anoside (23) được xác định bởi Mulinacci với các cộng sự vào năm 1995 [13]; quercetin-3-O-β-galactopyr-anoside (24) được xác định bởi Gudej và các cộng sự vào năm 2003 [14]
Vào năm 2019, Adebayo O Adeoluwa và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về phân đoạn butanol chiết xuất từ lá cây Olax subsorpioidea Kết quả phân tích bằng HPLC cho thấy các thành phần chính trong phân đoạn butanol bao gồm rutin (25) và morin.
Một nhóm khoa học ở Pakistan do Ovais M dẫn đầu đã nghiên cứu chiết xuất methanol từ lá cây Olax nana Phân tích HPLC cho thấy chiết xuất này chứa hàm lượng lớn các dẫn xuất acid hữu cơ, cùng với các hợp chất phenolic như axit vanillic, axit p-hydroxybenzoic, axit caftaric, isovitexin-4-O-glucoside, kaempferol-7-O-glucoside và axit chicoric.
In 1981, researchers Forgacs P and Provost J identified a triterpenoid saponin compound, specifically (3β)-28-(β-D-glucopyranosyloxy)-28-oxoolean-12-en-3-yl-(1→4)-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-glucopyranosiduronic acid This compound was isolated from the methanol extract of the leaves, roots, and bark of the plants Olax andronensis, Olax glabriflora, and Olax puttacorum.
Vào năm 2011, Sule M.I và cộng sự nghiên cứu chiết xuất aceton từ lá cây Olax manni, đã cô lập được 2 hợp chất triterpenoid là glutinol (35) và rhoiptelenol (36) [18]
Vào năm 2019, nhóm nghiên cứu của Võ Thị Ngà đã phát hiện ba hợp chất chứa nhóm dẫn xuất 1,2,3,4-tetrahydronapthalene, đánh dấu lần đầu tiên sự hiện diện của nhóm hợp chất này trong chi Olax Ba hợp chất được phân loại bao gồm (2R)-6-hydroxy-2-(1-hydroxy-1-methyl) ethyl-8-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene (37) và (2R,11S)-(1,2-dihydroxy-1-methyl) ethyl-8-methyl-5-O-β-D-glucopyranosyl-1,2,3,4-tetrahydro-naphthalene (38).
Trong nghiên cứu về việc phân lập chiết xuất methanol, ba hợp chất terpenoid glycoside đã được phân lập thành công, bao gồm 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6′-O-ethyl-β-D-glucuronyl oleanolic acid (40), spergulacin (41) và oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranoside (42).
Hợp chất thuộc nhóm chất tropolone đã được phân lập thành công từ cao methanol của bột rễ cây dương đầu O imbricata Hợp chất này được gọi là (2R)-6-hydroxy-2-(1-hydroxy-1-methyl) ethyl-9-methylbicyclo (5,4,0) undeca-5,8,10(11)-triene-7-one, hay còn được biết đến với tên olaximbrisideA (43).
Năm 2019, nhóm nghiên cứu đã phát hiện ba hợp chất béo mới có chứa liên kết ba, đánh dấu lần đầu tiên phát hiện các hợp chất này trong chi Olax.
Nhóm hợp chất béo được công bố với tên gọi là (E)-henicos-7-en-9-ynoic acid (44);
(E)-henicos-7-en-9-ynoylglycerol (hoặc 2,3-dihydroxypropyl (E)-henicos-7-en-9- ynoate) (45); 7,8,9,10-tetrahydroxyhexadeca-4,10-diynoic acid (46) [21]
Năm 2016, Mavundza và các cộng sự tại Nam Phi đã thành công trong việc phân lập ba acid béo từ cao chiết dichloromethane của vỏ cây Olax dissitiflora, bao gồm santalbic acid, exocarpic acid và octadec-9,11-diynoic acid.
1.2.4 Nhóm alkaloid và các hợp chất có chứa nitrogen
Vào năm 1993, nghiên cứu chiết xuất ethanol từ rễ cây Olax phyllanthi đã phát hiện một hợp chất tự nhiên mới mang tên S-ethenylcysteine (50), một loại amino acid, thông qua các phương pháp phân tích HPLC, GC-MS và NMR.
