BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOA NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH CỦA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN LOÃNG XƢƠNG Ở NAM GIỚI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO[.]
TỔNG QUAN
Đại cương về loãng xương
Theo tổ chức y tế thế giới WHO (1993) loãng xương được định nghĩa là
“một bệnh đặc trưng bởi MĐX thấp và tổn thương vi cấu trúc của xương gây ra tăng tính dễ gãy của xương hậu quả là tăng nguy cơ bị gãy xương” 5 Năm
2000 Viện Y học quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health) 6 đã đưa ra một định nghĩa khác về loãng xương dựa trên những đồng thuận cao của các chuyên gia: loãng xương là một rối loạn của xương đặc trưng bởi sự giảm sức mạnh của xương dẫn đến tăng nguy cơ gãy xương, trong đó sức mạnh của xương được đặc trưng bởi hai yếu tố chính: MĐX và chất lượng xương MĐX được tính bởi độ khoáng hóa của xương trên một đơn vị thể tích Chất lượng xương được đánh giá bởi các thông số: cấu tr c của xương, chu chuyển xương, độ khoáng hóa, tổn thương tích l y, tính chất của các chất cơ bản của xương. Trong đó chu chuyển xương giữ một vai trò quan trọng 7
1.1.2 Dịch tễ học loãng xương nam
* Trên thế giới: Tỷ lệ loãng xương nam khác nhau tùy theo từng nghiên cứu dao động từ 2-16% và tăng dần theo độ tuổi, tỷ lệ loãng xương của nam thường thấp hơn nữ từ 2-4 lần Nghiên cứu NHANES 2005–2006 8 được thực hiện bởi Trung tâm Thống kê Y tế Quốc gia Mỹ trên 3157 người Mỹ trưởng thành từ 50 tuổi trở lên được đo MĐX tại 2 vị trí cổ xương đùi và toàn bộ xương đùi, kết quả cho thấy 49% phụ nữ lớn tuổi và 30% đàn ông lớn tuổi bị giảm MĐX ở cổ xương đùi, tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ là 10% và tỷ lệ loãng xương nam là 2% Trong một nghiên cứu khác tại nước này tiến hành ở nam giới từ 69 đến 74 tuổi tỷ lệ loãng xương 10,2% 9 Ở Thụy Sĩ tỷ lệ loãng xương là 6,3% ở nam trong độ tuổi từ 50 - 80 tuổi, tỷ lệ này ở độ tuổi từ 80 - 84 là
16,6% 10 Ở một số nước Châu Á tỷ lệ loãng xương ở nữ c ng cao hơn nam tương tự như người da trắng Nghiên cứu tiến hành trên 7042 người độ tuổi từ
20 trở lên ở 10 trung tâm thuộc các tỉnh khác nhau ở Trung Quốc (2002-2006) cho kết quả tỷ lệ loãng xương ở nữ là 31,2 % và 10,4% ở nam giới trên 50 11 Tại Hồng Công tỷ lệ loãng xương cột sống thắt lưng ở nam là 7% ở nữ là 37%, tỷ lệ loãng xương ở cổ xương đùi ở nam là 6% và ở nữ là 16% 12,13 Ở Hàn Quốc tỷ lệ loãng xương là 35,5% ở nữ và 7,5% nam trên 50 tuổi 14
* Tại Việt Nam: Nghiên cứu của các tác giả ở hai miền Nam, Bắc đã cho thấy tỉ lệ loãng xương ở cả nam và nữ tương đương với một số nước châu Á và người da trắng 15,16 đặc biệt trên đối tượng người cao tuổi Theo số liệu của Nguyễn Thị Thanh Hương tại miền Bắc - Việt Nam nghiên cứu trên 222 nam giới và 612 nữ giới khỏe mạnh tuổi từ 13-83, tỷ lệ loãng xương vị trí cổ xương đùi ở nam giới là 9% và nữ giới là 17% 15 Nghiên cứu của tác giả Lê
D ng và cộng sự khảo sát trên 325 người cao tuổi tại Cần Thơ cho thấy tỷ lệ loãng xương nam giới trên 60 tuổi chiếm 17,5% 17 Nghiên cứu của tác giả Hồ Phạm Thục Lan và cộng sự trên 357 nam và 870 nữ tuổi từ 18 - 89 tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả tỷ lệ loãng xương nam là 10%, trong khi tỷ lệ loãng xương nữ là 30% 16 Như vậy, có thể thấy rằng loãng xương thực sự là bệnh phổ biến tại Việt Nam Hơn nữa bệnh thường tiến triển âm thầm, không có triệu chứng, phần lớn chỉ chẩn đoán sau khi có biểu hiện gãy xương trên lâm sàng Do vậy việc xác định sớm các yếu tố nguy cơ loãng xương để dự phòng là vô cùng cần thiết, đặc biệt đối tượng nam giới là nhóm đối tượng chưa được quan tâm nghiên cứu thích đáng.
