TỔNG QUAN
Tổng quan về Carotenoid
Carotenoid là một họ sắc tố tự nhiên quan trọng được tìm thấy trong thực vật, tảo và vi khuẩn quang hợp Những sắc tố này tạo ra màu vàng tươi, đỏ và cam của trái cây, hoa, ở thực vật Hiện nay có hơn 600 loại carotenoid khác nhau được tìm thấy trong tự nhiên và chúng được chia thành hai nhóm chính là xanthophyll và caroten (Maoka, 2020).
2.1.1 Phân loại, cấu trúc và nguồn cung cấp carotenoid
Hai nhóm chính của hợp chất carotenoid là caroten (không chứa oxy) và xanthophyll (chứa oxy):
Nhóm caroten: là mạch hydrocacbon không no, trong cấu tạo phân tử không chứa oxy, không tan trong nước, có khả năng tan trong lipid và các dung môi hữu cơ Caroten có trong các loại rau quả như cà rốt, ớt chuông, gấc, quả mơ, bí ngô, bắp cải, rau spinach, đặc biệt trong quá trình sinh tổng hợp của Blakeslea trispora, R mucilaginosa và R glutinis sinh khối tạo thành chứa rất nhiều caroten Một số caroten phổ biến như: lycopen, β-caroten, ngoài ra còn có α-caroten, γ-caroten,…(Gross, 2012).
Nhóm Xanthophyll: Nhóm này bao gồm các Carotenoid có các nhóm chức chứa oxygen trong cấu trúc của chúng Những nhóm chức năng phổ biến nhất trong Xanthophyll là nhóm hydroxyl (OH) và nhóm keto (C=O), nhưng cũng có thể có các nhóm chức năng khác như gốc aldehyde, carboxylic, epoxi Xanthophyll có màu sắc đa dạng, thường là màu vàng, cam, đỏ và nâu Xanthophyll được tìm thấy rộng rãi trong thực vật và một số vi khuẩn Một số xanthophyll phổ biến bao gồm lutein, zeaxanthin, violaxanthin, và neoxanthin (Gross, 2012).
Carotenoid là các hợp chất tetratecpen được hình thành bởi sự kết hợp của 8 đơn vị isoprene (Ludwiczuk và cộng sự, 2017) Carotenoid có cấu trúc là một mạch thẳng, 8 đơn vị 5-cacbon isoprenoit liên kết nhau, và đối xứng qua trung tâm, có sự xen kẻ giữa các nối đôi và nối đơn Một số carotenoid trong cấu trúc có chứa các vòng sáu cạnh, hoặc chứa thêm oxy như các gốc ruợu, aldehyde, ketone, carboxylic, epoxi Từ cấu trúc cơ bản này, hầu hết các carotenoid khác có thể được tạo ra thông qua quá trình hydrogenation, cyclization, oxidation hoặc bất kỳ sự kết hợp nào của những quá trình này (Gross, 2012).
Hình 2.1 Cấu trúc một đơn vị Isoprene (Szmytkowski, C và cộng sự, 2016)
Một số cấu trúc của carotenoids được trình bày dưới đây:
Hình 2.2 Cấu trúc một số carotenoid phổ biến thuộc nhóm caroten (Butnariu, 2016)
Hình 2.3 Cấu trúc một số carotenoid phổ biến thuộc nhóm xanthophyll (Butnariu, 2016)
Hợp chất Carotenoid được lấy tên từ đại diện chính của chúng là nhóm β-caroten, đây là sắc tố cam đầu tiên được phân lập từ cà rốt (Daucus carota) bởi Wackenroder vào năm 1831 (Gross, 2012) Các hợp chất Carotenoid được tiếp tục được tìm thấy và thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như:
6 Ởthực vật, carotenoid có nhiều trong các loại trái cây, rau quả tiêu biểu như trong cà rốt hàm lượng β-caroten đạt xấp xỉ 87 àg/g; quả gấc cú chứa hàm lượng β-caroten khoảng 101 ±
38 àg/g và hàm lượng lycopene đạt khoảng 380 ± 71 àg/g; trong quả cà chua, hàm lượng β- caroten là 62 àg/g và hàm lượng lycopene đạt 114.4 àg/g (Aoki và cộng sự, 2002; Muùler, 1997). Ở động vật, carotenoids góp phần tạo nên màu sắc rực rỡ được quan sát thấy trong bộ lông, da, vảy hoặc lông của nhiều loài động vật như ở các loài chim hay cá… Đặc biệt là nhóm caroten có nhiều trong gan cá, nhất là gan cá thu và ở gan của các loài động vật như: gà, vịt, heo… và ở một số loài khác như cá, trứng, côn trùng, gia cầm…(Gross, 2012).
