TỔNG QUAN
Đại cương về loãng xương
Loãng xương, theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 1993, là một bệnh lý đặc trưng bởi mật độ xương (MĐX) thấp và tổn thương vi cấu trúc của xương, dẫn đến tăng tính dễ gãy và nguy cơ gãy xương Năm 2000, Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ đã định nghĩa loãng xương là rối loạn xương với sự giảm sức mạnh của xương, làm tăng nguy cơ gãy xương Sức mạnh xương được xác định bởi hai yếu tố chính: mật độ xương và chất lượng xương MĐX được tính dựa trên độ khoáng hóa của xương trên một đơn vị thể tích, trong khi chất lượng xương được đánh giá qua các thông số như cấu trúc xương, chu chuyển xương, độ khoáng hóa, tổn thương tích lũy và tính chất của các chất cơ bản của xương, với chu chuyển xương đóng vai trò quan trọng.
1.1.2 Dịch tễ học loãng xương nam
Tỷ lệ loãng xương ở nam giới trên thế giới dao động từ 2-16% và tăng dần theo độ tuổi, thường thấp hơn nữ giới từ 2-4 lần Nghiên cứu NHANES 2005–2006 cho thấy 49% phụ nữ và 30% đàn ông từ 50 tuổi trở lên bị giảm mật độ xương ở cổ xương đùi, với tỷ lệ loãng xương là 10% ở nữ và 2% ở nam Một nghiên cứu khác cho thấy tỷ lệ loãng xương ở nam giới từ 69 đến 74 tuổi là 10,2% Tại Thụy Sĩ, tỷ lệ loãng xương ở nam giới trong độ tuổi 50-80 là 6,3%, và tăng lên ở nhóm tuổi 80-84.
Luận án tiến sĩ Y học
16,6% 10 Ở một số nước Châu Á tỷ lệ loãng xương ở nữ c ng cao hơn nam tương tự như người da trắng Nghiên cứu tiến hành trên 7042 người độ tuổi từ
Theo nghiên cứu từ năm 2002 đến 2006 tại 10 trung tâm ở các tỉnh khác nhau ở Trung Quốc, tỷ lệ loãng xương ở nữ giới trên 50 tuổi là 31,2% và ở nam giới là 10,4% Tại Hồng Kông, tỷ lệ loãng xương cột sống thắt lưng ở nam là 7% và ở nữ là 37%, trong khi tỷ lệ loãng xương ở cổ xương đùi là 6% cho nam và 16% cho nữ Tại Hàn Quốc, tỷ lệ loãng xương ở nữ giới trên 50 tuổi là 35,5%, trong khi ở nam giới là 7,5%.
Nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy tỷ lệ loãng xương ở cả nam và nữ tương đương với một số nước châu Á và người da trắng, đặc biệt ở người cao tuổi Cụ thể, theo số liệu của Nguyễn Thị Thanh Hương tại miền Bắc, trong nghiên cứu trên 222 nam giới và 612 nữ giới khỏe mạnh tuổi từ 13-83, tỷ lệ loãng xương ở vị trí cổ xương đùi là 9% ở nam và 17% ở nữ.
Nghiên cứu của D ng và cộng sự trên 325 người cao tuổi tại Cần Thơ cho thấy tỷ lệ loãng xương ở nam giới trên 60 tuổi là 17,5% Tương tự, nghiên cứu của Hồ Phạm Thục Lan và cộng sự tại Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ loãng xương ở nam là 10% và ở nữ là 30% Điều này cho thấy loãng xương là bệnh phổ biến tại Việt Nam, thường tiến triển âm thầm và chỉ được chẩn đoán sau khi có triệu chứng gãy xương Do đó, việc xác định sớm các yếu tố nguy cơ loãng xương, đặc biệt ở nam giới, là rất cần thiết để phòng ngừa.
Phương pháp chẩn đoán loãng xương hiệu quả nhất hiện nay là đo mật độ khoáng xương bằng kỹ thuật hấp thụ tia X năng lượng kép (DXA) Mật độ xương được xác định bằng cách tính lượng chất khoáng trong xương so với diện tích vùng khảo sát Máy DXA cung cấp ước tính chính xác về mật độ xương, giúp phát hiện sớm tình trạng loãng xương.
Luận án tiến sĩ Y học về khối lượng chất khoáng (BMC) liên quan đến việc đo diện tích mà khối chất khoáng đó chiếm giữ và tính toán MĐX bằng cách chia BMC cho diện tích Đơn vị đo lường MĐX được xác định bằng máy DXA là g/cm² Để chẩn đoán loãng xương, MĐX hiện tại sẽ được so sánh với giá trị MĐX trung bình của quần thể từ 20-40 tuổi, được gọi là khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) Kết quả của sự so sánh này được thể hiện qua chỉ số T (T-score), là số đo lệch chuẩn (SD - Standard Deviation) của MĐX hiện tại so với KLXĐ.
