T Ổ NG QUAN
Đại cương về loãng xương
Loãng xương, theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 1993, là bệnh lý đặc trưng bởi mật độ xương (MĐX) thấp và tổn thương vi cấu trúc của xương, dẫn đến tăng nguy cơ gãy xương Năm 2000, Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ đã đưa ra định nghĩa khác, cho rằng loãng xương là rối loạn xương do giảm sức mạnh của xương, làm gia tăng nguy cơ gãy xương Sức mạnh xương được xác định bởi hai yếu tố chính: mật độ khoáng của xương trên một đơn vị thể tích và chất lượng xương, trong đó chất lượng xương được đánh giá qua cấu trúc, chu chuyển, độ khoáng hóa, tổn thương tích lũy và tính chất của các chất cơ bản Chu chuyển xương đóng vai trò quan trọng trong việc xác định sức mạnh xương.
1.1.2 Dịch tễ học loãng xương nam
Tỷ lệ loãng xương ở nam giới trên thế giới dao động từ 2-16% và tăng theo độ tuổi, thường thấp hơn nữ giới từ 2-4 lần Nghiên cứu NHANES 2005–2006 cho thấy 49% phụ nữ và 30% đàn ông từ 50 tuổi trở lên bị giảm mật độ xương ở cổ xương đùi, với tỷ lệ loãng xương là 10% ở nữ và 2% ở nam Một nghiên cứu khác cho thấy tỷ lệ loãng xương ở nam giới từ 69 đến 74 tuổi là 10,2% Tại Thụy Sĩ, tỷ lệ loãng xương ở nam giới từ 50-80 tuổi là 6,3%, và tăng cao hơn ở nhóm tuổi 80-84.
16,6% 10 Ở một số nước Châu Á tỷ lệ loãng xương ở nữ c ng cao hơn nam tương tự như người da trắng Nghiên cứu tiến hành trên 7042 người độ tuổi từ
Từ năm 2002 đến 2006, nghiên cứu tại 10 trung tâm ở các tỉnh Trung Quốc cho thấy tỷ lệ loãng xương ở nữ giới trên 50 tuổi đạt 31,2%, trong khi ở nam giới chỉ là 10,4% Tại Hồng Kông, tỷ lệ loãng xương cột sống thắt lưng ở nam giới là 7% và ở nữ giới là 37%, trong khi tỷ lệ loãng xương ở cổ xương đùi là 6% cho nam và 16% cho nữ Tại Hàn Quốc, tỷ lệ loãng xương ở nữ giới trên 50 tuổi là 35,5%, còn ở nam giới chỉ đạt 7,5%.
Nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy tỷ lệ loãng xương ở cả nam và nữ tương đương với một số nước châu Á và người da trắng, đặc biệt ở người cao tuổi Theo số liệu của Nguyễn Thị Thanh Hương tại miền Bắc, trong nghiên cứu trên 222 nam giới và 612 nữ giới khỏe mạnh từ 13-83 tuổi, tỷ lệ loãng xương tại vị trí cổ xương đùi là 9% ở nam giới và 17% ở nữ giới.
Nghiên cứu của D ng và cộng sự trên 325 người cao tuổi tại Cần Thơ cho thấy tỷ lệ loãng xương ở nam giới trên 60 tuổi đạt 17,5% Tương tự, nghiên cứu của Hồ Phạm Thục Lan và cộng sự tại Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ loãng xương ở nam giới là 10%, trong khi ở nữ giới là 30% Điều này cho thấy loãng xương là bệnh phổ biến tại Việt Nam, thường tiến triển âm thầm và không có triệu chứng rõ ràng, dẫn đến việc chẩn đoán chỉ xảy ra sau khi có gãy xương Do đó, việc xác định sớm các yếu tố nguy cơ loãng xương, đặc biệt là ở nam giới, là rất cần thiết để phòng ngừa bệnh.
Phương pháp chẩn đoán loãng xương hiệu quả nhất hiện nay là đo mật độ khoáng xương bằng DXA (Dual Energy X-ray Absorptiometry) Mật độ xương được xác định bằng cách chia lượng chất khoáng của xương cho diện tích vùng khảo sát Máy DXA ước tính khối lượng chất khoáng (BMC) và tính diện tích đo, từ đó cho ra kết quả MĐX với đơn vị g/cm² Để chẩn đoán loãng xương, MĐX hiện tại được so sánh với giá trị MĐX trung bình của quần thể từ 20-40 tuổi, gọi là khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) Kết quả so sánh này tạo ra chỉ số T (T-score), phản ánh độ lệch chuẩn (SD) của MĐX hiện tại so với KLXĐ.
Người được chẩn đoán loãng xương có chỉ số T nhỏ hơn hoặc bằng -2,5, trong khi chỉ số T từ -2,5 đến dưới -1,0 cho thấy giảm mật độ xương, và chỉ số T lớn hơn hoặc bằng -1,0 cho thấy mật độ xương bình thường Mật độ xương liên quan chặt chẽ đến sức mạnh của xương và là chỉ số dự đoán nguy cơ gãy xương hiệu quả Nguy cơ gãy xương tăng lên đáng kể khi mật độ xương giảm Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo cổ xương đùi là khu vực chính để chẩn đoán loãng xương, nhưng các hướng dẫn từ Hiệp hội quốc tế về mật độ xương lâm sàng (ISCD) và Hội loãng xương Hoa Kỳ (NOF) khuyến nghị chẩn đoán nên dựa trên phép đo mật độ xương tại ba vị trí: cổ xương đùi, đầu trên xương đùi và cột sống thắt lưng Mật độ xương tại vị trí một phần ba dưới xương quay cũng có thể được sử dụng để chẩn đoán loãng xương.