Hiện nay, phương pháp tốt nhất để chẩn đoán loãng xương là đo mật độ khoáng xương bằng phương pháp hấp thụ tia X năng lượng kép (DXA - Dual energy X-ray Absorptiometry) 18,19 Mật độ xương là lượng chất khoáng của xương được chia cho diện tích vùng được khảo sát Cụ thể máy DXA ước tính khối lượng chất khoáng (bone mineralcontent – BMC), tính diện tích mà khối chất khoáng đó được đo, và lấy BMC chia cho diện tích Bởi vậy đơn vị đo lường MĐX đo bằng máy DXA là g/cm 2 Sau khi đo MĐX, để chẩn đoán loãng xương người ta so sánh MĐX hiện tại với giá trị MĐX trung bình của quần thể trong độ tuổi 20-40 (khối lượng xương đỉnh - KLXĐ) Kết quả của so sánh này là chỉ số T (T-score) Chỉ số T trong thực tế là số đo lệch chuẩn (SD-Standard Deviation) của MĐX hiện tại với KLXĐ.
Một người được chẩn đoán loãng xương nếu chỉ số T nhỏ hơn hoặc bằng -2,5, giảm mật độ xương nếu chỉ số T từ lớn hơn -2,5 đến dưới -1,0 và mật độ xương bình thường nếu chỉ số T là lớn hơn hoặc bằng -1,0 Mật độ xương đã được chứng minh là có liên quan đến sức mạnh của xương và là một công cụ dự báo tốt nhất nguy cơ gãy xương trong tương lai Do đó nguy cơ gãy xương tăng theo cấp số nhân khi MĐX giảm Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo cổ xương đùi là vùng giải phẫu quan trọng nhất để chẩn đoán loãng xương Tuy nhiên hướng dẫn của hiệp hội quốc tế và mật độ xương lâm sàng (ISCD) và Hội loãng xương Hoa Kỳ (NOF) đưa ra khuyến cáo: chẩn đoán loãng xương nên dựa trên phép đo mật độ xương tại ba vị trí là cổ xương đùi, đầu trên xương đùi và cột sống thắt lưng Ngoài ra MĐX tại vị trí một phần ba dưới xương quay có thể được áp dụng để chẩn đoán loãng xương nếu
3 vị trí trên không thể đo được 20
Cơ chế bệnh sinh loãng xương ở nam giới
Cơ chế sinh bệnh học của loãng xương nam giới rất phức tạp, có sự tham gia của nhiều yếu tố trong đó phải kể đến các yếu tố chính sau: Khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) đạt được, quá trình mất xương sau khi đạt đượcKLXĐ và loãng xương thứ phát Tỷ lệ loãng xương ở nam giới thường thấp hơn nữ giới do có sự khác biệt trong cả hai quá trình: hình thành KLXĐ và quá trình mất xương theo thời gian.
* Khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) hay sự trưởng thành của bộ xương
Khối lượng xương đỉnh được định nghĩa là khối lượng xương tối đa của mô xương đạt được khi kết th c giai đoạn trưởng thành KLXĐ có một vai trò rất quan trọng vì nó là một trong hai yếu tố cơ bản quyết định khối lượng xương của toàn bộ khung xương khi kết th c giai đoạn trưởng thành Bởi vậy KLXĐ c ng là một yếu tố ảnh hưởng đến loãng xương sau này Người có KLXĐ cao ở tuổi trưởng thành sẽ ít nguy cơ loãng xương hơn với người có KLXĐ thấp Trong quá trình tăng trưởng có sự khác biệt khá lớn về kích thước của khung xương và KLXĐ ở hai giới Tốc độ hình thành xương cao ở xung quanh tuổi dậy thì, hết tuổi dậy thì khối lượng xương đạt 80 - 90% so với khung xương trưởng thành 21,22 Dưới tác động nội tiết tố androgen, hormon tăng trưởng (GH) và yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF-1) làm cho kích thước khung xương ở nam giới trưởng thành lớn hơn nữ giới, điều này đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu 23,24 Theo Lawrence B Riggs nghiên cứu MĐX và diện tích xương ở 373 nữ và 323 nam tuổi từ 20-90 cho kết quả: Ở tuổi trưởng thành nam giới có diện tích xương lớn hơn 35- 42% so với phụ nữ 25 Mặt khác nam có KLXĐ cao hơn nữ, KLXĐ cổ xương đùi nam cao hơn nữ từ 12% - 14% tùy theo từng nghiên cứu 26,27 Ở Việt Nam theo nghiên cứu của Hồ Phạm Thục Lan và cộng sự cho thấy KLXĐ cổ xương đùi ở nam giới Việt Nam (0,85 ± 0,13 g/cm 2 ) cao hơn khoảng 6% so với nữ
(0,80± 0,11 g/cm 2 ), tương tự KLXĐ ở cột sống thắt lưng ở nam (1,05± 0,12 g/cm 2 ) cao hơn khoảng 9% so với nữ (0,96 ± 0,11 g/cm 2 ) 16 Ngoài ra sự khác biệt giữa nam và nữ còn ở cấu trúc xương: ở nam Testosteron tác động kích thích phát triển bề dày của vỏ xương, trong khi đó Estrogen ở nữ giới lại kích thích quá trình tạo xương xốp, ức chế quá trình tạo vỏ xương và màng xương;điều này tạo nên sự khác biệt lớn giữa cấu trúc và tính chịu lực của khung xương giữa nam và nữ làm cho xương ở nữ dễ gãy hơn nam 23,24,28
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành KLXĐ: yếu tố di truyền, chế độ tập luyện, cân nặng, vai trò của các hormone (GH-hormone tăng trưởng, hormone giới tính ), chế độ dinh dưỡng đủ canxi và vitamin D, môi trường và các yếu tố lối sống bao gồm cả thuốc lá, cà phê và uống rượu là những yếu tố ảnh hưởng đến kích cỡ và mật độ xương Trong đó yếu tố quan trọng nhất trong hình thành KLXĐ là yếu tố di truyền (chiếm 50 - 80% tùy từng nghiên cứu) 29 , yếu tố di truyền góp phần quy định kích thước, cấu trúc của xương đặc biệt ở tuổi dậy thì Nếu KLXĐ càng cao thì nguy cơ loãng xương sau này càng thấp.