Một người được chẩn đoán loãng xương khi chỉ số T nhỏ hơn hoặc bằng -2,5, trong khi giảm mật độ xương xảy ra khi chỉ số T từ -2,5 đến dưới -1,0, và mật độ xương bình thường khi chỉ số T lớn hơn hoặc bằng -1,0 Mật độ xương liên quan chặt chẽ đến sức mạnh xương và là yếu tố dự báo nguy cơ gãy xương trong tương lai Nguy cơ gãy xương tăng lên đáng kể khi mật độ xương giảm Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo cổ xương đùi là khu vực quan trọng nhất để chẩn đoán loãng xương Tuy nhiên, các hướng dẫn từ Hiệp hội quốc tế và mật độ xương lâm sàng (ISCD) cùng Hội loãng xương Hoa Kỳ (NOF) đề xuất chẩn đoán loãng xương nên dựa trên phép đo mật độ xương tại ba vị trí: cổ xương đùi, đầu trên xương đùi và cột sống thắt lưng Mật độ xương tại vị trí một phần ba dưới xương quay cũng có thể được sử dụng để chẩn đoán loãng xương.
3 vị trí trên không thể đo được 20
Cơ chế bệnh sinh loãng xương ở nam giới
Cơ chế sinh bệnh học của loãng xương ở nam giới rất phức tạp, liên quan đến nhiều yếu tố quan trọng, bao gồm khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) và quá trình mất xương sau khi đạt được KLXĐ Tỷ lệ loãng xương ở nam giới thường thấp hơn ở nữ giới do sự khác biệt trong cả quá trình hình thành KLXĐ và quá trình mất xương theo thời gian.
Luận án tiến sĩ Y học
* Khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) hay sự trưởng thành của bộ xương
Khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) là khối lượng xương tối đa đạt được khi kết thúc giai đoạn trưởng thành, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định khối lượng xương toàn bộ khung xương và ảnh hưởng đến nguy cơ loãng xương sau này Người có KLXĐ cao ở tuổi trưởng thành sẽ ít có nguy cơ loãng xương hơn so với người có KLXĐ thấp Trong quá trình tăng trưởng, kích thước khung xương và KLXĐ có sự khác biệt rõ rệt giữa hai giới, với tốc độ hình thành xương cao nhất xung quanh tuổi dậy thì Nghiên cứu cho thấy nam giới có diện tích xương lớn hơn 35-42% so với nữ, và KLXĐ cổ xương đùi của nam cao hơn nữ từ 12%-14% Tại Việt Nam, KLXĐ cổ xương đùi ở nam giới cao hơn nữ khoảng 6%, trong khi KLXĐ ở cột sống thắt lưng cao hơn khoảng 9% Sự khác biệt cấu trúc xương giữa nam và nữ cũng rất rõ rệt, với testosterone kích thích phát triển bề dày của vỏ xương ở nam, trong khi estrogen ở nữ kích thích quá trình tạo xương xốp và ức chế tạo vỏ xương, dẫn đến xương nữ dễ gãy hơn.
Luận án tiến sĩ Y học
Sự hình thành khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) chịu ảnh hưởng từ nhiều yếu tố, bao gồm di truyền, chế độ tập luyện, cân nặng, hormone như GH và hormone giới tính, cũng như chế độ dinh dưỡng đủ canxi và vitamin D Môi trường và lối sống, bao gồm thuốc lá, cà phê và rượu, cũng đóng vai trò quan trọng trong việc xác định kích cỡ và mật độ xương Trong số đó, yếu tố di truyền được xem là quan trọng nhất, chiếm từ 50 - 80% ảnh hưởng tùy theo từng nghiên cứu, đặc biệt trong giai đoạn dậy thì Khối lượng xương đỉnh càng cao sẽ giúp giảm nguy cơ loãng xương trong tương lai.
Lão hóa xương bắt đầu khi cơ thể đạt khối lượng xương tối đa (KLXĐ) ở tuổi trưởng thành, dẫn đến quá trình mất xương theo tuổi tác Quá trình này thể hiện qua hai khía cạnh chính: tốc độ mất xương và vị trí mất xương trong cơ thể.
Tốc độ mất xương bắt đầu diễn ra ở cả nam và nữ sau khi đạt khối lượng xương đỉnh (KLXĐ), với tốc độ trung bình ở cột sống thắt lưng là 0,84%/năm ở nam giới và 1,6% ở nữ giới trong độ tuổi 30 Nam giới không trải qua quá trình mất xương ồ ạt như nữ giới sau mãn kinh, mà sự giảm nồng độ hormon sinh dục testosterone theo tuổi tác dẫn đến mất dần xương vỏ và xương bè Nhiều nghiên cứu cho thấy quá trình mất xương ở nam giới diễn ra chậm hơn, chỉ thực sự mạnh mẽ sau tuổi 50 và có ý nghĩa rõ rệt sau tuổi 65 Trong khi đó, tốc độ mất xương của nữ giới sau mãn kinh vẫn cao hơn nam giới Nghiên cứu của Hannan và cộng sự đã theo dõi tốc độ mất xương ở người cao tuổi (67 - 90) bằng cách đo mật độ xương.