Hoạt tính sinh học một số chất có trong cây dương đầu
1.3.1 Hoạt tính điều trị bệnh đái tháo đường
Năm 2019, Võ Thị Ngà và các đồng nghiệp đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cây dương đầu O imbricata, liên quan đến khả năng chữa bệnh đái tháo đường Kết quả cho thấy cao chiết n-hexane có giá trị IC50 0.02 µg/mL, trong khi cao chiết ethyl acetate có hoạt tính tốt hơn với giá trị IC50 41.84 µg/mL Cao chiết methanol không cho thấy tiềm năng chữa bệnh, từ đó định hướng sử dụng cây dương đầu trong điều trị đái tháo đường theo kinh nghiệm dân gian.
O imbricata trong y dược học hoặc đưa ra ý tưởng tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học từ phòng thí nghiệm, từ đó định hướng phục vụ công nghiệp dược phẩm [6]
Ngoài ra, những nghiên cứu về cây Olax subscorpioidea được dùng điều trị đái tháo đường và các bệnh nhiễm trùng [27]
1.3.2 Hoạt tính chống ung thư và gây độc tế bào
PGS TS Nguyễn Thị Hoài đã tiến hành nghiên cứu về bộ dữ liệu các cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều, tập trung vào tác dụng chống ung thư Một trong những phát hiện quan trọng là cây dương đầu O imbricata, được ghi nhận có khả năng hỗ trợ trong việc điều trị bệnh ung thư.
Roxb được dùng theo kinh nghiệm người dân tộc Pako dùng lá và cành nhỏ sắc uống chữa khối u ở ngực sưng đau, đau dạ dày [28]
Việc thử nghiệm hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư đã được thực hiện với các chất tinh khiết nhằm tìm kiếm hợp chất tiềm năng chữa bệnh ung thư TS Võ Thị Ngà đã tiến hành thử nghiệm trên ba dòng tế bào ung thư: ung thư vú (MCF7), ung thư gan (HepG2) và ung thư phổi (LU) Kết quả cho thấy cao n-hexane, cao ethyl acetate và cao methanol có tiềm năng gây độc tế bào đối với ung thư vú MCF7 và ung thư phổi LU; trong khi cao n-hexane và cao ethyl acetate cũng cho thấy khả năng gây độc trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 Giá trị IC50 của các mẫu cao được trình bày trong bảng 1.1.
Giá trị IC 50 trên các dòng tế bào (μg/mL)
Ellipticine 0.47±0.02 0.35±0.01 0.40±0.02 Bảng 1.1 Kết quả thử nghiệm trên các loại cao chiết khác nhau
Nghiên cứu về chiết xuất ethanol của Olax subscorpioidea đang được nghiên cứu về hoạt tính chống lại nhiễm độc gan do carbon tetrachloride ở chuột [26]
1.3.3 Hoạt tính chống viêm, kháng khuẩn và kháng oxy hóa
Nghiên cứu của Forgacs P và Provost J (1981) cho thấy chiết xuất methanol từ lá, rễ và vỏ cây của các loài Olax andronensis, Olax glabriflora và Olax puttacorum có tác dụng kháng viêm mạnh mẽ và có khả năng nhuận tràng.
Nghiên cứu chiết xuất methanol từ lá và thân cây Olax psittacorum cho thấy khả năng kháng viêm và giảm đau hiệu quả Bên cạnh đó, các đặc tính chống loét miệng của chiết xuất cũng được so sánh thông qua mô hình in vitro, góp phần làm rõ tiềm năng ứng dụng của loại cây này trong y học.