* Lão hoá xương: Sau khi đạt được KLXĐ ở tuổi trưởng thành, quá trình mất xương bắt đầu diễn ra Quá trình mất xương theo tuổi tác hay còn gọi là quá trình lão hóa xương thể hiện ở hai khía cạnh: tốc độ mất xương và vị trí mất xương
- Tốc độ mất xương: Sau khi đạt KLXĐ thì quá trình mất xương ở vị trí xương xốp bắt đầu diễn ra ở cả hai giới Tốc độ mất xương trung bình ở cột sống thắt lưng là 0,84%/năm ở nam giới và 1,6% ở nữ giới trẻ tuổi 30 Không có quá trình mất xương ồ ạt như nữ giới sau mãn mà theo tuổi tác nam giới có sự giảm nồng độ hormon sinh dục (testosteron) do suy giảm hoạt động của trục dưới đồi - tuyến yên - sinh dục, làm mất dần cả xương vỏ và xương bè. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng quá trình mất xương ở nam giới diễn ra chậm hơn nữ, sau khi đạt KLXĐ quá trình mất xương diễn ra rất chậm chỉ đến khoảng trên 50 tuổi quá trình mất xương diễn ra mạnh mẽ hơn và chỉ thực sự có ý nghĩa sau tuổi 65 30 Tốc độ mất xương của nữ giới sau khi kết th c thời kỳ mãn kinh vẫn cao hơn nam giới Nghiên cứu của Hannan và cộng sự 31 tiến hành theo dõi tốc độ mất xương ở người cao tuổi (67 - 90) bằng đo MĐX sau
4 năm cho kết quả tốc độ mất xương trung bình của nữ (3,4 - 4,8%) cao hơn nam (0,2 - 3,6%) ở tất cả các vị trí Theo một nghiên cứu khác tiến hành trên
769 người trên 60 tuổi theo dõi trong vòng 2,5 năm cho thấy tốc độ mất xương ở cổ xương đùi là 0,82% một năm ở nam và 0,96% ở nữ 32
- Quá trình mất xương: Nếu như ở nữ giới quá trình mất xương bè diễn ra làm giảm nhiều số lượng của các bè xương thì ở nam giới dường như số lượng bè xương không thay đổi mà chủ yếu là mỏng dần các bè xương. Một nghiên cứu của Riggs và cộng sự (2008) khảo sát MĐX vỏ và xương bè bằng phương pháp chụp cắt lớp vi tính định lượng (pQCT) cho thấy quá trình giảm xương bè diễn ra ngay sau khi đạt được KLXĐ và cao điểm là ở phụ nữ sau thời kỳ mãn kinh, còn ở nam giới mất xương bè có ý nghĩa sau tuổi 65 và mất xương vỏ có ý nghĩa sau tuổi 75 30 Quá trình mất xương chịu tác động của nhiều yếu tố: yếu tố di truyền, tuổi, tình trạng thiếu hụt hormon, ít hoạt động thể lực, thiếu vitamin D và canxi, sử dụng thuốc glucocorticoid, hay mắc một số bệnh (cường cận giáp, suy thận, suy tuyến dưới đồi, COPD ) các yếu tố này làm tăng số lượng đơn vị chu chuyển xương trên bề mặt các bè xương, làm tăng tốc độ chu chuyển xương, mất cân bằng giữa hủy xương và tạo xương (hủy xương tăng lên), từ đó làm tăng tốc độ mất xương, giảm khối lượng xương (MĐX) và tăng tổn thương vi cấu tr c xương (tăng tính dễ gãy xương) dẫn đến loãng xương.
Như vậy sự khác nhau về cơ bản giữa cấu trúc xương giữa nam và nữ ở tuổi trưởng thành và quá trình lão hóa của bộ xương làm cho khả năng chịu lực của bộ xương của nam tốt hơn của nữ, điều này lý giải tỷ lệ loãng xương và gãy xương ở nam giới thấp hơn ở nữ giới.