4 năm cho kết quả tốc độ mất xương trung bình của nữ (3,4 - 4,8%) cao hơn nam (0,2 - 3,6%) ở tất cả các vị trí Theo một nghiên cứu khác tiến hành trên
Luận án tiến sĩ Y học
769 người trên 60 tuổi theo dõi trong vòng 2,5 năm cho thấy tốc độ mất xương ở cổ xương đùi là 0,82% một năm ở nam và 0,96% ở nữ 32
Quá trình mất xương ở nữ giới chủ yếu là giảm số lượng bè xương, trong khi ở nam giới, số lượng bè xương không thay đổi nhưng chúng mỏng dần Nghiên cứu của Riggs và cộng sự (2008) cho thấy quá trình giảm xương bè bắt đầu ngay sau khi đạt khối lượng xương đỉnh (KLXĐ), với đỉnh điểm ở phụ nữ sau mãn kinh và ở nam giới sau tuổi 65 Các yếu tố như di truyền, tuổi tác, thiếu hụt hormone, ít vận động, thiếu vitamin D và canxi, sử dụng glucocorticoid, và một số bệnh lý như cường cận giáp hay suy thận đều làm tăng tốc độ chu chuyển xương và mất cân bằng giữa hủy xương và tạo xương, dẫn đến tăng tốc độ mất xương, giảm khối lượng xương, và tăng nguy cơ gãy xương, góp phần vào sự phát triển của loãng xương.
Sự khác biệt cơ bản trong cấu trúc xương giữa nam và nữ ở tuổi trưởng thành, cùng với quá trình lão hóa của bộ xương, dẫn đến khả năng chịu lực của xương nam tốt hơn so với nữ Điều này giải thích tại sao tỷ lệ loãng xương và gãy xương ở nam giới thường thấp hơn so với nữ giới.
Đa hình đơn nucleotide
1.3.1 Khái niệm về đa hình đơn
Theo Viện Sức khoẻ Quốc gia Hoa Kỳ (NIH), biến thể đơn nucleotide, hay còn gọi là SNPs (phát âm là "Snips"), là dạng biến đổi di truyền phổ biến nhất ở con người Mỗi SNP thể hiện một sự khác biệt trong mã di truyền.
Luận án tiến sĩ Y học tập trung vào nucleotid, đơn vị cấu tạo cơ bản của DNA, với ví dụ về SNP (biến thể đơn nucleotid) như sự thay thế cytosin (C) bằng thymin (T) SNPs là hiện tượng phổ biến trong chuỗi DNA của con người, hình thành do chọn lọc tự nhiên và sự biến đổi gen để thích nghi với môi trường Qua quá trình tiến hóa, những biến thể thích nghi xuất hiện với tần số ổn định trong quần thể Tính đa hình của gen được xác định bởi tập hợp các điểm đa hình, nhưng không phải tất cả biến đổi nucleotid đều là SNP; một biến đổi chỉ được coi là SNP khi có tần suất từ 1% trở lên trong quần thể Khoảng 325 triệu SNP đã được xác định trong bộ gen người, với 15 triệu SNP có tần suất 1% hoặc cao hơn Mặc dù nhiều SNP nằm trong vùng không mã hóa và ít ảnh hưởng đến chức năng protein, chúng có thể là dấu ấn sinh học giúp xác định gen liên quan đến bệnh Khi SNP xuất hiện trong gen hoặc khu vực điều khiển, chúng có thể ảnh hưởng đến chức năng gen và liên quan đến các bệnh lý cụ thể Hầu hết SNPs không ảnh hưởng đến sức khỏe, nhưng một số đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong sự phát triển cơ thể.
SNPs có khả năng dự đoán phản ứng của cá nhân với thuốc, nhạy cảm với độc tố và nguy cơ phát triển bệnh Chúng cũng được sử dụng để theo dõi di truyền gen bệnh trong gia đình Hướng nghiên cứu mới trong y học hiện nay là xác định mối liên quan giữa SNPs và các bệnh lý đa yếu tố, chẳng hạn như bệnh loãng xương.
Luận án tiến sĩ về y học tập trung vào các lĩnh vực xương, tim mạch, tiểu đường và ung thư, nhằm phát triển nền y học cá thể hóa trong chẩn đoán và điều trị Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc cá nhân hóa phương pháp điều trị để nâng cao hiệu quả chăm sóc sức khỏe cho bệnh nhân.
Hình 1.1 Đa hình nucleotid đơn (Nguồn: https://link.springer.com/article/10.1007/s11356-022-19981-7) 1.3.2 Các loại SNPs
Dựa vào vị trí, SNPs được phân chia thành 2 loại chính 33 :
SNPs liên kết, hay còn gọi là SNPs chỉ thị, không nằm trong gen và không ảnh hưởng đến chức năng tổng hợp protein Tuy nhiên, SNPs thường được phát hiện gần các gen liên quan đến bệnh, do đó chúng có thể được sử dụng như dấu hiệu sinh học để xác định bệnh hoặc gen bệnh.
SNPs trong gen có vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến chức năng của protein, liên quan đến các bệnh lý và tác động đến sự đáp ứng với thuốc điều trị.
SNPs mã hoá nằm trên vùng mã hoá của gen dẫn đến sự thay đổi acid amin của protein do gen đó mã hoá
SNPs không mã hóa nằm trong vùng điều hoà của gen có thể dẫn đến thay đổi mức độ biểu hiện gen thông qua mức độ RNA và protein
1.3.3 Vai trò và ứng dụng của SNPs trong Y học
Các biến thể trong trình tự DNA của con người có thể tác động đến sự phát triển của bệnh tật, cách cơ thể phản ứng với các tác nhân gây bệnh, hóa chất, thuốc, vaccine và các yếu tố khác SNP (đơn nucleotide polymorphisms) được xem là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu này.