[29] Ngoài ra, thông qua việc phân tích GC-MS nhận thấy rằng, sự hiện diện của
21 methyl salicylate có hoạt tính chống viêm và giảm đau [30] và phytol ngoài chống viêm còn có hoạt tính chống lại bệnh viêm khớp dạng thấp
Sử dụng chiết xuất lá Olax scandens để tổng hợp vật liệu nano bạc đồng (Ag – Cu
Các nghiên cứu cho thấy rằng các hạt nano kim loại (NCs) có tiềm năng kháng khuẩn vượt trội so với hạt nano bạc đơn, thể hiện hoạt tính chống vi khuẩn cao hơn đáng kể đối với cả các chủng vi sinh nhạy cảm và kháng thuốc Tại miền Tây Châu Phi, vỏ và rễ cây Olax viridis được sử dụng dưới dạng bột để chữa loét, điều trị các bệnh hoa liễu và nhiễm trùng nấm ngoài da Năm 2014, Olusegun A.A và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tác nhân chống nhiễm trùng từ chiết xuất lá cây này.
Olax Subscorpioidea (thử nghiệm trên chuột) bằng phương pháp sắc ký khối phổ LC-
Rễ cây Olax viridis ở miền Bắc Nigeria được sử dụng để điều trị mất ngủ, giải nhiệt, tiêu chảy, đau đầu và sốt Lá cây là phương thuốc cho vết thương, trong khi cành cây giúp chữa đau răng Vỏ cây được dùng để điều trị vết loét và sốt thương hàn Nghiên cứu về dịch chiết methanol từ rễ cây này cho thấy tiềm năng như một loại thuốc giảm đau và có khả năng bảo vệ gan khỏi sự tổn thương.
Chiết xuất methanol từ lá Olax nana đã được phân tích bằng phương pháp HPLC, cho thấy đây là một nguồn chất chống oxy hoá mạnh Ngoài ra, rutin cũng thể hiện khả năng chống oxy hoá và bảo vệ hệ thần kinh Sự hiện diện chủ yếu của các dẫn xuất acid gallic, một polyphenol phổ biến, góp phần vào hiệu quả chống oxy hoá mạnh mẽ của chiết xuất này.
1.3.4 Hoạt tính về những tác nhân thần kinh
Chiết xuất methanol từ lá cây Olax nana đã mở ra cơ hội cho các nghiên cứu sâu hơn về khả năng bảo vệ thần kinh và điều trị nhiều rối loạn khác nhau.
Olax subscorpioidea là một loại cây bụi hoặc cây có nguồn gốc từ Nigeria và các khu vực khác của Châu Phi Năm 2015, cây này đã được công nhận trong việc điều trị các rối loạn viêm, bệnh tâm thần, co giật, đau đớn và ung thư Việc sử dụng Olax subscorpioidea trong y học truyền thống đã thu hút sự chú ý về tiềm năng dược lý của nó.
Olax subscorpioidea có hoạt động chống trầm cảm, cho thấy tiềm năng của cây trong việc quản lý bệnh tâm thần Việc sử dụng Olax subscorpioidea có thể được biện minh trong hoạt động chống trầm cảm, góp phần vào việc kiểm soát các rối loạn tâm lý.
Vào năm 2019, Adebayo O Adeoluwa và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về sự dẫn truyền thần kinh, khám phá tác động chống trầm cảm của dịch chiết butanol từ cây Olax subscorpioidea Nghiên cứu này làm sáng tỏ nguyên tắc hoạt động của các hợp chất sinh học như caffeic acid, rutin, morin và quercetin.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
Đối tượng nghiên cứu
Rễ Dương đầu, có tên khoa học là Olax imbricata Roxb thuộc họ Olacaceae, được thu hái tại huyện Đông Hòa, tỉnh Phú Yên, Việt Nam vào tháng 8 năm 2020.
Xuân Lâm từ Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Dược liệu Hữu cơ Miền Trung, Phú Yên, Việt Nam, đã lưu chiểu mẫu chứng từ UTE – A002 tại Khoa Công nghệ Hóa và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Rễ cây được thu hái, loại bỏ phần sâu bệnh, rửa sạch, phơi ráo, chặt nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ 60-70℃, sau đó xay nhuyễn thành bột để phục vụ cho nghiên cứu.