3 vị trí trên không thể đo được 20
Cơ chế bệnh sinh loãng xương ở nam giới
Cơ chế sinh bệnh học của loãng xương ở nam giới rất phức tạp, liên quan đến nhiều yếu tố quan trọng như khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) và quá trình mất xương sau khi đạt được KLXĐ Tỷ lệ loãng xương ở nam giới thường thấp hơn nữ giới do sự khác biệt trong cả quá trình hình thành KLXĐ và quá trình mất xương theo thời gian.
* Khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) hay sựtrưởng thành của bộxương
Khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) là khối lượng tối đa của mô xương đạt được khi kết thúc giai đoạn trưởng thành, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định khối lượng xương toàn bộ khung xương và ảnh hưởng đến nguy cơ loãng xương sau này Người có KLXĐ cao ở tuổi trưởng thành có nguy cơ loãng xương thấp hơn so với người có KLXĐ thấp Trong quá trình tăng trưởng, kích thước khung xương và KLXĐ có sự khác biệt rõ rệt giữa hai giới, với tốc độ hình thành xương cao nhất ở tuổi dậy thì Nghiên cứu cho thấy nam giới có diện tích xương lớn hơn 35-42% so với nữ giới và KLXĐ cổ xương đùi nam cao hơn nữ từ 12%-14% Tại Việt Nam, KLXĐ cổ xương đùi ở nam giới cao hơn khoảng 6% so với nữ, trong khi KLXĐ ở cột sống thắt lưng cũng cao hơn khoảng 9% Sự khác biệt giữa nam và nữ còn thể hiện ở cấu trúc xương: Testosteron kích thích phát triển bề dày của vỏ xương ở nam, trong khi Estrogen ở nữ thúc đẩy quá trình tạo xương xốp, làm cho xương nữ dễ gãy hơn.
Sự hình thành khối lượng xương đỉnh (KLXĐ) chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố, bao gồm di truyền, chế độ tập luyện, cân nặng, hormone như hormone tăng trưởng và hormone giới tính, dinh dưỡng với đủ canxi và vitamin D, cùng với môi trường và lối sống như thuốc lá, cà phê và rượu Trong đó, di truyền là yếu tố quan trọng nhất, chiếm từ 50 đến 80% ảnh hưởng, đặc biệt trong giai đoạn dậy thì, khi nó quyết định kích thước và cấu trúc xương KLXĐ cao giúp giảm nguy cơ loãng xương trong tương lai.
Lão hóa xương là quá trình tự nhiên bắt đầu sau khi cơ thể đạt đến khối lượng xương tối đa (KLXĐ) ở tuổi trưởng thành Quá trình này diễn ra với tốc độ và vị trí mất xương khác nhau theo độ tuổi Tốc độ mất xương có thể gia tăng theo thời gian, ảnh hưởng đến sức khỏe xương của người cao tuổi.
Sau khi đạt khối lượng xương tối đa (KLXĐ), quá trình mất xương bắt đầu diễn ra ở cả nam và nữ, với tốc độ trung bình ở cột sống thắt lưng là 0,84%/năm đối với nam giới và 1,6% đối với nữ giới ở độ tuổi 30 Mặc dù nam giới không trải qua sự mất xương ồ ạt như nữ giới sau mãn kinh, nhưng sự giảm nồng độ hormon sinh dục (testosteron) theo tuổi tác dẫn đến mất dần cả xương vỏ và xương bè Nhiều nghiên cứu cho thấy quá trình mất xương ở nam giới diễn ra chậm hơn, chỉ bắt đầu mạnh mẽ sau 50 tuổi và có ý nghĩa rõ rệt sau 65 tuổi Tốc độ mất xương của nữ giới sau mãn kinh vẫn cao hơn so với nam giới, như được chỉ ra trong nghiên cứu của Hannan và cộng sự theo dõi tốc độ mất xương ở người cao tuổi từ 67 đến 90 tuổi.
4 năm cho kết quả tốc độ mất xương trung bình của nữ (3,4 - 4,8%) cao hơn nam (0,2 - 3,6%) ở tất cả các vị trí Theo một nghiên cứu khác tiến hành trên
769 người trên 60 tuổi theo dõi trong vòng 2,5 năm cho thấy tốc độ mất xương ở cổ xương đùi là 0,82% một năm ở nam và 0,96% ở nữ 32
Quá trình mất xương ở nữ giới và nam giới diễn ra khác nhau: nữ giới giảm số lượng bè xương, trong khi nam giới chủ yếu mỏng dần các bè xương Nghiên cứu của Riggs và cộng sự (2008) cho thấy sự giảm xương bè bắt đầu ngay sau khi đạt khối lượng xương tối đa (KLXĐ), với đỉnh điểm ở phụ nữ sau mãn kinh và ở nam giới sau tuổi 65 Các yếu tố như di truyền, tuổi tác, thiếu hụt hormone, ít vận động, thiếu vitamin D và canxi, sử dụng glucocorticoid, cùng một số bệnh lý như cường cận giáp và suy thận, đều góp phần làm tăng tốc độ mất xương Điều này dẫn đến mất cân bằng giữa hủy xương và tạo xương, làm tăng tổn thương vi cấu trúc xương và nguy cơ loãng xương.