Luận án tiến sĩ Y học nhấn mạnh tiềm năng của việc cá thể hóa trong y học thông qua SNP Một SNP đơn có thể gây ra bệnh di truyền, nhưng đối với các bệnh phức tạp, chúng thường tương tác với nhau và với môi trường SNP đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu y học, đặc biệt là trong các nghiên cứu toàn hệ gen (GWAS), giúp so sánh các vùng gen giữa bệnh nhân và người khỏe mạnh GWAS đã phát hiện nhiều SNP ảnh hưởng đến các bệnh đa yếu tố như đái tháo đường, tăng huyết áp, loãng xương và béo phì Các nghiên cứu trên cơ sở dữ liệu gen của quần thể không chỉ phát hiện biến thể di truyền mà còn gợi ý hướng nghiên cứu cho việc phòng ngừa và chữa bệnh trong tương lai.
1.3.4 Một số phương pháp xác định kiểu gen của đa hình đơn nucleotid 35
Một trong những thách thức lớn của sinh học phân tử hiện đại là hiểu sự khác biệt giữa các loài và cá thể về mã hóa gen Đa hình đơn nucleotid (SNP) đóng vai trò quan trọng trong sự đa dạng kiểu gen, với hơn 80% SNP tạo ra sự khác biệt giữa cá thể trong cùng một loài SNP ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị thuốc và tác động của môi trường lên từng cá nhân, làm cho kiểu gen của SNP trở thành yếu tố quan trọng trong nghiên cứu tương tác giữa môi trường và hệ gen liên quan đến bệnh tật ở người Hiện nay, có nhiều phương pháp kỹ thuật để xác định kiểu gen của SNP, và bài viết này sẽ trình bày một số phương pháp chính thường được sử dụng trong các phòng xét nghiệm di truyền.
Luận án tiến sĩ Y học
1.3.4.1 Phương pháp ARMS–PCR (Amplification refractory mutation system) 36
ARMS – PCR (Hệ thống khuếch đại đột biến không nhạy cảm) là một ứng dụng của PCR, cho phép khuếch đại DNA bằng các alen mồi đặc hiệu Phương pháp này rất hữu ích trong việc xác định các đột biến điểm và đa hình, đồng thời giúp phân biệt kiểu gen đồng hợp và dị hợp ARMS – PCR sử dụng mồi cho alen đột biến và alen bình thường, với các phản ứng được thực hiện trong các ống riêng biệt Cụ thể, giếng 1 sử dụng cặp mồi F (Forward primer) và Rw (Reverse wild type), trong khi giếng 2 sử dụng cặp mồi F và Rm (Reverse mutation) Sự xuất hiện của sản phẩm đặc hiệu ở cả hai giếng chỉ ra kiểu gen dị hợp tử, trong khi sự xuất hiện chỉ ở giếng thứ 1 cho thấy đồng hợp tử bình thường, và chỉ ở giếng thứ 2 là đồng hợp tử đột biến.
Phương pháp ARMS-PCR có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản và chi phí thấp, nên được ứng dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử tại Việt Nam Nó có khả năng áp dụng cho tất cả các SNP mà không cần điểm cắt, do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp ARMS-PCR để xác định đa hình gen.
1.3.4.2 Phương pháp cắt enzym giới hạn (RFLP-PCR: Restriction Fragment Length Polymorphisms- Polymerase Chain Reaction) 37
Phương pháp PRFP-PCR là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các đoạn DNA thông qua điểm cắt của các enzym giới hạn (Restriction Enzym, RE) Phương pháp này cho phép so sánh DNA giữa các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu bằng enzym giới hạn, nhằm xác định sự tồn tại của đột biến điểm (mất hoặc xuất hiện vị trí giới hạn mới) hoặc sự thay đổi trong trình tự DNA Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước, điều này cho thấy không có sự khác biệt di truyền giữa chúng.
Luận án tiến sĩ Y học nghiên cứu sự tương đồng của các băng DNA sau khi thực hiện điện di Ngược lại, sự xuất hiện của đột biến điểm hoặc thay đổi trình tự đoạn DNA sẽ dẫn đến sự khác biệt trong các băng DNA Kỹ thuật RFLP-PCR bao gồm các giai đoạn cụ thể để phân tích và so sánh các mẫu DNA.
- Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để khuyếch đại đoạn DNA chứa SNP cần phân tích
- Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzym giới hạn thích hợp
- Điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận
Enzym giới hạn, hay còn gọi là enzym cắt, là một loại enzym quan trọng thuộc nhóm endonuclease, có khả năng cắt DNA tại những vị trí xác định Hiện nay, đã có hơn 500 loại enzym giới hạn được xác định Các enzym này có những đặc điểm chung đáng chú ý, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng di truyền học.
- Đều được chiết tách từ vi khuẩn và tên enzym mang tên của vi khuẩn
- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu (hay còn gọi là vị trí giới hạn, trình tự giới hạn) với từng loại enzym
Vị trí cắt của enzym thường có từ 4 đến 8 nucleotid, với đặc điểm quan trọng là đoạn DNA này có trình tự giống nhau khi đọc theo cả hai chiều 3’-5’ và 5’-3’ Điều này đảm bảo rằng vị trí cắt của enzym là giống nhau trên cả hai mạch DNA.