Một số vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men và vi nấm chứa hợp chất carotenoids phổ biến được thể hiện trong bảng 2.1 bên dưới:
Bảng 2.1 Hàm lượng carotenoid được tổng hợp từ một số loài vi sinh vật
Vi sinh vật carotenoid Hàm lượng Nguồn TLTK
Flavobacterium R1560 Zeaxanthin 0.63 ›g/mL Alcantara & Sanchez,
Flavobacterium β-caroten 7.78 mg/L Bhosale và Bernstein, 2004 multivorum
Nấm men và nấm mốc
Rhodotorula glutinis β-caroten 15.71 mg/L Gu và cộng sự, 2007.
Rhodotorula graminis β-caroten 2.17 mg/L Buzzini và cộng sự, 2005
Phaffia rhodozyma Astaxanthin 4.7 mg/g Johnson & Carlos, 2011;
Blakeslea trispora β-caroten 139 mg/L Wửstemeyer, 2015;
Haematococcus Astaxanthin 5% w/w dry Niizawa và cộng sự, 2021. pluvialis
Dunaliella salina β-caroten 12% w/w dry Masojídek & Torzillo,
Dunaliella bardawil β-caroten 51.750 mg/L Mogedas và cộng sự, 2009
2.1.2 Tổng quan về hợp chất β-caroten từ sinh khối nấm men.caroten β-caroten là một hợp chất isoprenoid thuộc nhóm caroten và là một sắc tố hòa tan trong chất béo được tìm thấy trong thực vật (Khachik, Beecher, & Smith, 1995) và vi sinh vật (EFSA, 2012) với công thức hóa học C 40 H 56 là trọng lượng phân tử là 536 g/mol β-caroten tồn tại ở dạng tinh thể rắn (crystalline) trong các nguồn tự nhiên như các loại thực vật và trái
7 cây Khi xuất hiện ở dạng tinh thể, β-caroten có thể có màu đỏ đến nâu đỏ Ngoài ra, β- caroten cũng tồn tại ở dạng tự do trong chất béo, và khi ở dạng này, nó thường có màu cam nhạt hoặc màu cam đỏ nhạt (Gul và cộng sự, 2015).
Phần lớn β-caroten tự nhiên tồn tại dưới dạng đồng phân all-trans; tuy nhiên, một số lượng nhất định của β-caroten dạng cis cũng có mặt trong thực phẩm (Ma, Xu, Zhang, Shangguan, & Li, 2008); với mức độ phân bố theo thứ tự: all-trans>9-cis->13-cis>15-cis (Guo, Tu, & Hu, 2008) Dạng all-trans của β-caroten có tính không ổn định khi tiếp xúc với oxy, ánh sáng và nhiệt độ cao ngay lập tức trải qua các quá trình oxi hóa, chuyển đổi đồng phân thành dạng đồng phân cis.
2.1.2.1 Tính chất của β-caroten. β-caroten là carotenoid thuộc nhóm caroten, vì vậy chúng sẽ mang những tính chất chung của các carotenoid và của nhóm caroten Một số tính chất quan trọng của β-caroten:
Tính tan: Carotenoids là những chất béo và do đó tan trong các chất béo khác và trong các dung môi như như aceton, ethanol, diethylether, và cloroform Nhóm caroten tan trong các dung môi không phân cực như xăng dầu và hexan, trong khi các xanthophyll tan tốt nhất trong các dung môi phân cực như ethanol (Gross, 2012). Đặc tính sinh học: Khả năng ái lực cao với oxy là một trong những đặc tính quan trọng của carotenoid nói chung và β-caroten nói riêng Điều này có nghĩa là carotenoid có khả năng tương tác mạnh với phân tử oxy và thường được sử dụng như chất chống oxi hóa Ngoài ra, Cấu trúc polyene trong carotenoid cho phép chúng tương tác với phân tử oxy đơn bội, như các gốc tự do và các phân tử khác chứa liên kết đôi C=O (Krinsky, 2001) Trong quá trình này, carotenoid có thể cung cấp điện tử cho các phân tử oxy không ổn định, ngăn chặn quá trình oxy hóa tổn hại đối với tế bào và cơ quan Khả năng trên chính nhờ do cấu trúc carotenoid là hệ thống nối đôi liên hợp, xen kẽ nối đơn, nối đôi tạo chuỗi polyene Tuy nhiên, chính cấu trúc đặc biệt này cũng làm cho carotenoid không bền với các điều kiện bên ngoài. Một số tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu của carotenoid như ánh sáng, nhiệt độ, phản ứng oxy hóa khử, tác dụng với ion kim loại (Gross, 2012) Các tác nhân trên có thể tác động lên cấu trúc của phân tử carotenoid gây phá hủy cấu trúc polyene của chúng hoặc chuyển đổi thành các dạng đồng phân khác Điều này dẫn đến các phân tử carotenoid bị mất màu.