Đa hình đơn nucleotide
1.3.1 Khái niệm về đa hình đơn
Theo Viện Sức khoẻ Quốc gia Hoa Kỳ (NIH), single nucleotid polymorphisms, thường được gọi là SNPs (phát âm là "Snips"), là loại biến đổi di truyền phổ biến nhất của người Mỗi SNP đại diện cho một sự khác biệt chỉ ở một đơn vị cấu tạo duy nhất của DNA là nucleotid Ví dụ, một SNP có thể có sự thay thế nucleotid cytosin (C) với thymin (T) trong một đoạn nào đó của DNA (Hình 1.2) Sự xuất hiện của SNPs là hiện tượng phổ biến trong toàn bộ chuỗi DNA của một người Nguyên nhân hình thành nên các SNPs có thể do tác động của chọn lọc tự nhiên, hệ gen của người tự biến đổi và sửa chữa để thích nghi với môi trường sống Qua quá trình tiến hóa và chọn lọc, những biến thể có khả năng thích nghi sẽ xuất hiện với tần số ổn định trong một quần thể nào đó Tập hợp các điểm đa hình trên một gen được gọi là tính đa hình của gen Tuy nhiên không phải tất cả sự biến đổi nucleotid đơn đều là SNP Để được xếp loại là SNP, sự thay đổi một nucleotid phải được xuất hiện với tần suất từ 1% trở lên trong quần thể 33 Khoảng 325 triệu SNP đã được xác định trong bộ gen người, 15 triệu trong số đó hiện diện với tần số 1% hoặc cao hơn trong các quần thể khác nhau trên toàn thế giới 34 Những biến thể này thường được tìm thấy trong đoạn DNA giữa các gen, ở vùng không mã hoá do đó SNPs ít ảnh hưởng đến chức năng của protein hay làm thay đổi kiểu hình Tuy nhiên, đây có thể là những dấu ấn sinh học giúp các nhà khoa học xác định vị trí các gen có liên quan với bệnh Khi SNPs xuất hiện trong một gen hoặc tại khu vực điều khiển của gen, nó có thể ảnh hưởng đến chức năng của gen, dẫn đến có vai trò đối với một bệnh lý cụ thể liên quan đến gen đó Hầu hết các SNPs không có ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc sự phát triển của cơ thể Bên cạnh đó, một số SNPs đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của cơ thể Nhiều nghiên cứu đã tìm thấySNPs có thể giúp dự đoán phản ứng của một cá nhân với các loại thuốc nhất định, sự nhạy cảm với các yếu tố môi trường như độc tố và nguy cơ phát triển một bệnh cụ thể SNPs c ng có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền gen bệnh trong gia đình Hướng nghiên cứu mới của nền y học hiện nay là xác định mối liên quan của SNPs với các bệnh lý đa yếu tố như bệnh loãng xương, tim mạch, tiểu đường và ung thư từ đó hướng tới phát triển nền y học cá thể hoá trong chẩn đoán và điều trị.
Hình 1.1 Đa hình nucleotid đơn (Nguồn: https://link.springer.com/article/10.1007/s11356-022-19981-7) 1.3.2 Các loại SNPs
Dựa vào vị trí, SNPs được phân chia thành 2 loại chính 33 :
- SNPs liên kết (còn gọi là SNPs chỉ thị) không nằm trong gen và không ảnh hưởng đến chức năng tổng hợp protein của gen Mặc dù vậy, SNPs được phát hiện thường nằm gần gen liên quan đến một bệnh nào đó nên có thể sử dụng SNPs như dấu hiệu sinh học để xác định bệnh hoặc gen bệnh.
- SNPs nằm trong gen là nguyên nhân ảnh hưởng đến chức năng của protein, liên quan đến bệnh hay ảnh hưởng đến sự đáp ứng với thuốc điều trị, bao gồm:
SNPs mã hoá nằm trên vùng mã hoá của gen dẫn đến sự thay đổi acid amin của protein do gen đó mã hoá.
SNPs không mã hóa nằm trong vùng điều hoà của gen có thể dẫn đến thay đổi mức độ biểu hiện gen thông qua mức độ RNA và protein.
1.3.3 Vai trò và ứng dụng của SNPs trong Y học
Các biến thể trong trình tự DNA của con người có thể ảnh hưởng đến cách cơ thể phát triển bệnh, cách cơ thể đáp ứng với các tác nhân gây bệnh,các hóa chất, thuốc, vaccin và các loại tác nhân khác Các SNP được cho là chìa khóa tiềm năng trong việc thực hiện cá thể hoá trong y học Một SNP đơn có thể là nguyên nhân gây ra một bệnh di truyền Đối với các bệnh phức tạp, các SNP thường không hoạt động đơn lẻ mà chúng kết hợp với các SNP khác và tương tác với điều kiện môi trường để biểu hiện một tình trạng bệnh lý Vai trò quan trọng nhất của các SNP trong các nghiên cứu y học là sử dụng để so sánh các vùng của hệ gen giữa các nhóm người (có thể là giữa bệnh nhân và người khỏe mạnh) trong các nghiên cứu ở mức toàn bộ hệ gen (genome-wide association studies - GWAS) Các nghiên cứu tương quan toàn hệ gen (GWAS) đã cho phép phát hiện nhiều SNP có tác động đến một số bệnh lý đa yếu tố như đái tháo đường, tăng huyết áp, bệnh lý loãng xương, béo phì Các nghiên cứu tiến hành trên các cơ sở dữ liệu bộ gen của các quần thể đã không chỉ phát hiện được những biến thể di truyền và bệnh di truyền mà còn đưa ra các gợi ý để tiến hành các nghiên cứu nhằm tìm ra cách phòng ngừa và chữa bệnh trong tương lai không xa.