Vai trò của gen MTHFR, LRP5 và FTO đối với loãng xương và gãy xương
1.4.1 Vai trò của gen nói chung đối với loãng xương
Di truyền đóng vai trò quan trọng trong bệnh loãng xương, với các nghiên cứu trên cặp song sinh cho thấy yếu tố này quyết định từ 50-80% sự thay đổi của mật độ xương Gen không chỉ ảnh hưởng đến khối lượng xương đỉnh mà còn tham gia vào quá trình chuyển hóa và mất xương Mặc dù là yếu tố nguy cơ không thay đổi, gen có thể được can thiệp để giảm nguy cơ loãng xương Việc xác định các yếu tố nguy cơ cá nhân hóa đang trở thành xu hướng hiện nay, giúp can thiệp sớm và giảm thiểu các hậu quả của bệnh loãng xương.
Nghiên cứu về các gen ứng viên cho thấy rằng nhiều gen ảnh hưởng đến các con đường sinh hóa, dược lý và sinh lý học của quá trình tạo xương và hủy xương đã được thực hiện từ sớm Các SNP liên quan đến mật độ xương (MĐX) và gãy xương đã được xác định qua nhiều nghiên cứu với các giá trị p khác nhau, và có sự khác biệt giữa các chủng tộc Những SNP quan trọng và phổ biến nhất đã được xác định trong các nghiên cứu này.
Luận án tiến sĩ Y học tập trung vào quá trình hình thành và hủy xương, cũng như các tín hiệu Wnt từ tế bào tạo xương Nghiên cứu các yếu tố như vitamin D, estrogen, collagen và các gen như LRP5, LRP6, DKK1, VDR, ColA1, ESR1, ESR2 đã mang lại những phát hiện lâm sàng quan trọng Những phát hiện này giúp xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến loãng xương.
Nghiên cứu tương quan toàn hệ gen (GWAS) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc phát hiện các SNP mới liên quan đến mật độ xương (MĐX) và gãy xương Năm 2007, Kiel và cộng sự thực hiện nghiên cứu GWAS đầu tiên, xác định 40 SNP có khả năng ảnh hưởng đến MĐX Tuy nhiên, với cỡ mẫu nhỏ, nghiên cứu này không tìm thấy mối tương quan thống kê có ý nghĩa Đến năm 2008, hai nghiên cứu GWAS khác đã được công bố, mang lại những phát hiện quan trọng hơn trong lĩnh vực này.
Bài viết đề cập đến bốn locus liên quan đến mật độ xương (MĐX), bao gồm LRP5, ESR1, OPG và RANKL Ngoài ra, các tác giả cũng phát hiện rằng các gen LRP5, RANK, LRP40, ZBTB40 và SPTBN1 có thể làm tăng nguy cơ gãy xương.
Urano và cộng sự đã thực hiện một phân tích gộp các nghiên cứu GWAS kéo dài 8 năm (2007-2015), phát hiện nhiều SNP mới liên quan đến loãng xương và gãy xương trong quần thể người da trắng và người Châu Á Các SNP này liên quan đến các quá trình sinh học của xương, đặc biệt là con đường tín hiệu WNT/β-catenin, bao gồm catenin β1 (CTNNB1) và sclerostin (SOST).
LRP4, LRP5, GPR177, WNT4, WNT5B, WNT16, DKK1, sFRP4, JAG1, MEF2C và AXIN1 là những gen liên quan đến quá trình tạo xương Nghiên cứu GWAS về loãng xương đã xác định ba yếu tố chính: RANK, RANKL và OPG, có vai trò quan trọng trong việc biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo xương Bên cạnh đó, một số gen khác cũng ảnh hưởng đến mật độ xương và nguy cơ gãy xương.
Luận án tiến sĩ Y học chưa làm rõ vai trò của các yếu tố như FAM210A và SLC25A13 trong các cơ chế sinh học của xương Nghiên cứu của tác giả Kempt và cộng sự năm [năm nghiên cứu] đã chỉ ra những điểm quan trọng cần được xem xét để hiểu rõ hơn về vấn đề này.
Năm 2013, nghiên cứu trên 14.492 người Anh đã phát hiện 307 SNP tại 203 locus có ảnh hưởng đáng kể đến mật độ xương (MĐX), trong đó có 153 locus mới so với các nghiên cứu trước Nhóm tác giả cũng chỉ ra 12 SNP có liên quan đến gãy xương một cách có ý nghĩa.
Năm 2021, tác giả Zhu X và cộng sự đã tiến hành phân tích gộp 512 nghiên cứu GWAS trong 12 năm, phát hiện 518 locus trong bộ gen người liên quan đến loãng xương và gãy xương Tuy nhiên, chỉ 20% trong số này giải thích được mối liên quan với cơ chế sinh học của xương Loãng xương là một bệnh lý phức tạp, và sự tác động của gen đối với bệnh này đã được xác nhận, nhưng cơ chế cụ thể vẫn chưa được làm rõ Vì vậy, cần thực hiện thêm nhiều nghiên cứu trên các nhóm đối tượng khác nhau về chủng tộc, giới tính và độ tuổi để hiểu rõ hơn về vai trò của gen trong loãng xương và gãy xương.