Tính hấp thụ ánh sáng: Hầu hết các carotenoid được hấp thu trong vùng nhìn thấy của quang phổ, phần còn lại được truyền hoặc phản xạ ra ngoài, làm cho chúng có màu sắc đặc trưng (Gross, 2012) Ngoài ra, dung môi khác nhau có thể tạo ra các phổ hấp thụ khác nhau cho cùng một carotenoid (Rodriguez-Amaya và cộng sự, 2004) Hầu hết các carotenoid được hấp thụ bước sóng ánh sáng từ 400 - 500 nm (vùng khả kiến) Rất ít caroten có thể hấp thu ở
8 vùng tử ngoại (UV) có bước sóng ánh sáng từ 200 - 400 nm như phytoene, phytofluene Mỗi carotenoid có một phổ hấp thụ ánh sáng UV-Vis đặc trưng, với các đỉnh hấp thụ và bước sóng hấp thụ lớn nhất (λ max ) riêng biệt Chính vì vậy, phổ hấp thụ ánh sáng của mỗi loại carotenoid cho phép xác định và phân biệt chúng trong các hỗn hợp (Rodriguez-Amaya và cộng sự, 2004).
Phổ hấp thụ ánh sáng của β-caroten trong các dung môi khác nhau được trình bày trong bảng 2.2 Các dung môi được sử dụng ảnh hưởng đến vị trí của cực đại hấp thụ: petrolium ether và ethanol có ít hoặc không ảnh hưởng, cloroform và benzen tạo ra độ dịch chuyển bazochromic là 15 nm, và carbon disulfide tạo ra độ dịch chuyển +35 nm Ngoài ra, trong cùng một phân tử carotenoid, đồng phân cis cũng sẽ có màu sắc nhạt hơn và có độ sáng thấp hơn so với đồng phân trans gốc của nó (Gross, 2012) Phổ hấp thụ các đồng phân của β- caroten trong cùng một dung môi được thể hiện ở hình 2.4.
Bảng 2.2 Cực đại hấp thụ quang phổ của β-caroten trong một số dung môi khác nhau (Butnariu, 2016)
Carotenoid Dung môi λ max (nm) β-caroten Cacbon sunfua 472 502 β-caroten Hexan 425 450 477 β-caroten Petrolium ether 448 475 β-caroten Ethanol 427 449 475
Hình 2.4 Phổ hấp phụ các đồng phân của β-caroten (Gross, 2012)
2.1.2.2 Các phương pháp tách chiết β-caroten.
Tổng quan về Rhodotorula musilaginosa
R mucilaginosa là chủng nấm men thuộc họ Sporidiobolaceae, bộ Sporidiobolales, lớp Pucciniomycotina, và ngành Basidiomycota trong giới Fungi R mucilaginosa lần đầu tiên được phân lập và đặt tên bởi Francis Charles Harrison, dựa trên nghiên cứu của ông về chủng nấm men có trong một loại phô mai vào những năm 1930 Tên chi của loài này trong tiếng Latinh có nghĩa là "men có màu đỏ" (Li và cộng sự, 2022).