1.3.4 Một số phương pháp xác định kiểu gen của đa hình đơn nucleotid 35
Một trong những thách thức lớn của sinh học phân tử hiện đại là tìm hiểu về sự khác biệt giữa các loài hay giữa các cá thể trong loài về sự mã hóa trong hệ gen Đa hình đơn nucleotid (SNP) được biết là sự xuất hiện chủ yếu trong sự đa dạng về kiểu gen Trên 80% các đa hình đã biết tạo lên sự khác biệt giữa các cá thể trong 1 loài Các đa hình đơn nucleotid được cho là có vai trò trong sự khác biệt về hiệu quả khi điều trị thuốc c ng như tác động của môi trường sống đến mỗi cá nhân Do vậy kiểu gen của các SNP là một biến quan trọng trong các nghiên cứu tương tác giữa môi trường và hệ gen trong quá trình hình thành bệnh ở người Cho đến nay đã có nhiều phương pháp kỹ thuật xác định kiểu gen của SNP Trong chuyên đề này, tôi chỉ trình bày một vài phương pháp kĩ thuật chính thường được sử dụng trong các phòng xét nghiệm di truyền.
1.3.4.1 Phương pháp ARMS–PCR (Amplification refractory mutation system) 36
ARMS – PCR (Amplification refractory mutation system) là một ứng dụng của PCR trong đó DNA được khuếch đại bằng các alen mồi tương ứng đặc hiệu ARMS – PCR là phương pháp rất hữu ích cho việc xác định các đột biến điểm hoặc đa hình Nó c ng là phương pháp quan trọng để xác định kiểu gen trong DNA là đồng hợp hay dị hợp Dị hợp tử hoặc đồng hợp tử được phân biệt bằng cách sử dụng ARMS mồi cho alen đột biến (Mutation) và bình thường (Wild type) Các phản ứng cho alen đột biến và các alen bình thường được thực hiện trong ống riêng biệt Trong phương pháp này giếng 1 sử dụng cặp mồi F (Forward primer) và Rw (Reverse wild type), giếng 2 sử dụng cặp mồi F và Rm (Reverse mutation) Sự xuất hiện của sản phẩm đặc hiệu ở cả hai giếng là kiểu gen dị hợp tử, nếu chỉ xuất hiện ở giếng thứ 1 là đồng hợp tử bình thường, nếu chỉ xuất hiện ở giếng thứ 2 là đồng hợp tử đột biến.
* Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp: ARMS-PCR là phương pháp có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản và giá thành rẻ, được áp dụng rộng rãi trong các labo sinh học phân tử ở Việt Nam Áp dụng được cho tất cả các SNP mà không cần phải có điểm cắt Vì vậy trong phạm vi của đề tài này ch ng tôi sử dụng phương pháp ARMS-PCR cho xác định đa hình gen
1.3.4.2 Phương pháp cắt enzym giới hạn (RFLP-PCR: Restriction Fragment Length Polymorphisms- Polymerase Chain Reaction) 37
Phương pháp PRFP-PCR là phương pháp nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt của các enzym giới hạn(Restriction Enzym, RE) Nói cách khác, đây là phương pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu bằng một enzym giới hạn nhằm tìm hiểu xem có hay không đột biến điểm (mất hay xuất hiện một vị trí giới hạn mới) hoặc có hay không sự thay đổi một trình tự DNA Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước thì sẽ có sự giống nhau về các băng DNA sau khi chạy điện di Ngược lại nếu có sự xuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA Quá trình thực hiện kĩ thuật RFLP- PCR gồm các giai đoạn sau 38 :
- Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để khuyếch đại đoạn DNA chứa SNP cần phân tích.
- Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzym giới hạn thích hợp.
- Điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận
Enzym giới hạn: Enzym giới hạn (hay enzym cắt) - là một enzym quan trọng trong các enzym endonuclease tác động lên phân tử DNA và có đặc điểm là cắt DNA ở những vị trí xác định Cho đến nay người ta đã biết khoảng trên 500 loại enzym giới hạn khác nhau Đặc điểm chung của các loại enzym giới hạn:
- Đều được chiết tách từ vi khuẩn và tên enzym mang tên của vi khuẩn.
- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu (hay còn gọi là vị trí giới hạn, trình tự giới hạn) với từng loại enzym.
-Vị trí cắt thường có 4-8 nucleotid, đặc trưng quan trọng nhất của trình tự giới hạn là đoạn DNA gồm 4-8 cặp nucleotid này có trình tự giống nhau khi đọc theo chiều 3’-5’ và 5’-3’ Vì vậy, vị trí cắt của enzym giống nhau trên cả 2 mạch.