Các nghiên cứu GWAS trên quần thể người Châu Á còn hạn chế so với các nghiên cứu trên người da trắng Yang và cộng sự đã phát hiện gen UGT2B17 liên quan đến gãy xương hông qua nghiên cứu trên 700 người Hán cao tuổi Nghiên cứu của Guo và cộng sự chỉ ra SNP rs13182402 của gen ALDH7A1 có liên quan đến nguy cơ gãy xương hông Nghiên cứu GWAS đầu tiên ở Nhật Bản với 6.700 người cho thấy SNP rs7605378 của gen FONG có mối liên quan đến loãng xương Hwang và cộng sự xác định gen MECOM làm tăng nguy cơ gãy xương ở 1.119 bệnh nhân gãy xương với 3.444 người đối chứng tại Hàn Quốc và Nhật Bản, với tỷ lệ nguy cơ (OR) là 1,39.
Luận án tiến sĩ Y học
Trong đề tài này chúng tôi chọn nghiên cứu 3 đa hình gen MTHFR
Các đa hình kiểu gen C677T (rs1801133), LRP5 Q89R (rs41494349) và FTO rs1121980 đã được nghiên cứu rộng rãi và cho thấy có mối liên quan chặt chẽ với tình trạng loãng xương, với các kết quả này được xác nhận ở nhiều chủng tộc khác nhau như châu Âu, châu Á và châu Úc Bên cạnh đó, hoạt động của gen MTHFR, liên quan đến nồng độ homocystein trong máu, cũng ảnh hưởng đáng kể đến quá trình chuyển hóa xương.
Gen LRP5 có vai trò quan trọng trong con đường tín hiệu Wnt/β-catenin, ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào tạo xương và điều chỉnh khối lượng xương Gen FTO đã được xác định liên quan đến loãng xương và gãy xương ở các nhóm người Trung Quốc và Úc Đặc biệt, các nghiên cứu trên quần thể người Việt đã chỉ ra sự liên quan của ba đa hình gen này với các bệnh lý như béo phì, tăng huyết áp, ung thư, gãy xương và hiện tượng xảy thai liên tiếp.
1.4.2 Vai trò của gen LRP5 đối với loãng xương
Giống như các thành viên khác trong gia đình LDLR, gen LRP5 ở người kéo dài khoảng 136 kb nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể 11 (11q13.2) 49
Hình 1.2 Vị trí gen LRP5 trên nhiễm sắc thể số 11 (Nguồn https://ghr.nlm.nih.gov/gene/LRP5#location) 1.4.2.2 Chức năng của gen LRP5
Gen LRP5 bao gồm 23 exon và chứa 5124 cặp bazơ, mã hóa cho protein xuyên màng LRP5 với 1614 amino acid Protein LRP5 chủ yếu nằm ở vùng ngoại bào, gắn vào màng tế bào và liên kết với phức hệ Wnt/Frizzled, đóng vai trò quan trọng trong các tín hiệu tế bào.
Luận án tiến sĩ Y học động con đường tín hiệu β catenin - Wnt, phần đuôi ở trong tế bào chất có liên quan đến sự bất hoạt phức hợp GSK-3B
Cơ chế hoạt động của con đường tín hiệu β-catenin - Wnt, hay còn gọi là con đường tín hiệu Wnt cổ điển, bắt đầu khi Wnt gắn kết với protein LRP5/LRP6 và protein Frizzled, ngăn chặn sự phosphoryl hóa Axin-Gsk3 của β-catenin và ức chế sự thoái hóa của nó Kết quả là β-catenin tích lũy trong bào tương và di chuyển vào nhân tế bào, nơi nó tạo thành phức hợp với TCF/LEF, kích hoạt các gen Wnt Ngược lại, khi không có Wnt, phức hợp protein Axin được hình thành từ Apc, Gsk3, Ck1 và β-catenin, dẫn đến việc β-catenin bị phosphoryl hóa và phân hủy bởi proteasome, do đó không thể truyền tín hiệu vào nhân tế bào.
Hình 1.3 Con đường tín hiệu β catenin – Wnt 50
Hình A, Hoạt hóa Wnt Hình B, Ức chế Wnt
Luận án tiến sĩ Y học
Một số nghiên cứu lâm sàng về gen LRP5 Q89R (rs41494349),
1.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới
Các nghiên cứu trên thế giới về tác động của 3 đa hình gen nghiên cứu
Mã gen LRP5 Q89R (rs41494349), MTHFR C677T (rs1801133) và FTO rs1121980 có liên quan đến mật độ xương và nguy cơ gãy xương, chủ yếu được nghiên cứu trên nữ giới Tuy nhiên, các nghiên cứu về nam giới, đặc biệt là trong cộng đồng người Châu Á, vẫn còn hạn chế và thường cho kết quả không đồng nhất.
Đa hình gen LRP5 Q89R (rs41494349) chủ yếu được phát hiện ở người Châu Á, đặc biệt là trong các nghiên cứu trên người Hàn Quốc và Trung Quốc Các nghiên cứu này cho thấy rằng những người mang alen G có mật độ xương thấp hơn so với những người mang alen A.