Bột rễ cây dương đầu được chiết xuất bằng cồn EtOH 96%, sau đó dịch chiết cồn được phân tách thành dịch chiết cô đặc và phần bã Dịch chiết cô đặc tiếp tục được hòa tan trong hexane, tạo thành hai phần: phần tan là cao hexane và phần không tan được hòa tan trong methanol thành cao thô methanol Phân đoạn phân cực của dịch chiết cồn EtOH 96% toàn thành phần từ bột rễ cây dương đầu Sau khi kiểm tra độ ẩm, cao thô methanol sẽ được tiến hành phân tích.
(*) Thực hiện bởi nhóm nghiên cứu ngành Công nghệ Thực phẩm khoá 17
Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp điều chế cao tổng Đối với mẫu nguyên liệu rễ cây dương đầu đã nghiền thành bột, áp dụng quy trình trích ly rắn – lỏng để điều chế cao thô methanol Sau đó tiến hành chiết hồi lưu bằng cách hoà tan cao thô methanol với lần lượt các dung môi n-hexane (phân cực kém), methanol (phân cực mạnh) Cuối cùng, cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp từng phần dịch chiết để thu được các cao thành phần tương ứng (*
2.2.2 Các phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc ký lớp mỏng là phương pháp quan trọng để kiểm tra các phân đoạn và lựa chọn hệ dung môi cho sắc ký cột Quá trình này được thực hiện trên bản mỏng đã được tráng sẵn Để phát hiện vết chất, người ta sử dụng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc nhúng bản mỏng vào dung dịch thuốc thử vanilin/H2SO4 10% pha trong ethanol, sau đó sấy khô và hơ nóng từ từ cho đến khi màu xuất hiện.
Sắc ký cột là phương pháp phân tách các hợp chất dựa trên sự tương tác giữa pha động (dung môi rửa giải) và pha tĩnh (chất hấp phụ) Phương pháp này sử dụng cột có kích thước khác nhau tùy thuộc vào lượng mẫu, với chất hấp phụ chủ yếu là silica gel pha đảo Đối với sắc ký cột nhanh, silica gel có kích thước 230-400 mesh được ưa chuộng vì có nhiều lỗ xốp hơn trên một đơn vị diện tích Pha động, là chất lỏng được rót từ đỉnh cột, chảy xuống lớp lọc xốp nhờ trọng lực hoặc áp suất bên ngoài Sự phân tách diễn ra nhờ khả năng hấp phụ khác nhau và tương tác giữa pha động và pha tĩnh.
+ Sắc ký cột Diaion HP-20:
Diaion HP 20 hoạt động chủ yếu dựa trên cơ chế phân bố, trong đó mẫu thử được phân bố trong pha tĩnh là nước, chiếm khoảng 60% khối lượng của Diaion Pha động thường được sử dụng theo trình tự từ nước sang nước chứa MeOH, sau đó là MeOH.
Dung môi kém phân cực như aceton có vai trò quan trọng trong quá trình phân tích hợp chất Các nhóm hợp chất có độ phân cực thấp sẽ bị giữ lại lâu hơn trong các xoang rỗng của Diaion HP-20, dẫn đến việc chúng ra khỏi cột sau cùng Ngược lại, những chất có độ phân cực cao sẽ thoát ra sớm hơn Do đó, Diaion HP-20 là lựa chọn lý tưởng để phân tích các hợp chất tan trong dung môi phân cực mạnh như polyphenol và glycoside, những hợp chất khó tách biệt bằng phương pháp hấp phụ.
+ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng HPLC là một phương pháp hiệu quả để tách các thành phần trong hỗn hợp dựa trên sự tương tác giữa chất phân tích và pha động, thường là chất lỏng.
Trong quy trình sắc ký, pha tĩnh thường là các chất rắn, trong khi pha động mang theo các chất phân tích di chuyển qua pha tĩnh Các thành phần trong mẫu có tương tác mạnh với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn so với những thành phần có tương tác yếu hơn.