Sự khác biệt cơ bản trong cấu trúc xương giữa nam và nữ ở tuổi trưởng thành, cùng với quá trình lão hóa của bộ xương, dẫn đến khả năng chịu lực của xương nam tốt hơn so với nữ Điều này giải thích tại sao tỷ lệ loãng xương và gãy xương ở nam giới thấp hơn so với nữ giới.
Đa hình đơn nucleotide
1.3.1 Khái niệm về đa hình đơn
Theo Viện Sức khoẻ Quốc gia Hoa Kỳ (NIH), SNPs (biến đổi đơn nucleotide) là loại biến đổi di truyền phổ biến nhất ở người, với mỗi SNP đại diện cho sự khác biệt ở một nucleotide trong DNA Sự xuất hiện của SNPs thường do chọn lọc tự nhiên và biến đổi gen để thích nghi với môi trường Để được công nhận là SNP, một nucleotide phải xuất hiện với tần suất từ 1% trở lên trong quần thể Khoảng 325 triệu SNP đã được xác định trong bộ gen người, trong đó 15 triệu SNP có tần suất 1% hoặc cao hơn Mặc dù nhiều SNP không ảnh hưởng đến sức khỏe, một số có thể liên quan đến chức năng của gen và bệnh lý cụ thể SNPs cũng có thể giúp dự đoán phản ứng với thuốc và nguy cơ phát triển bệnh, đồng thời hỗ trợ theo dõi di truyền bệnh trong gia đình Nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào mối liên hệ giữa SNPs và các bệnh lý đa yếu tố, hướng tới phát triển y học cá thể hoá trong chẩn đoán và điều trị.
Hình 1.1 Đa hình nucleotid đơn (Nguồn: https://link.springer.com/article/10.1007/s11356-022-19981-7)
Dựa vào vị trí, SNPs được phân chia thành 2 loại chính 33 :
SNPs liên kết, hay còn gọi là SNPs chỉ thị, không nằm trong gen và không ảnh hưởng đến chức năng tổng hợp protein Tuy nhiên, chúng thường được phát hiện gần các gen liên quan đến bệnh, do đó có thể sử dụng SNPs như dấu hiệu sinh học để xác định bệnh hoặc gen bệnh.
SNPs trong gen có vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến chức năng của protein, liên quan đến các bệnh lý và tác động đến hiệu quả của thuốc điều trị.
SNPs mã hoá nằm trên vùng mã hoá của gen dẫn đến sự thay đổi acid amin của protein do gen đó mã hoá
SNPs không mã hóa nằm trong vùng điều hoà của gen có thể dẫn đến thay đổi mức độ biểu hiện gen thông qua mức độ RNA và protein
1.3 3 Vai trò và ứng dụng của SNPs trong Y học
Các biến thể trong trình tự DNA của con người có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh tật, cách cơ thể phản ứng với các tác nhân gây bệnh, hóa chất, thuốc, vaccine và các yếu tố khác Các SNP (biến thể đơn nucleotide) đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Đột biến nucleotide đơn (SNP) là yếu tố quan trọng trong việc cá thể hóa y học, có thể gây ra bệnh di truyền hoặc tương tác với các SNP khác và điều kiện môi trường để hình thành bệnh phức tạp SNP đóng vai trò chủ chốt trong các nghiên cứu y học, đặc biệt là trong các nghiên cứu liên kết toàn bộ hệ gen (GWAS), giúp so sánh các vùng gen giữa nhóm bệnh nhân và người khỏe mạnh Các nghiên cứu GWAS đã phát hiện nhiều SNP liên quan đến các bệnh đa yếu tố như đái tháo đường, tăng huyết áp, loãng xương và béo phì Thông qua việc phân tích dữ liệu gen của quần thể, các nghiên cứu không chỉ phát hiện biến thể di truyền mà còn đề xuất hướng nghiên cứu nhằm phát triển phương pháp phòng ngừa và điều trị bệnh trong tương lai.
1.3.4 Một số phương pháp xác định kiểu gen của đa hình đơn nucleotid 35
Một trong những thách thức lớn của sinh học phân tử hiện đại là hiểu sự khác biệt giữa các loài và cá thể trong mã hóa hệ gen Đa hình đơn nucleotid (SNP) đóng vai trò quan trọng trong sự đa dạng kiểu gen, với hơn 80% SNP được biết đến tạo nên sự khác biệt giữa cá thể trong cùng một loài Các SNP ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị thuốc và tác động của môi trường sống đối với từng cá nhân Vì vậy, kiểu gen của SNP là yếu tố quan trọng trong nghiên cứu tương tác giữa môi trường và hệ gen trong sự hình thành bệnh ở người Hiện nay, đã có nhiều phương pháp kỹ thuật để xác định kiểu gen của SNP, và trong chuyên đề này, tôi sẽ trình bày một số phương pháp chính thường được sử dụng trong các phòng xét nghiệm di truyền.