Nghiên cứu của Koh (2004) 80 trên 219 nam giới Hàn Quốc tuổi từ 20-
34, nhằm xác định mối liên quan giữa 6 SNP của LRP5 với mật độ xương:
Đa hình gen LRP5 Q89R có liên quan đến việc giảm mật độ xương ở cổ xương đùi và tam giác Ward, với p=0,004 và Cao 27,81 5,16 – 150,02 0,000 Ít > Cao 6,94 2,34 – 20,53 0,000
Kết quả từ bảng 3.27 chỉ ra rằng có sự tương quan có ý nghĩa thống kê giữa đa hình gen LRP5 Q89R, MTHFR C677T và FTO rs1121980 với chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực liên quan đến loãng xương Cụ thể, ba đa hình gen này làm tăng nguy cơ loãng xương độc lập với các yếu tố nguy cơ khác, với tỷ lệ odds lần lượt là 3,45; 1,65 và 2,17 (p0,05).
Luận án tiến sĩ Y học
Mô hình hồi quy logistic đa biến đã được sử dụng để kiểm tra mối liên quan giữa loãng xương cổ xương đùi và ba đa hình gen, cũng như các yếu tố nguy cơ khác Kết quả cho thấy các yếu tố di truyền và môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến nguy cơ phát triển bệnh loãng xương ở vùng cổ xương đùi Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về mối liên hệ giữa gen và tình trạng sức khỏe xương, góp phần nâng cao hiểu biết về bệnh lý này.
Các yếu tố nguy cơ OR 95% CI p
Thừa cân > bình thường 0,59 0,30 – 1,14 0,119 Béo phì > bình thường 0,20 0,09 – 0,48 0,000 Tiền sử hút thuốc (Có>không) 1,09 0,61 – 1,95 0,782
Tiền sử gãy xương (Có>không) 1,26 0,52 – 3,1 0,60
Tĩnh tại > cao 48,45 6,24 – 356,64 0,000 Ít > cao 6,07 1,36 – 25,92 0,018
Nhận xét: Kết quả bảng 3.28 cho thấy tại vị trí cổ xương đùi cả 3 đa hình gen
Các biến thể gen LRP5 Q89R, MTHFR C677T và FTO rs1121980 làm tăng nguy cơ loãng xương một cách độc lập với các yếu tố nguy cơ khác, với tỷ lệ odds lần lượt là 2,59; 2,5 và 1,82 Chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực có mối liên quan đáng kể đến loãng xương (p Không) 0,7 0,13 – 3,69 0,68
Tiền sử gãy xương (Có> Không) 9,5 1,41 – 63,9 0,02*
Tĩnh tại > Cao - - - Ít > Cao 0,08 0,005 – 1,34 0,079 Trung bình > Cao 0,05 1,06 – 18,93 0,02*
Nhận xét: Kết quả bảng 3.29 cho thấy ở vị trí đầu trên xương đùi, không tìm thấy mối liên quan có ý nghĩ thống kê giữa 3 đa hình gen LRP5 Q89R,
Mối liên hệ giữa gen MTHFR C677T, FTO rs1121980 và loãng xương đã được nghiên cứu, cho thấy có sự liên quan đáng kể giữa chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực đối với tình trạng loãng xương.
Luận án tiến sĩ Y học
Mô hình hồi quy logistic đa biến được sử dụng để kiểm định mối liên quan giữa loãng xương cột sống thắt lưng với ba đa hình gen và các yếu tố nguy cơ khác Nghiên cứu này nhằm xác định ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và môi trường đến tình trạng loãng xương, từ đó cung cấp thông tin hữu ích cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh.
Các yếu tố nguy cơ OR 95% CI p
Béo phì > bình thường 0,24 0.13 – 0,43 0,000* Tiền sử hút thuốc (Có > Không) 1,07 0,67 – 1,72 0,783
Tiền sử gãy xương (Có > Không) 3,07 1,46 – 6,48 0,003*
Tĩnh tại > Cao 21,59 4,14 – 112,46 0,000* Ít > Cao 6,25 2,04– 19,14 0,001*
Kết quả từ bảng 3.30 chỉ ra rằng có mối tương quan thống kê đáng kể giữa hai đa hình gen LRP5 Q89R và FTO rs1121980 với chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực liên quan đến loãng xương tại vị trí đầu trên xương đùi (p0,05).
Luận án tiến sĩ Y học
BÀN LUẬN
Bàn luận về đặc điểm các đa hình gen LRP5 Q89R (rs41494349),
MTHFR C677T (rs1801133) và FTO rs1121980
Nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành trên 400 nam giới, trong đó có 200 người được chẩn đoán loãng xương và 200 người làm nhóm chứng có mật độ xương bình thường Các đối tượng được ghép cặp theo nhóm tuổi, như trình bày trong bảng 3.1 và 3.2 Tất cả đối tượng nghiên cứu đã tham gia phỏng vấn theo bộ câu hỏi thiết kế đồng nhất, đo mật độ xương, lấy mẫu xét nghiệm để loại trừ các bệnh lý liên quan, và xác định các đa hình kiểu gen Dữ liệu thu thập được đã được xử lý nhằm đánh giá các đặc điểm của đa hình đơn nucleotid của 3 gen.