+ Sắc ký điều chế (HPLC điều chế)
Sắc ký điều chế là kỹ thuật phân tách tiên tiến, giúp tách và tinh khiết hóa các cấu tử có giá trị cao, đặc biệt là các cặp đồng phân quang học khó tách Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp, dược phẩm, hóa học, sinh học và môi trường, cho phép tách các chất với hàm lượng nhỏ mà các phương pháp khác không thực hiện được Sắc ký điều chế có khả năng phân lập các đơn chất tinh khiết với khối lượng nhỏ từ polymer tổng hợp, sản phẩm tự nhiên từ nuôi cấy mô, thảo mộc, dược liệu, cũng như các sản phẩm chuyển hóa từ dịch sinh học, đồng thời khảo sát cấu trúc các đơn chất để làm chất chuẩn.
2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc và định danh
Cấu trúc hoá học của các hợp chất được phân lập xác định qua các phương pháp phổ nghiệm như phổ khối (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) ở cả hai chiều (HSQC, HMBC, COSY) Việc sử dụng phần mềm xử lý và dự đoán phổ như Mestrelab Research Mnova và ChemDraw, cùng với phân tích và đối chiếu tài liệu tham khảo, giúp xác định cấu trúc và định danh các chất một cách chính xác.
Thực nghiệm
2.3.1 Hóa chất và nguyên liệu
− Sắc ký lớp mỏng (SKLM) pha thường: TLC Silica gel 60 F254 (MERCK, Đức)
− Sắc ký cột (SKC) pha đảo: Silica gel 60 (0,040-0,063 mm); (HIMEDIA, Ấn Độ)
− Hạt nhựa Diaion HP-20 hấp phụ: Mitsubishi, Nhật
− Thuốc thử hiện vết trên SKLM: dung dịch vanilin/H2SO4 10%, pha trong ethanol
− Nước cất hai lần khử ion (b)
− Dung môi cho quá trình thí nghiệm:
+ Chloroform (CHCl3) 99% (CHEMSOL, Việt Nam)
+ Acetone (AC) 99,7% (CHEMSOL, Việt Nam)
+ Methanol (MeOH) 99,7% (CHEMSOL, Việt Nam)
+ Ethyl acetate (EA) 99,5% (CHEMSOL, Việt Nam)
+ Acid sulfuric (H2SO4) (CHEMSOL, Việt Nam)
+ Acid formic (HCOOH) (CHEMSOL, Việt Nam)
+ Ethanol (EtOH) (CHEMSOL, Việt Nam)
– Dung môi dành cho máy HPLC:
+ Methanol ≥ 99,9% (Fisher Scientific, Nhật Bản)
+ Acid formic (Fisher Scientific, Nhật Bản)
− Máy cộng hưởng từ hạt nhân (AVANCE NEO) với tần số 600 MHz cho cả 2 phổ
− Máy đo khối phổ (SCIEX X500R QTOF) (a)
− Hệ thống sắc ký điều chế trung áp Pure C-835 Prep Advance, Buchi (Thụy Sỹ) (b) + Đầu dò UV-Vis (200-800 nm) kết hợp ELSD
+ Cột HPLC Silica gel C18 60A, 10 àm, 150 mm ì 10 mm
− Hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC Jasco Model LC-4000, Nhật Bản (b)
− Phần mềm xử lý phổ Mestrelab Research Mnova 14.2.1
− Phần mềm ChemDraw Ultra 16.0 để dự đoán độ dịch chuyển hoá học
− Cân kỹ thuật và cân phân tích (PRECISA) (b)
− Máy cô quay (HEIDOLPH hoặc YAMATO) (b)
− Buồng soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm (b)
− Bơm chân không dành riêng cho hệ thống HPLC (b)
− Cột thủy tinh diaion HP-20 : 10 cm × 100 cm (b)
− Cột thủy tinh chạy sắc ký nhanh : 7 cm × 25 cm (b)
(a) Thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ − Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phòng thí nghiệm Hoá hữu cơ thuộc Khoa Công nghệ Hoá học và Thực phẩm tại Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh thực hiện các nghiên cứu và thí nghiệm liên quan đến hóa học hữu cơ.
2.3.3 Điều chế cao MeOH và các cao thành phần
Bột nguyên liệu 7 kg được chiết xuất bằng phương pháp trích nóng với ethanol trong hệ thống đun hồi lưu Mỗi mẻ 3 kg nguyên liệu được đun với 15 L dung môi trong 3 giờ ở nhiệt độ sôi của ethanol, thực hiện tổng cộng 6 lần.