1.3.4.1 Phương pháp ARMS–PCR (Amplification refractory mutation system) 36
ARMS – PCR (Hệ thống khuếch đại đột biến không nhạy cảm) là một phương pháp PCR đặc biệt, cho phép khuếch đại DNA bằng các alen mồi đặc hiệu Phương pháp này rất hữu ích trong việc xác định các đột biến điểm và đa hình, đồng thời giúp phân loại kiểu gen của DNA thành đồng hợp và dị hợp ARMS – PCR phân biệt dị hợp tử và đồng hợp tử thông qua việc sử dụng các mồi cho alen đột biến và alen bình thường, với các phản ứng diễn ra trong các ống riêng biệt Cụ thể, giếng 1 sử dụng cặp mồi F (Forward primer) và Rw (Reverse wild type), trong khi giếng 2 sử dụng cặp mồi F và Rm (Reverse mutation) Sự xuất hiện sản phẩm đặc hiệu ở cả hai giếng cho thấy kiểu gen dị hợp tử; nếu chỉ xuất hiện ở giếng 1 là đồng hợp tử bình thường, và nếu chỉ xuất hiện ở giếng 2 là đồng hợp tử đột biến.
Phương pháp ARMS-PCR có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản và chi phí thấp, được sử dụng phổ biến trong các labo sinh học phân tử tại Việt Nam Nó có thể áp dụng cho tất cả các SNP mà không cần điểm cắt, do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng ARMS-PCR để xác định đa hình gen.
1.3.4.2 Phương pháp cắt enzym giới hạn (RFLP-PCR: Restriction Fragment Length Polymorphisms- Polymerase Chain Reaction) 37
Phương pháp PRFP-PCR nghiên cứu tính đa hình chiều dài của DNA thông qua enzym giới hạn Phương pháp này so sánh DNA giữa các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu, nhằm xác định sự tồn tại của đột biến điểm hoặc thay đổi trình tự DNA Nếu hai cá thể cùng loài có trình tự DNA giống nhau, các băng DNA sẽ tương đồng sau khi điện di Ngược lại, sự xuất hiện của đột biến điểm hoặc thay đổi trình tự sẽ dẫn đến sự khác biệt trong các băng DNA Kỹ thuật RFLP-PCR bao gồm nhiều giai đoạn thực hiện.
- Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để khuyếch đại đoạn DNA chứa SNP cần phân tích
- Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzym giới hạn thích hợp
- Điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận
Enzym giới hạn, hay enzym cắt, là một loại enzym quan trọng thuộc nhóm endonuclease, có khả năng cắt DNA tại các vị trí xác định Hiện nay, đã có hơn 500 loại enzym giới hạn khác nhau được phát hiện Các enzym này có những đặc điểm chung đặc trưng, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử.
- Đều được chiết tách từ vi khuẩn và tên enzym mang tên của vi khuẩn
- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu (hay còn gọi là vị trí giới hạn, trình tự giới hạn) với từng loại enzym
Vị trí cắt của enzym thường chứa từ 4 đến 8 nucleotid, với đặc điểm nổi bật là đoạn DNA này có trình tự giống nhau khi đọc theo cả hai chiều 3’-5’ và 5’-3’ Điều này cho thấy rằng vị trí cắt của enzym là đồng nhất trên cả hai mạch DNA.
Sau khi được cắt bằng enzym giới hạn, các sợi đơn DNA có đầu kết dính với các nucleotide bổ sung Trong quá trình điện di, DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương do tính chất tích điện âm của acid nucleotid Để xác định tính chất của DNA, cần thực hiện điện di trên gel, với kích thước phân tử DNA nhỏ di động nhanh hơn Hai loại gel phổ biến là gel polyacrylamid và gel agarose; trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gel agarose với nồng độ từ 0,8-3% tùy thuộc vào chiều dài sản phẩm Để quan sát DNA, người ta nhuộm bằng Redsafe hoặc Ethidium bromide, giúp DNA phát sáng dưới ánh sáng tử ngoại Trong quá trình điện di, DNA mẫu (marker) cũng được chạy để so sánh và xác định kích thước đoạn DNA.
Phương pháp RFLP-PCR có độ nhạy cao và kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầu trang thiết bị phức tạp, được áp dụng rộng rãi trong các labo sinh học phân tử tại Việt Nam Tuy nhiên, không phải tất cả các SNP đều có enzym cắt đặc hiệu, và phương pháp này đòi hỏi thời gian do cần thực hiện điện di hai lần Vì vậy, trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP-PCR để xác định hai đa hình gen LRP5Q89R.
FTO rs1121980 Sau đó kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen
Phương pháp này dựa trên nguyên lý phản ứng PCR, sử dụng 1 mồi xuôi và 1 mồi ngược để khuếch đại đoạn ADN chứa SNP cần nghiên cứu Hai probe phát huỳnh quang được sử dụng để phát hiện đặc hiệu từng alen của SNP: probe đầu tiên gắn chất nhuộm VIC cho “alen 1” và probe thứ hai gắn 6 FAM cho “alen 2” Mỗi probe được gắn chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang ở đầu, giúp phát hiện các alen cùng với các mồi, tạo ra sản phẩm đặc hiệu với tín hiệu huỳnh quang riêng biệt cho từng alen, từ đó xác định kiểu gen của SNP.
Phương pháp Taqman là một kỹ thuật xác định kiểu gen của SNP với độ chính xác cao Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp này gặp khó khăn do yêu cầu về vật liệu và thiết bị đắt tiền, khiến cho việc triển khai rộng rãi trong các phòng thí nghiệm trở nên khó khăn.