- Sau khi cùng bị cắt với cùng loại enzym giới hạn, các sợi đơn DNA có các đầu kết dính với các nucleotid bổ sung cho nhau 39 Điện di DNA: Acid nucleotid là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường có điện thế và cường độ thích hợp, DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương của điện trường Để kiểm tra và xác định tính chất của DNA, cần điện di DNA trên gel Phân tử DNA càng nhỏ di động càng nhanh Có 2 loại gel được sử dụng để điện di DNA đó là gel polyacrylamid và gel agarose, trong nghiên cứu này ch ng tôi sử dụng gel agarose Tùy theo chiều dài của sản phẩm mà lựa chọn nồng độ gel thích hợp, thường dao động trong khoảng 0,8- 3% Để quan sát hình ảnh DNA khi điện di, người ta nhuộm DNA bằng Redsafe hoặc Ethidium bromide, dưới ánh sáng tử ngoại, DNA gắn với Redsafe/ Ethidium bromide sẽ phát sáng Khi cho chạy điện di DNA nghiên cứu thường có DNA mẫu (marker) cùng chạy để so sánh, xác định kích thước của đoạn DNA 38
* Ưu điểm của phương pháp: RFLP-PCR là phương pháp có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản dễ thực hiện, không yêu cầu nhiều về trang thiết bị phức tạp, được áp dụng rộng rãi trong các labo sinh học phân tử ở Việt Nam. Tuy nhiên, không phải tất cả các SNP đều có thể có sẵn enzym cắt đặc hiệu. Hơn nữa, phương pháp này c ng đòi hỏi thời gian vì trong quá trình thực hiện phải tiến hành điện di 2 lần Bởi vậy, trong phạm vi của đề tài này ch ng tôi sử dụng phương pháp RFLP-PCR cho xác định 2 đa hình gen LRP5Q89R và
FTO rs1121980 Sau đó kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen.
Phương pháp này c ng dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR, trong đó sử dụng 1 mồi xuôi và 1 mồi ngược để khuếch đại đoạn ADN chứa SNP cần nghiên cứu, đồng thời sử dụng 2 probe có gắn huỳnh quang phát hiện đặc hiệu cho từng alen của SNP Tại vị trí đầu 5’, 1 probe được gắn chất nhuộm phát huỳnh quang VIC để phát hiện “alen 1”, probe còn lại gắn chất nhuộm phát huỳnh quang 6 FAM (6 carboxyfluorescein) để phát hiện “alen 2” Tại mỗi đầu của probe có gắn chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang Trong quá trình xảy ra phản ứng, các probe phát hiện các allen cùng với các mồi xuôi hoặc ngược tạo ra các sản phẩm đặc hiệu tương ứng với tín hiệu huỳnh quang đặc trưng cho mỗi alen, qua đó xác định được kiểu gen của SNP.
Phương pháp Taqman xác định kiểu gen của SNP có độ chính xác cao tuy nhiên khi thực hiện cần có vật liệu và thiết bị đắt tiền, do vậy sẽ khó áp dụng kĩ thuật này rộng rãi ở các phòng thí nghiệm.
1.3.4.4 Phương pháp giải trình tự gen
Phương pháp giải trình tự gen được coi là tiêu chuẩn vàng cho việc xác định kiểu gen vì ch ng có độ tin cậy và chính xác cao Giải trình tự gen cho phép xác định kiểu gen của nhiều SNP c ng như trình tự xung quanh SNP. Thực hiện kĩ thuật này đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, cần có nhân viên có kinh nghiệm và được huấn luyện, hơn nữa vật tư tiêu hao thường có giá thành cao Do vậy trong nghiên cứu của ch ng tôi chỉ ứng dụng để kiểm định lại tính chính xác của 2 phương pháp RFLP-PCR và ARMS-PCR
1.4 Vai trò của gen MTHFR , LRP5 và FTO đối với loãng xương và gãy xương
1.4.1 Vai trò của gen nói chung đối với loãng xương
Một số nghiên cứu lâm sàng về gen LRP5 Q89R (rs41494349) ,
MTHFR C677T (rs1801133) , FTO rs1121980 liên quan với loãng xương và gãy xương ở nam giới
1.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới
Các nghiên cứu trên thế giới về tác động của 3 đa hình gen nghiên cứu
LRP5 Q89R (rs41494349), MTHFR C677T (rs1801133) và FTO rs1121980 với mật độ xương và gãy xương chủ yếu tập trung trên đối tượng nữ giới Các nghiên cứu trên đối tượng nam giới và đặc biệt trên đối tượng người Châu Á còn chưa thực sự nhiều và cho kết quả không đồng nhất giữa các nghiên cứu.
* LRP5 Q89R (rs41494349): Đa hình gen Q89R rs41494349 là đa hình gen phát hiện chủ yếu trên người Châu Á Đa số các nghiên cứu về đa hình gen này trên đối tượng người Hàn Quốc, Trung Quốc đều cho kết quả người mang alen G có mật độ xương thấp hơn người mang alen A.