Gom dịch trích và thu hồi dung môi dưới áp suất thấp cho ra 1,2 kg cao thô EtOH Sau đó, hòa tan 1,1 kg cao EtOH thô với 12 lần 1 L n-hexane, thu hồi dung môi để có 600 g cao n-hexane Phần không tan trong n-hexane được hòa tan tiếp trong 12 lần 1 L MeOH, cuối cùng thu được 750 g cao MeOH.
Sơ đồ 2.1 Tổng quát quy trình chiết xuất cao MeOH
2.3.4 Khảo sát các cao phân đoạn từ cao methanol (phân đoạn 1)
Nhóm nghiên cứu K18 đã thực hiện việc điều chế các cao phân đoạn từ cao thô MeOH, với 750 g cao MeOH được phân lập trên cột Diaion Các phân đoạn thu được có nhiều vết tách rõ ràng và đơn giản, với hàm lượng cao, sẽ được lựa chọn để tiếp tục phân tích bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển.
Diaion là một loại nhựa tổng hợp được sản xuất từ quá trình đồng trùng hợp giữa styren và divinyl benzen Hạt Diaion HP-20 có đặc điểm nhẹ, xốp với diện tích bề mặt khoảng 600 m²/g và đường kính xoang trung bình khoảng 400 A⁰ Diaion không hòa tan trong nước cũng như trong các dung môi hữu cơ, và có thể được sử dụng trong môi trường có tính axit hoặc kiềm.
Hòa tan 200g cao thô MeOH trong nước cất đủ, khuấy nhẹ cho cao tan dần Sau đó, sử dụng máy siêu âm để đảm bảo mẫu được hòa tan hoàn toàn Kết quả thu được là một chất lỏng hơi sánh đặc.
Diaion HP-20 đã được chuẩn bị sẵn trong cột và ngâm trong aceton, sử dụng chai 500ml để thu các phân đoạn rửa giải Tổng lượng aceton sử dụng là 5 L, được lắp đặt theo hệ thống dây dẫn nước chảy nhỏ giọt với tốc độ dòng chảy 15 mL/phút và van xả với tốc độ 5 mL/phút nhằm đảm bảo cột hoạt động ổn định.
Tiến hành nạp cột ướt bằng cách ngâm Diaion trong nước cất trước khi nạp mẫu Rút nước trong cột Diaion HP-20 cho đến khi mực nước gần bằng mực Diaion Đưa mẫu vào cột từ từ và ổn định cột trong khoảng 3-4 tiếng Thông số chạy cột được trình bày trong phụ lục 2.2.
Khai triển cột bằng nước cất 100%, rút dịch nước với tốc độ 20-30 mL/phút cho đến khi dịch nước nhạt màu và sau đó không còn màu Tiến hành kiểm tra sau khi hoàn tất.
29 tra bằng sắc ký lớp mỏng, đảm bảo loại hết phần lớn các tạp chất phân cực như đường, chất màu, các acid amin, các chất vô cơ
Tiếp tục quá trình khai triển cột bằng dung môi ethanol pha nước theo các tỉ lệ 20%, 40%, 60%, 80% và 96%, sau đó rửa cột bằng aceton Quan sát kỹ từng phân đoạn, nhận thấy dịch nước nhạt màu dần từ vàng nâu sang vàng trong, khi không còn màu thì tiến hành kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O:Acid formic theo tỉ lệ 7:2:0,5:0,5 Hình ảnh kiểm tra các phân đoạn được thể hiện trong hình 2.1 và 2.2 Sau đó, cô quay các phân đoạn thu hồi thành cao phân đoạn và tiếp tục chạy cột với tỉ lệ dung môi ethanol và nước giống như trước, tổng cộng thực hiện quá trình chạy cột 3 lần.