2.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh học
Về mặt hình thái, khuẩn lạc của R mucilaginosa có màu đỏ cam, kích thước khoảng 2- 3mm, không sinh bào tử, có bề mặt nhẵn Chúng có thể tạo thành các giọt lipid nội bào chứa carotenoid, làm cho chúng có màu từ hồng đến cam trong môi trường nuôi cấy Hình thái khuẩn lạc này tương tự như hình thái của những loài nấm men đỏ điển hình thuộc chi
Rhodosporidium, Rhodotorula, Sporobolomyces và Sporidiobolus (Li và cộng sự, 2022;
Hình 2.5 Hình dạng tế bào các chủng R.mucilaginosa (A): CBS 17; (B): CBS 316; (C): CBS 328; (D): CBS 333 (Sampaio và cộng sự, 2011)
R mucilaginosa là một sinh vật nhân thực hoại sinh, có các đặc điểm của hầu hết các loại nấm men và tồn tại ở trạng thái đơn bào và không có sợi nấm, phát triển phổ biến trong môi
12 trường sinh thái với sự phân bố rộng, thậm chí có thể được tách ra từ các khu vực bị ô nhiễm, hoặc trong đất vùng rễ của thực vật (Li và cộng sự, 2022).
R mucilaginosa được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau như thực phẩm, dược phẩm, sinh học, nông nghiệp và hóa học (Li và cộng sự, 2022).
Hình 2.6 Các ứng dụng đặc trưng của R mucilaginosa (Li và cộng sự, 2022)
2.2.2.1 Sinh tổng hợp sắc tố.
R mucilaginosa tạo ra các khuẩn lạc màu đỏ cam đặc trưng với β-caroten, torularhodine, torulene là các carotenoid được phát hiện và trích ly được từ R mucilaginosa chủng CBS 17 với 100 àg/g sinh khối khụ, chủ yếu là β-caroten với 75% (Perrier và cộng sự, 1995; Molinộ và cộng sự, 2012).
Hình 2.7 Cấu trúc phân tử của các carotenoid chính bởi R.mucilaginosa
(A) β-caroten; (B) Torulene; (C) Torularhodin (Li và cộng sự, 2022)
Mặc dù sản lượng carotenoid của R mucilaginosa tương đối thấp so với các vi sinh vật sinh tổng hợp carotenoid khác như loài nấm mốc B trispora, nhưng nó có những ưu điểm đáng kể so với B trispora và vi tảo khác như tốc độ tăng trưởng của R mucilaginosa cao và sinh khối tế bào tương đối dễ thu được ở cấp độ quy mô phòng thí nghiệm và pilot (Rodrigues và cộng sự, 2019; Banerjee và cộng sự, 2020) Bên cạnh đó, R mucilaginosa có thể phù hợp với nhiều điều kiện môi trường khác nhau và sinh khối có thể phát triển dưới nhiều loại carbon và nguồn nitơ (da Silva và cộng sự, 2020; Rodrigues và cộng sự, 2022).
2.2.2.2 Sinh tổng hợp chất béo và exopolysaccharides.
R mucilaginosa có khả năng sinh tổng hợp và tích lũy hơn 40% chất béo trong trọng lượng khô của tế bào Những chất béo này đáp ứng nhu cầu và tiêu chuẩn của dầu diesel sinh học, giảm bớt sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch không thể tái tạo Sinh tổng hợp lipid xảy ra chủ yếu trong tế bào chất của tế bào nấm men, thông qua một chuỗi các quá trình enzyme chuyển đổi cơ chất như saccharides, glycerol hoặc acetyl-CoA thành acid béo chuỗidài (Li và cộng sự, 2022).
Cơ chế sinh tổng hợp lipid ở vi sinh vật nói chung và R mucilaginosa của vẫn chưa được làm rõ hoàn toàn Năng suất và hiệu quả sinh tổng hợp lipid của R mucilaginosa chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, độ pH, tỉ lệ carbon/nito ban đầu… (Li và cộng sự, 2022).
Các chủng R mucilaginosa được nuôi cấy trên cơ chất tổng hợp có chứa carbohydrate có thể tổng hợp exopolysaccharides Các polysaccharides từ loài vi sinh vật này có thể được thêm vào các sản phẩm thực phẩm để hoạt động như chất làm đặc, chất ổn định, chất nhũ hóa, chất tạo gel và chất liên kết nước (Albertyn và cộng sự, 2014).