1.3.4.4 Phương pháp giải trình tự gen
Vai trò của gen MTHFR, LRP5 và FTO đối với loãng xương và gãy xương
1.4.1 V ai trò của gen nói chung đối với loãng xương
Di truyền có vai trò quan trọng trong mật độ xương (MĐX), với các nghiên cứu trên cặp song sinh cho thấy yếu tố này quyết định từ 50-80% sự thay đổi của MĐX Ngoài ra, gen cũng ảnh hưởng đến chuyển hóa xương và quá trình mất xương, được coi là yếu tố nguy cơ không thay đổi nhưng có thể can thiệp Gen không chỉ tác động đến khối lượng xương đỉnh mà còn tham gia vào các giai đoạn chu chuyển xương Việc xác định các yếu tố nguy cơ cá thể hóa hiện đang là xu hướng quan trọng, giúp can thiệp sớm để giảm nguy cơ loãng xương và các hậu quả liên quan.
Nghiên cứu về các gen ứng viên đã chỉ ra rằng nhiều SNP ảnh hưởng đến mật độ xương và gãy xương, với sự khác biệt giữa các chủng tộc Các gen quan trọng như LRP5, LRP6, DKK1, VDR, ColA1, ESR1, ESR2 liên quan đến quá trình tạo xương, hủy xương, và các yếu tố như tín hiệu Wnt, vitamin D, estrogen và collagen Những phát hiện này có ý nghĩa lâm sàng quan trọng trong việc xác định yếu tố nguy cơ loãng xương.
Nghiên cứu tương quan toàn hệ gen (GWAS) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc phát hiện các SNP liên quan đến mật độ xương (MĐX) và gãy xương Năm 2007, Kiel và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu GWAS đầu tiên, xác định mối tương quan giữa 40 SNP có nguy cơ ảnh hưởng đến MĐX, nhưng do cỡ mẫu nhỏ nên không tìm thấy mối tương quan có ý nghĩa thống kê Đến năm 2008, hai nghiên cứu GWAS tiếp theo đã được công bố, góp phần làm sáng tỏ các mối liên hệ này.
Bài viết đề cập đến bốn locus liên quan đến mật độ xương (MĐX), bao gồm LRP5, ESR1, OPG và RANKL Ngoài ra, các tác giả cũng phát hiện rằng các gen LRP5, RANK, LRP40, ZBTB40 và SPTBN1 có thể làm tăng nguy cơ gãy xương.
Urano và cộng sự đã thực hiện một phân tích gộp các nghiên cứu GWAS trong giai đoạn 2007-2015, phát hiện nhiều SNP mới liên quan đến loãng xương và gãy xương ở người da trắng và người Châu Á Các SNP này liên quan đến các quá trình sinh học của xương, đặc biệt là con đường tín hiệu WNT/β-catenin, bao gồm các gen như CTNNB1, SOST, LRP4, LRP5, GPR177, WNT4, WNT5B, WNT16, DKK1, sFRP4, JAG1, MEF2C và AXIN1 Nghiên cứu cũng chỉ ra ba yếu tố quan trọng là RANK, RANKL và OPG có ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo xương Tuy nhiên, một số gen như FAM210A và SLC25A13 vẫn chưa được giải thích rõ ràng về vai trò của chúng trong các cơ chế sinh học của xương.
Năm 2013, một nghiên cứu được thực hiện trên 14.492 người Anh đã phát hiện 307 SNP tại 203 locus có ảnh hưởng đáng kể đến mật độ xương (MĐX), trong đó có 153 locus mới so với các nghiên cứu trước Nhóm tác giả cũng chỉ ra 12 SNP liên quan đến gãy xương một cách có ý nghĩa.
Năm 2021, tác giả Zhu X và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân tích gộp 512 nghiên cứu GWAS trong 12 năm, phát hiện 518 locus trong bộ gen người ảnh hưởng đến loãng xương và gãy xương Tuy nhiên, chỉ có 20% các locus này giải thích được mối liên quan với cơ chế sinh học của xương Loãng xương là một bệnh lý phức tạp đa yếu tố, và sự tác động của gen đến tình trạng này đã được khẳng định, nhưng cơ chế tác động thực sự vẫn còn nhiều điều chưa rõ ràng Do đó, cần tiến hành nhiều nghiên cứu hơn trên các đối tượng khác nhau về chủng tộc, giới tính và độ tuổi để làm sáng tỏ vai trò của gen trong loãng xương và gãy xương.
Nghiên cứu GWAS trên quần thể người Châu Á còn hạn chế so với các nghiên cứu trên người da trắng Yang và cộng sự đã phát hiện gen UGT2B17 liên quan đến gãy xương hông qua nghiên cứu trên 700 người Hán cao tuổi Ngoài ra, nghiên cứu của Guo và cộng sự chỉ ra rằng SNP rs13182402 của gen ALDH7A1 trên nhiễm sắc thể số 5 làm tăng nguy cơ gãy xương hông Nghiên cứu GWAS đầu tiên ở Nhật Bản với 6.700 đối tượng cho thấy SNP rs7605378 của gen FONG có liên quan đến loãng xương Cuối cùng, Hwang và cộng sự xác định gen MECOM làm tăng nguy cơ gãy xương ở 1.119 bệnh nhân gãy xương so với 3.444 người đối chứng tại Hàn Quốc và Nhật Bản.