Nghiên cứu về mối liên quan giữa các biến thể gen LRP5 Q89R (rs41494349), MTHFR C667T (rs1801133) và FTO rs1121980 với nguy cơ loãng xương ở nam giới đã được thực hiện DNA được thu thập từ mẫu máu toàn phần của các đối tượng nghiên cứu, nhằm xác định các đa hình đơn gen và hiểu rõ hơn về các yếu tố nguy cơ loãng xương trong nhóm đối tượng này.
Gen LRP5 Q89R (rs41494349), MTHFR C667T (rs1801133) và FTO rs1121980 được nghiên cứu Quy trình tách chiết DNA của chúng tôi áp dụng theo tiêu chuẩn Estonia, cho ra sản phẩm DNA đồng đều và có độ tinh sạch cao.
Luận án tiến sĩ Y học phẩm PCR được thực hiện bằng cách khuyếch đại với các cặp mồi đặc hiệu và chuẩn hóa quy trình Hai đa hình gen LRP5 Q89R (rs41494349) và FTO rs1121980 được xác định thông qua phương pháp cắt enzym giới hạn (RFLP - PCR) Sản phẩm phản ứng enzym cắt được điện di trên gel với nồng độ phù hợp, cho hình ảnh điện di rõ nét, giúp dễ dàng xác định các băng DNA dựa trên kích thước so với băng chuẩn Đặc biệt, đa hình gen MTHFR cũng được nghiên cứu trong luận án này.
Nghiên cứu về đa hình gen C677T (rs1801133) được thực hiện bằng phương pháp AMRS-PCR, cho thấy đây là hai phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và có độ tin cậy cao Kết quả phát hiện 8 kiểu gen của 3 đa hình gen: LRP5 Q89R (rs41494349) với các kiểu gen AA, AG, GG; MTHFR C677T (rs1801133) với các kiểu gen CC, CT, TT; và FTO rs1121980 với các kiểu gen GA, GG Chúng tôi đã kiểm tra và đối chiếu kết quả từ hai phương pháp này với kết quả giải trình tự gen, và nhận thấy có sự tương đồng hoàn toàn giữa hai phương pháp.
Ngày nay, các đa hình đơn gen, hay còn gọi là biến thể di truyền, được chứng minh có ảnh hưởng đến nhiều bệnh lý đa yếu tố, trong đó có loãng xương Với khoảng 10 triệu SNP trong bộ gen người, các nghiên cứu gần đây đã xác định 518 locus liên quan đến bệnh loãng xương và gãy xương trên toàn cầu Do đó, việc nghiên cứu tác động của các đa hình gen lên loãng xương ở nam giới là vô cùng cần thiết.
4.2.1 Bàn luận về phân bố tần số alen và kiểu gen của đa hình gen LRP5 Q89R rs41494349
Gen LRP5, nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể 11, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tái mô hình xương thông qua con đường tín hiệu Wnt Nhiều điểm đa hình trên gen này được cho là ảnh hưởng đến mật độ xương và nguy cơ gãy xương toàn cầu Các nghiên cứu về tác động của các đa hình gen LRP5 đã được công bố rộng rãi, đặc biệt là ở người da trắng và Châu Á.
Luận án tiến sĩ Y học cộng sự 122 đã thực hiện nghiên cứu phân tích gộp trên 19 nghiên cứu công bố, nhằm đánh giá ảnh hưởng của đa hình gen LRP5 lên MĐX Kết quả nghiên cứu đã phát hiện 22 SNP liên quan đến vấn đề này.
Trong nghiên cứu về đa hình gen tại Việt Nam, một số SNP thường gặp bao gồm rs3736228, rs4988321, rs41494349 (Q89R), rs2277268, rs556442, rs17149104, rs1157442, rs545382 và rs4988319 Tác giả Hồ Phạm Thục Lan đã tiến hành xác định đa hình gen LRP5 tại SNP rs3736228 và rs599083 ở Thành phố Hồ Chí Minh nhưng không tìm thấy mối liên quan với MĐX Đặc biệt, đa hình gen LRP5 Q89R (rs41494349) nằm trên exon thứ 2, với sự thay thế nucleotid A thành G tại vị trí 266, dẫn đến biến đổi acid amin từ Glutamin (Q) thành Arginin (R) ở vị trí 89 của protein LRP5, làm thay đổi cấu trúc β-propeller 1 Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đa hình gen Q89R có ảnh hưởng đến MĐX, thoái hóa cột sống và tăng huyết áp.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình gen
LRP5 Q89R (rs41494349) tuân theo định luật cân bằng Hardy Weinberg (p >
Phân bố kiểu gen và tỷ lệ alen của đa hình gen LRP5 rs41494349 cho thấy sự di truyền ổn định qua các thế hệ, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tiến hóa đặc biệt.
Trong nghiên cứu về tỷ lệ kiểu gen, nhóm bệnh cho thấy tỷ lệ kiểu gen AA cao nhất (86,0%), tiếp theo là kiểu gen AG (13,0%) và kiểu gen GG (1,0%) Trong khi đó, nhóm chứng có tỷ lệ kiểu gen AA chiếm ưu thế (94%), kiểu gen AG là 6,0%, và không có kiểu gen GG Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ kiểu gen AG và GG giữa hai nhóm, với tỷ lệ cao hơn ở nhóm bệnh so với nhóm chứng, điều này có ý nghĩa thống kê với p