Nghiên cứu của Koh (2004) 80 trên 219 nam giới Hàn Quốc tuổi từ 20-
34, nhằm xác định mối liên quan giữa 6 SNP của LRP5 với mật độ xương:Q89R, A400V, V667M, R1036Q, A1525V, A1330V, N74N Tác giả thấy rằng đa hình gen LRP5 Q89R có làm giảm MĐX cổ xương đùi và tam giácWard (p=0,004 và Bình thường 4,08 1,30 – 12,79 0,016 Chỉ số
Béo phì > Bình thường 0,22 0,12 – 0,41 0,000 Tiền sử hút thuốc (Có>không) 1,02 0,64 – 1,63 0,94
Tiền sử gãy xương (Có>không) 3,84 1,74 – 8,46 0,001 Hoạt Tĩnh tại > Cao 27,81 5,16 – 150,02 0,000 động Ít > Cao 6,94 2,34 – 20,53 0,000 thể lực Trung bình > Cao 5,3 1,89 – 15,30 0,002
Nhận xét: Kết quả bảng 3.27 cho thấy có mối tương quan có ý nghĩa thống kê giữa đa hình 3 gen LRP5 Q89R, MTHFR C677T và FTO rs1121980, BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực với loãng xương, trong đó 3 đa hình gen LRP5 Q89R, MTHFR C677T và FTO rs1121980 làm tăng nguy cơ loãng xương độc lập với các yếu tố nguy cơ khác (OR: 3,45; 1,65 và 2,17 tương ứng) (p0,05).
Bảng 3.28 Mô hình hồi quy logistic đa biến kiểm định mối liên quan giữa loãng xương cổ xương đùi với
3 đa hình gen và các yếu tố nguy cơ khác
Các yếu tố nguy cơ OR 95% CI p
Thiếu cân > bình thường 7,27 1,30 – 12,79 0,002 Chỉ sốBMI Thừa cân > bình thường 0,59 0,30 – 1,14 0,119
Béo phì > bình thường 0,20 0,09 – 0,48 0,000 Tiền sử hút thuốc (Có>không) 1,09 0,61 – 1,95 0,782
Tiền sử gãy xương (Có>không) 1,26 0,52 – 3,1 0,60
Hoạt Tĩnh tại > cao 48,45 6,24 – 356,64 0,000 động thể Ít > cao 6,07 1,36 – 25,92 0,018 lực Trung bình > cao 4,59 1,06 – 18,93 0,041
Nhận xét: Kết quả bảng 3.28 cho thấy tại vị trí cổ xương đùi cả 3 đa hình gen
LRP5 Q89R, MTHFR C677T, FTO rs1121980 làm tăng nguy cơ loãng xương độc lập với các yếu tố nguy cơ khác (OR lần lượt là: 2,59; 2,5 và 1,82) Chỉ sốBMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực có mối liên quan với loãng xương (p Bình thường 29,24 3,07 – 278,31 0,003* Chỉ số
Tiền sử hút thuốc (Có> Không) 0,7 0,13 – 3,69 0,68
Tiền sử gãy xương (Có> Không) 9,5 1,41 – 63,9 0,02*
Hoạt Tĩnh tại > Cao - - - động Ít > Cao 0,08 0,005 – 1,34 0,079 thể lực
Nhận xét: Kết quả bảng 3.29 cho thấy ở vị trí đầu trên xương đùi, không tìm thấy mối liên quan có ý nghĩ thống kê giữa 3 đa hình gen LRP5 Q89R,
MTHFR C677T, FTO rs1121980 với loãng xương Tìm thấy mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực với loãng xương.
Bảng 3.30 Mô hình hồi quy logistic đa biến kiểm định mối liên quan giữa loãng xương cột sống thắt lưng với 3 đa hình gen và các yếu tố nguy cơ khác
Các yếu tố nguy cơ OR 95% CI p
Thiếu cân > Bình thường 3,9 1,33 – 11,41 0,013* Chỉ số Thừa cân > Bình thường 0,4 0,23 – 0,70 0,001* BMI Béo phì > bình thường 0,24 0.13 – 0,43 0,000*
Tiền sử hút thuốc (Có > Không) 1,07 0,67 – 1,72 0,783
Tiền sử gãy xương (Có > Không) 3,07 1,46 – 6,48 0,003* Hoạt Tĩnh tại > Cao 21,59 4,14 – 112,46 0,000* động thể Ít > Cao 6,25 2,04– 19,14 0,001* lực Trung bình > Cao 4,9 1,66 – 14,37 0,004*
Nhận xét: Kết quả bảng 3.30 cho thấy có mối tương quan có ý nghĩa thống kê giữa 2 đa hình gen (LRP5 Q89R, FTO rs1121980), chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực với loãng xương tại vị trí đầu trên xương đùi (p0,05).
BÀN LUẬN
Bàn luận về đặc điểm các đa hình gen LRP5 Q89R ( rs41494349) ,
MTHFR C677T (rs1801133) và FTO rs1121980
Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện trên 400 đối tượng nam giới trong đó 200 đối tượng được chẩn đoán loãng xương và 200 đối tượng MĐX bình thường làm đối chứng Các đối tượng nghiên cứu được ghép cặp về nhóm tuổi được trình bày ở bảng 3.1 và 3.2 Tất cả các đối tượng nghiên cứu được tiến hành phỏng vấn theo bộ câu hỏi thiết kế giống nhau, đo MĐX, lấy mẫu xét nghiệm để loại trừ những bệnh lý liên quan, xác định các đa hình kiểu gen và được xử lý số liệu để đánh giá đặc điểm các đa hình đơn nucleotid của 3 gen
LRP5 Q89R (rs41494349), MTHFR C667T (rs1801133), FTO rs1121980 ở nam giới loãng xương và tìm hiểu mối liên quan của chúng với các yếu tố nguy cơ loãng xương ở nam giới theo sơ đồ nghiên cứu (trang 50) DNA được thu thập từ mẫu máu toàn phần của các đối tượng nghiên cứu là nguyên liệu để thực hiện các bước tiếp theo của quy trình xác định các đa hình đơn gen
LRP5 Q89R (rs41494349), MTHFR C667T (rs1801133), FTO rs1121980.