Trong đề tài này chúng tôi chọn nghiên cứu 3 đa hình gen MTHFR
C677T (rs1801133), LRP5 Q89R (rs41494349) và FTO rs1121980 có mối liên quan đến loãng xương, được chứng minh qua nhiều nghiên cứu trên các chủng tộc châu Âu, châu Á và châu Úc Các gen này ảnh hưởng đến mật độ xương, trong khi hoạt động của gen MTHFR cũng liên quan đến nồng độ homocystein trong máu, từ đó tác động đến chuyển hóa xương.
Gen LRP5 có vai trò quan trọng trong con đường tín hiệu Wnt/β-catenin, ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào tạo xương và quy định khối lượng xương Gen FTO đã được xác định liên quan đến loãng xương và gãy xương ở người Trung Quốc và Úc Đặc biệt, các nghiên cứu trên quần thể người Việt cho thấy sự xuất hiện của ba đa hình gen này có liên quan đến các bệnh như béo phì, tăng huyết áp, ung thư, gãy xương và xảy thai liên tiếp.
1.4.2 V ai trò của gen LRP5 đối với loãng xương
Giống như các thành viên khác trong gia đình LDLR, gen LRP5 ở người kéo dài khoảng 136 kb nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể 11 (11q13.2) 49
Hình 1.2 Vị trí gen LRP5 trên nhiễm sắc thể số 11 (Nguồn https://ghr.nlm.nih.gov/gene/LRP5#location) 1.4.2.2 Chức năng của gen LRP5
Gen LRP5 bao gồm 23 exon và 5124 cặp bazơ, mã hóa cho protein xuyên màng LRP5 dài 1614 amino acid Protein LRP5 được gắn vào màng tế bào, với cấu trúc chủ yếu nằm ở vùng ngoại bào Vùng ngoại bào này thường liên kết với phức hệ Wnt/Frizzle để khởi động con đường tín hiệu β-catenin - Wnt, trong khi phần đuôi trong tế bào chất liên quan đến sự bất hoạt phức hợp GSK-3B.
Cơ chế hoạt động của con đường tín hiệu β-catenin - Wnt, hay còn gọi là con đường tín hiệu Wnt cổ điển, diễn ra khi có sự hiện diện của Wnt, kích hoạt β-catenin - Wnt Wnt gắn kết với protein LRP5/LRP6 và protein Frizzled, ức chế phosphoryl hóa Axin-Gsk3 của β-catenin, ngăn chặn sự thoái hóa của nó Kết quả là β-catenin tích lũy trong bào tương và vào nhân tế bào, tạo thành phức hợp hạt nhân với hệ số phiên mã TCF/LEF, kích hoạt các gen Wnt Ngược lại, khi không có Wnt, phức hợp protein Axin được hình thành từ Apc, Gsk3, Ck1 và β-catenin, dẫn đến phosphoryl hóa β-catenin bởi Ck1 và Gsk3, khiến β-catenin bị phân hủy bởi proteasome và không còn khả năng truyền tín hiệu vào nhân tế bào.
Hình 1.3 Con đường tín hiệu β catenin – Wnt 50
Hình A, Hoạt hóa Wnt Hình B, Ức chế Wnt
Tín hiệu Wnt đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học của tế bào, bao gồm sự phân chia, độ bám dính và di cư của tế bào Tín hiệu này hiện diện ở nhiều loại tế bào trong cơ thể, như tế bào ở mắt, xương và gan, góp phần vào các hoạt động tế bào thiết yếu.
- Tác động của con đường tín hiệu β catenin – Wnt trên xương 51
Nghiên cứu dược lý và di truyền học cho thấy rằng con đường tín hiệu Wnt tăng cường mật độ xương (MĐX) thông qua việc kích thích hoạt động của tế bào tạo xương, làm mới tế bào nguồn gốc trung mô, thúc đẩy sự biệt hóa tế bào nguồn thành tế bào tạo xương (Osteoblast) và giảm quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào tạo xương và tế bào xương (Osteocyte).
1.4.2.3 Đa hình gen LRP5 và ảnh hưởng đối với MĐX và gãy xương
Đa hình gen LRP5 Q89R (rs41494349) nằm trên exon thứ 2, với sự thay thế nucleotid A thành G tại vị trí 266, dẫn đến biến đổi acid amin Glutamine (Q) thành arginin (R) ở vị trí 89 của protein LRP5, ảnh hưởng đến cấu trúc β-propeller 1 Nghiên cứu cho thấy đa hình gen này làm thay đổi tính kỵ nước của protein LRP5, từ đó ảnh hưởng đến sự tương tác với các protein khác Mặc dù chức năng của từng miền trên protein LRP5 chưa được xác định rõ, nhưng các đa hình gen ảnh hưởng đến cấu trúc protein này có liên quan đến MĐX Đa hình gen Q89R được phát hiện lần đầu ở Nhật Bản vào năm 2002 với tần suất alen G là 8% trong nghiên cứu trên 172 người Năm 2004, nghiên cứu trên phụ nữ cho thấy tần suất alen G là 8,7% Tuy nhiên, tỷ lệ đa hình gen này rất thấp ở người da trắng và châu Phi.