Các phân đoạn thu được từ cột Diaion HP-20 sẽ đơn giản hóa quá trình loại bỏ một số tạp chất phân cực như đường, polysaccharid và acid amin Các phân đoạn này sẽ tiếp tục được phân tích bằng phương pháp sắc ký cột nhanh Kết quả thu được sau khi chạy cột gồm 5 phân đoạn: OI_Et20, OI_Et40, OI_Et60, OI_Et80, OI_Et96 và OI_Ace, được trình bày chi tiết trong phụ lục 2.3.
Hình 2.1 Sắc ký lớp mỏng của các phân đoạn từ cao MeOH
2.3.5 Khảo sát và phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOH 20 (phân đoạn 2)
Sau khi nhận được phân đoạn phân cực từ cột Diaion và dựa trên ý kiến của giáo viên hướng dẫn, chúng tôi tiếp tục chọn phân đoạn OI_Et20 (54,30 g) để tiến hành phân tách bằng phương pháp sắc ký nhanh Quá trình này nhằm tạo ra các phân đoạn nhỏ hơn, từ đó lựa chọn những phân đoạn có vết tách tốt để phân lập các hợp chất Đặc biệt, kỹ thuật này còn sử dụng bơm hút chân không để tăng tốc độ phân tách.
Hòa tan 50 g cao OI_Et20 trong một lượng tối thiểu dung môi MeOH Để thu được mẫu bột khô, trộn dung dịch mẫu với chất hấp phụ (silica gel RP-18), sau đó làm bay hơi dung môi để thu được hỗn hợp bột màu, mịn và tơi xốp.
Bước sóng 254 nm Bước sóng 365 nm
Hình 2.2 Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn cao MeOH qua đèn UV hai bước sóng
Tiến hành nhồi cột với silica gel đã được ngâm trong nước cất bằng cách từ từ đổ silica gel vào cột Châm dung môi từ từ và xả van để nén silica gel, tránh làm khuấy động lớp silica gel Sau khi pha tĩnh lắng xuống, nhẹ nhàng đóng van cột để ổn định lớp silica gel Rút mực dung môi xuống gần chạm bề mặt lớp silica gel để hoàn tất quá trình.
Tiến hành khai triển cột với hệ dung môi MeOH và nước cất theo tỉ lệ 20%, 40%, 50%, 60% và 80%, sử dụng bình thủy tinh 500ml để hứng các phân đoạn Quan sát từng phân đoạn cho thấy dịch nước nhạt màu dần từ vàng nâu sang vàng trong, và khi không còn màu, tiến hành kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả phân lập các hợp chất từ phân đoạn ME20
Sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký cột, sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các hệ dung môi khác nhau, đã phân lập thành công ba mẫu chất tinh khiết từ phân đoạn Me20 (0,7055 g).
+ Et20_Me20_2 (2,4 mg) được đặt tên là NN1
+ Et20_Me20_3 (6,6 mg) được đặt tên là NN2
+ Et20_Me20_5 (3,9 mg) được đặt tên là NN3
Hợp chất Et20_Me20_5, sau khi phân tích bằng phổ 13C và so sánh với các mẫu trong nhóm luận văn K18, đã phát hiện sự trùng lặp về chất Do đó, hợp chất này sẽ không được đề cập chi tiết trong phần biện luận.
Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập
Hợp chất NN1 (2,4 mg) được tách chiết từ phân đoạn Me20 thông qua các phương pháp sắc ký điều chế và sắc ký phân tích, với những đặc điểm nổi bật.
+ Dạng chất bột, có màu trắng hơi ngả vàng
+ Độ tinh sạch đo bằng máy sắc ký cao áp HPLC là 99%
+ Phổ ESI-MS (Phụ lục 3.1)
+ Phổ 1 H-NMR (DMSO – d6, 600 MHz) (Phụ lục 3.2 – 3.3)
+ Phổ 13 C-NMR (DMSO – d6, 600 MHz) (Phụ lục 3.4 và Bảng 3.1)
Phổ ESI-MS cho thấy một mũi ion phân tử giả tại m/z 475,1995 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử [C25H32O9+H]+ được tính toán là 476,20 bằng phần mềm chemdraw Do đó, công thức phân tử của hợp chất NN1 được xác định là C25H32O9.