Quy trình tách chiết DNA của ch ng tôi được thực hiện theo quy trình Estonia,sản phẩm DNA thu được khá đồng đều và độ tinh sạch cao Sản phẩm PCR thu được sau khi khuyếch đại bằng các cặp mồi đặc hiệu và chuẩn hóa quy trình Hai đa hình gen LRP5 Q89R (rs41494349) và FTO rs1121980 được xác định bằng phương pháp cắt enzym giới hạn (RFLP - PCR) Sản phẩm sau khi thực hiện phản ứng enzym cắt được điện di trên các gel có nồng độ tương ứng thu được hình ảnh điện di rõ nét, dễ dàng xác định các băng DNA thông qua kích thước so với kích thước băng chuẩn Đa hình gen
MTHFR C677T (rs1801133) được thực hiện theo phương pháp AMRS-PCR, đây là hai phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và có độ tin cậy cao Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phát hiện 8 kiểu gen của 3 đa hình gen (AA, AG,
GG của LRP5 Q89R (rs41494349), CC, CT, TT của MTHFR C677T (rs1801133) và GA,GG của FTO rs1121980, ch ng tôi đã kiểm tra đối chiếu lại kết quả được thực hiện bằng 2 phương pháp trên với kết quả giải trình tự gen cho thấy có sự tương đồng hoàn toàn giữa 2 phương pháp.
Ngày nay người ta thấy rằng các đa hình đơn gen có tác động đến nhiều bệnh lý đa yếu tố, các đa hình đơn gen là các biến thể di truyền, có khoảng 10 triệu SNP trong bộ gen của người Các nghiên cứu gần đây chỉ ra 518 locus liên quan đến MĐX và gãy xương trên thế giới 4 Do vậy việc tìm hiểu các đa hình gen tác động lên loãng xương nam là cần thiết.
4.2.1 Bàn luận về phân bố tần số alen và kiểu gen của đa hình gen LRP5 Q89R rs41494349
LRP5 là một gen nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể 11, gen này đã được biết đến về ảnh hưởng của nó đến MĐX thông qua con đường tín hiệuWnt, đây là con đường tín hiệu quan trọng liên quan đến quá trình hoạt hóa hoạt động tái mô hình xương (bone remodeling) Có nhiều điểm đa hình trên gen LRP5 được cho là ảnh hưởng đến mật độ xương và gãy xương trên thế giới Các nghiên cứu về ảnh hưởng của các đa hình gen LRP5 được công bố khá nhiều trên cả người da trắng và Châu Á Tác giả Trần Thị Ngọc Bích và cộng sự 122 tiến hành nghiên cứu phân tích gộp trên 19 nghiên cứu công bố về ảnh hưởng của đa hình gen LRP5 lên MĐX đã tìm thấy 22 SNP trong đó có
10 SNP thường gặp: rs3736228, rs4988321, rs41494349 (Q89R), rs2277268, rs4988321, rs556442, rs17149104, rs1157442, rs545382, rs4988319 Tại Việt Nam còn rất ít các nghiên cứu trên đa hình gen này, nghiên cứu tại Việt Nam tác giả Hồ Phạm Thục Lan 99 tiến hành xác định đa hình gen LRP5 tại SNP rs3736228 và rs599083 ở Thành phố Hồ Chí Minh không tìm thấy mối liên quan của đa hình gen này với MĐX. Đa hình gen LRP5 Q89R rs41494349 nằm trên exon thứ 2, có sự thay thế nucleotid A ở vị trí 266 thành G dẫn tới sự biến đổi acid amin Glutamin (Q) thành Arginin (R) ở vị trí 89 của protein LRP5 làm thay đổi phần cánh quạt đầu tiên trên phân tử Protein LRP5 (β-propeller 1) (hình 1.4) Nhiều nghiên cứu cho thấy đa hình gen Q89R ảnh hưởng đến MĐX, thoái hóa cột sống và tăng huyết áp.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình gen
LRP5 Q89R (rs41494349) tuân theo định luật cân bằng Hardy Weinberg (p >
0,05) Điều này chứng tỏ phân bố kiểu gen và tỷ lệ alen của đa hình gen LRP5 rs41494349 được di truyền ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố đặc biệt liên quan đến quá trình tiến hóa.
* Về tỷ lệ kiểu gen: Ở nhóm bệnh, tỷ lệ kiểu gen AA cao nhất, sau đó đến kiểu gen AG và GG, lần lượt là 86,0%, 13,0% và 1,0% Ở nhóm chứng, tỉ lệ kiểu gen chiếm nhiều nhất là kiểu gen AA với 94%, kiểu gen AG chiếm 6,0%, không có sự xuất hiện của kiểu gen GG Như vậy theo nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự phân bố kiểu gen AG và GG có sự khác biệt giữa 2 nhóm bệnh và chứng, theo đó tỷ lệ của 2 kiểu gen này cao hơn ở nhóm bệnh so với nhóm chứng, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p