Một số nghiên cứu lâm sàng về gen LRP5 Q89R (rs41494349),
C677T (rs1801133) , FTO rs1121980 liên quan với loãng xương và gãy xương ở nam giới
1.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới
Các nghiên cứu trên thế giới về tác động của 3 đa hình gen nghiên cứu
LRP5 Q89R (rs41494349), MTHFR C677T (rs1801133) và FTO rs1121980 có ảnh hưởng đến mật độ xương và nguy cơ gãy xương, chủ yếu ở nữ giới Tuy nhiên, các nghiên cứu về nam giới và đặc biệt là người Châu Á còn hạn chế và cho kết quả không đồng nhất.
Đa hình gen LRP5 Q89R (rs41494349) chủ yếu được phát hiện ở người Châu Á, với nhiều nghiên cứu cho thấy rằng những người mang alen G có mật độ xương thấp hơn so với những người mang alen A, đặc biệt trong các đối tượng người Hàn Quốc và Trung Quốc.
Nghiên cứu của Koh (2004) 80 trên 219 nam giới Hàn Quốc tuổi từ 20-
Nghiên cứu đã xác định mối liên quan giữa 6 SNP của gen LRP5 với mật độ xương, bao gồm các biến thể Q89R, A400V, V667M, R1036Q, A1525V, A1330V và N74N Kết quả cho thấy gen LRP5 Q89R có ảnh hưởng tiêu cực đến mật độ xương ở cổ xương đùi và tam giác Ward với p=0,004 và p Cao 6,94 2,34 – 20,53 0,000
Kết quả từ bảng 3.27 chỉ ra rằng có sự tương quan có ý nghĩa thống kê giữa đa hình gen LRP5 Q89R, MTHFR C677T và FTO rs1121980 với chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực liên quan đến loãng xương Ba đa hình gen này làm tăng nguy cơ loãng xương một cách độc lập với các yếu tố nguy cơ khác, với tỷ lệ Odds Ratio lần lượt là 3,45; 1,65 và 2,17 (p0,05).
Mô hình hồi quy logistic đa biến được sử dụng để kiểm định mối liên quan giữa loãng xương cổ xương đùi và ba đa hình gen, cùng với các yếu tố nguy cơ khác Nghiên cứu này giúp xác định các yếu tố di truyền và môi trường ảnh hưởng đến tình trạng loãng xương, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh.
Các yếu tốnguy cơ OR 95% CI p
Thừa cân > bình thường 0,59 0,30 – 1,14 0,119 Béo phì > bình thường 0,20 0,09 – 0,48 0,000
Tiền sử hút thuốc (Có>không) 1,09 0,61 – 1,95 0,782
Tiền sửgãy xương (Có>không) 1,26 0,52 – 3,1 0,60
Tĩnh tại > cao 48,45 6,24 – 356,64 0,000 Ít > cao 6,07 1,36 – 25,92 0,018
Nhận xét: Kết quả bảng 3.28 cho thấy tại vị trí cổ xương đùi cả 3 đa hình gen
Các biến thể gen LRP5 Q89R, MTHFR C677T và FTO rs1121980 làm tăng nguy cơ loãng xương một cách độc lập, với tỷ lệ odds lần lượt là 2,59; 2,5 và 1,82 Chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực có mối liên quan đáng kể đến loãng xương (p Không) 0,7 0,13 – 3,69 0,68
Tiền sửgãy xương (Có> Không) 9,5 1,41 – 63,9 0,02*
Tĩnh tại > Cao - - - Ít > Cao 0,08 0,005 – 1,34 0,079 Trung bình > Cao 0,05 1,06 – 18,93 0,02*
Nhận xét: Kết quả bảng 3.29 cho thấy ở vị trí đầu trên xương đùi, không tìm thấy mối liên quan có ý nghĩ thống kê giữa 3 đa hình gen LRP5 Q89R,
Mối liên quan giữa gen MTHFR C677T, FTO rs1121980 và loãng xương đã được nghiên cứu, cho thấy có sự liên hệ thống kê đáng kể giữa chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực với tình trạng loãng xương.
Mô hình hồi quy logistic đa biến được sử dụng để kiểm định mối liên quan giữa loãng xương cột sống thắt lưng và ba đa hình gen, cùng với các yếu tố nguy cơ khác Nghiên cứu này nhằm xác định các yếu tố di truyền và môi trường ảnh hưởng đến tình trạng loãng xương, từ đó cung cấp thông tin quý giá cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh.
Các yếu tốnguy cơ OR 95% CI p
Tiền sử hút thuốc (Có > Không) 1,07 0,67 – 1,72 0,783
Tiền sửgãy xương (Có > Không) 3,07 1,46 – 6,48 0,003*
Tĩnh tại > Cao 21,59 4,14 – 112,46 0,000* Ít > Cao 6,25 2,04– 19,14 0,001*
Kết quả từ bảng 3.30 chỉ ra rằng có sự tương quan thống kê đáng kể giữa hai đa hình gen LRP5 Q89R và FTO rs1121980 với chỉ số BMI, tiền sử gãy xương và mức độ hoạt động thể lực liên quan đến loãng xương tại vị trí đầu trên xương đùi (p0,05).