Kết hợp phổ 13C-NMR và HSQC (600 MHz, DMSO, Phụ lục 3.4 – 3.5 – 3.6) của hợp chất NN1 cho thấy sự hiện diện của 25 carbon, bao gồm năm carbon của nhóm methyl
Trong nghiên cứu này, các tín hiệu hóa học δC cho thấy sự hiện diện của 2 carbon methine và nhóm biphenyl gồm 12 carbon, được cấu thành từ 2 nhóm phenyl nối nhau qua cầu nối Ngoài ra, 6 carbon bậc bốn có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 126,1 – 152,0 ppm chứng minh sự hiện diện của 2 vòng benzen.
Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO) cho thấy tín hiệu của sáu proton vòng thơm trong nhóm biphenyl tại các vị trí δH 6,79 (2H, s, H-19), δH 6,81 (2H, s, H-4), δH 6,89 (2H, s, H-18), δH 7,02 (2H, s, H-5), δH 7,08 (2H, s, H-16) và δH 7,13 (2H, s, H-15) Bên cạnh đó, nhiều tín hiệu proton có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 3 – 4 ppm cũng được quan sát, cùng với tín hiệu proton anomer tại δH 5,05 (1H; d; 7,8 Hz; H-1’), cho thấy sự hiện diện của một đơn vị đường Hằng số ghép J = 7,8 Hz gợi ý rằng hai phần đường này có cấu hình β.
Hình 3.1 Một số tương quan COSY và HMBC của Et20_Me20_2
Dựa trên các tương quan COSY trong Hình 3.1, có thể xác định mạch carbon liên tục từ C-7 đến C-13 và vòng đường gồm 6 carbon tại các vị trí 1', 2', 3', 4', 5', 6' Độ dịch chuyển hóa học của các carbon trong phần đường cho thấy C-1' (δC 100,4), C-2' (δC 77,3), C-3' (δC 76,1), C-4' (δC 73,4), C-5' (δC 69,8) và C-6' (δC 60,8) Sự hiện diện của carbon methylene tại vị trí 6’ chỉ ra sự có mặt của đơn vị đường β-D-glucopyranoside.
Tương quan HMBC thể hiện trên Hình 3.1 (Phụ lục 3.8 ‒ 3.10), giữa H-16 (δH 7,1; J 8,4 Hz) với C-14 (δC 64,7); C-15 (δC 129,5); C-17 (δC 151,9); C-18 (δC 134,6); C-2 (δC
Vòng benzen [I] có cấu trúc gồm sáu carbon với các giá trị δC 126,2 (C-1), 127,9 (C-2), 151,2 (C-3), 129,6 (C-5) và 130,2 (C-6), cùng với tương quan H-16 (δH 6,8; J = 8,4 Hz) Tương quan HMBC cho thấy vòng benzen [II] cũng có sáu carbon Hơn nữa, phần đường β-D-glucopyranoside được gắn vào aglycone tại vị trí C-17, được xác định qua tương quan giữa proton H-1' (δH 5,05) và C-17 (δC 151,9).
Dựa trên phân tích dữ liệu từ các phương pháp 1 H-NMR, 13 C-NMR, COSY, HSQC và HMBC, NN1 có cấu trúc tương tự như khung chất diarinheptanoid Số lượng tín hiệu ghi nhận là 25C với 1 carbon bị bão hòa, cho thấy NN1 có sự tương đồng với hợp chất Alnusdiol ꞵ-D-glucopyranoside, như đã được chỉ ra trong tài liệu đã công bố [40].
Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của Alnusdiol ꞵ- D -Glucopyranoside
Vị trí Loại carbon δ C, ppm
Bảng 3.1 So sánh dữ liệu phổ 13 C-NMR của Et20_Me20_2 với Alnusdiol ꞵ- D -
Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của NN1
Hợp chất NN2 (6,6 mg) được tách ra từ phân đoạn Me20 thông qua các phương pháp sắc ký điều chế và sắc ký phân tích, với những đặc điểm nổi bật.
+ Dạng chất bột màu trắng ngà
+ Độ tinh sạch đo bằng máy sắc ký cao áp HPLC là 98%