BÀN LU Ậ N
Bàn luận về đặc điểm các đa hình gen LRP5 Q89R (rs41494349),
MTHFR C677T (rs1801133) và FTO rs1121980
Nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành trên 400 nam giới, trong đó có 200 người được chẩn đoán mắc bệnh loãng xương và 200 người bình thường làm đối chứng Các đối tượng được ghép cặp theo nhóm tuổi, như trình bày trong bảng 3.1 và 3.2 Tất cả đều trải qua phỏng vấn với bộ câu hỏi thiết kế đồng nhất, đo mật độ xương (MĐX), lấy mẫu xét nghiệm để loại trừ các bệnh lý liên quan, và xác định các đa hình kiểu gen Dữ liệu thu thập được đã được xử lý để đánh giá đặc điểm của các đa hình đơn nucleotid ở ba gen.
Nghiên cứu về mối liên quan giữa các biến thể gen LRP5 Q89R (rs41494349), MTHFR C667T (rs1801133) và FTO rs1121980 với loãng xương ở nam giới cho thấy những yếu tố nguy cơ liên quan DNA được thu thập từ mẫu máu toàn phần của các đối tượng nghiên cứu là cơ sở để xác định các đa hình đơn gen, theo sơ đồ nghiên cứu được trình bày trên trang 50.
Quy trình tách chiết DNA của chúng tôi được thực hiện theo quy trình Estonia, cho sản phẩm DNA đồng đều và tinh sạch cao Hai đa hình gen LRP5 Q89R (rs41494349) và FTO rs1121980 được xác định bằng phương pháp cắt enzym giới hạn (RFLP - PCR) Sản phẩm PCR, sau khi khuyếch đại bằng các cặp mồi đặc hiệu, được điện di trên gel, cho hình ảnh rõ nét, giúp xác định các băng DNA dựa trên kích thước so với băng chuẩn Đa hình gen MTHFR C667T (rs1801133) cũng được nghiên cứu trong quá trình này.
Nghiên cứu C677T (rs1801133) được thực hiện bằng phương pháp AMRS-PCR, một phương pháp đơn giản và đáng tin cậy Kết quả cho thấy 8 kiểu gen của 3 đa hình gen: LRP5 Q89R (rs41494349) với các kiểu gen AA, AG, GG; MTHFR C677T (rs1801133) với các kiểu gen CC, CT, TT; và FTO rs1121980 với các kiểu gen GA, GG Chúng tôi đã kiểm tra lại kết quả từ hai phương pháp này với kết quả giải trình tự gen và nhận thấy có sự tương đồng hoàn toàn giữa chúng.
Các đa hình đơn gen, với khoảng 10 triệu SNP trong bộ gen người, có ảnh hưởng đến nhiều bệnh lý đa yếu tố Nghiên cứu gần đây đã xác định 518 locus liên quan đến loãng xương và gãy xương trên toàn cầu Vì vậy, việc nghiên cứu tác động của các đa hình gen lên loãng xương ở nam giới là rất quan trọng.
4.2.1 Bàn luậ n về phân bố tần số alen và kiểu gen của đ a hình gen LRP5 Q89R rs41494349
Gen LRP5, nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể 11, có vai trò quan trọng trong quá trình tái mô hình xương thông qua con đường tín hiệu Wnt Nhiều điểm đa hình trên gen LRP5 được cho là ảnh hưởng đến mật độ xương và nguy cơ gãy xương toàn cầu Các nghiên cứu về đa hình gen LRP5 đã được thực hiện trên cả người da trắng và người Châu Á Nghiên cứu của tác giả Trần Thị Ngọc Bích và cộng sự 122 đã tiến hành phân tích gộp 19 nghiên cứu, phát hiện 22 SNP liên quan đến ảnh hưởng của đa hình gen LRP5 lên mật độ xương.
Trong số 10 SNP thường gặp, bao gồm rs3736228, rs4988321, rs41494349 (Q89R), rs2277268, rs556442, rs17149104, rs1157442, rs545382 và rs4988319, nghiên cứu về đa hình gen tại Việt Nam còn hạn chế Tác giả Hồ Phạm Thục Lan đã tiến hành nghiên cứu về đa hình gen LRP5 tại SNP rs3736228 và rs599083 ở Thành phố Hồ Chí Minh nhưng không tìm thấy mối liên hệ với MĐX Đặc biệt, SNP LRP5 Q89R (rs41494349) nằm trên exon thứ 2, có sự thay thế nucleotide A thành G tại vị trí 266, dẫn đến sự biến đổi acid amin từ Glutamin (Q) thành Arginin (R) tại vị trí 89 của protein LRP5, ảnh hưởng đến cấu trúc β-propeller 1 của protein này Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đa hình gen Q89R có tác động đến MĐX, thoái hóa cột sống và tăng huyết áp.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ kiểu gen và alen của đa hình gen
LRP5 Q89R (rs41494349) tuân theo định luật cân bằng Hardy Weinberg (p >
Phân bố kiểu gen và tỷ lệ alen của đa hình gen LRP5 rs41494349 cho thấy tính ổn định di truyền qua các thế hệ, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tiến hóa đặc biệt.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ kiểu gen ở nhóm bệnh cho thấy kiểu gen AA chiếm ưu thế với 86,0%, tiếp theo là AG (13,0%) và GG (1,0%) Ngược lại, ở nhóm chứng, kiểu gen AA chiếm 94%, AG 6,0%, không có kiểu gen GG Sự khác biệt về tỷ lệ kiểu gen AG và GG giữa hai nhóm bệnh và chứng là có ý nghĩa thống kê với p