Là nguồn nguyên liệu tự nhiên, EPS từ nấm men ngày càng được phát triển và sử dụng rộng rãi, có các đặc tính chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, chống bức xạ, chống viêm, chống khối u và chống mệt mỏi Các EPS này được tạo thành từ bốn monosacarit: glucose, mannose, galactose và fucose, với trọng lượng phân tử trung bình là 1200 kDa EPS do R. mucilaginosa GUMS16 đã được báo cáo là có tác dụng chống khối u đối với dòng tế bào bạch cầu (Li và cộng sự, 2022).
2.2.2.3 Tác nhân kiểm soát sinh học.
Việc sử dụng các tác nhân vi sinh, cụ thể là nấm men để kiểm soát sự sinh trưởng của nấm mốc đã cho thấy một tiềm năng lớn thay thế cho thuốc diệt nấm tổng hợp Các nghiên cứu cho thấy R mucilaginosa có thể ngăn ngừa thối rữa ở táo và khi sử dụng kết hợp với acid phytic có thể chống lại sự hư hỏng trên dâu tây do nấm mốc xám Botrytis cinerea gây ra Bên cạnh đó, các nghiên cứu cho thấy R mucilaginosa còn có khả năng ức chế và tiêu diệt đối với
14 hầu hết các loài nấm thuộc ngành Ascomycetous và Basidiomycetous (Albertyn và cộng sự, 2014).
Safitri và cộng sự tìm thấy hai dòng R mucilaginosa phân lập có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh thối gốc thân (BSR) do nấm Phytophthora capsici gây ra trên cây hồ tiêu Tác dụng kiểm soát sinh học của R mucilaginosa đạt được nhờ một số cơ chế, chẳng hạn như quá trình siêu ký sinh, làm hỏng thành tế bào sợi nấm của P capsica (Safitri và cộng sự, 2021).
Có ý kiến cho rằng EPS do R mucilaginosa sản xuất có khả năng ức chế sự phát triển của ba mầm bệnh vi khuẩn: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus (Vazquez-Rodriguez và cộng sự, 2018) Có nghiên cứu đã phát hiện R mucilaginosa có khả năng kháng bệnh nấm sau thu hoạch của dâu tây, Rhizopus stolonifer và Botrytis cinerea, gây thối rữa và mốc xám Kết quả cho thấy hoạt động kiểm soát sinh học của nấm men được nâng cấp đáng kể bằng cách nuôi cấy trong môi trường có chứa chitosan (Zhang và cộng sự, 2014). Phương thức hoạt động của R mucilaginosa dựa trên việc kích thích các enzyme liên quan như peroxidase và polyphenoloxidase trong thực phẩm, làm tăng tổng hợp các chất chuyển hóa có tác dụng chống nhiễm trùng mầm bệnh (Albertyn và cộng sự, 2014).
R mucilaginosa rất được quan tâm vì nó có khả năng tổng hợp enzyme một cách tự nhiên, có thể ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, đặc biệt là sản xuất phenylalanine amoniac lyase (E.C 4.3.1.24), endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) và lipase (EC 3.1.1.3) Tất cả đều liên quan đến ngành nông nghiệp và hóa chất (Li và cộng sự, 2022). L-phenylalanine amoniac-lyase (PAL; EC 4.3.1.24) là enzyme xúc tác quá trình khử amin L-phenylalanine thành các acid trans-cinnamic và amoniac PAL có mặt rộng rãi trong thực vật bậc cao và nấm men, đóng vai trò chính trong quá trình chuyển hóa của vi sinh vật, cho phép các loài nấm men, nấm mốc và các loài vi khuẩn thuộc chi Streptomyces sử dụng L- phenylalanine làm nguồn carbon và nitơ duy nhất Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các loài Rhodotorula như R mucilaginosa có khả năng tạo ra PAL Người ta đã chứng minh rằng sự hiện diện của PAL phụ thuộc vào việc bổ sung L-phenylalanine Tuy nhiên, có nghiên cứu lại chỉ ra rằng PAL cũng được tạo ra đáng kể trong quá trình thiếu carbon (Li và cộng sự, 2022).
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Chủng giống nấm men R mucilaginosa ATCC ® 66034™ được mua từ
Microbiologics Hòa Kỳ được cấy trên môi trường thạch SDA và ủ ở nhiệt độ 30-32 o C trong 72 giờ đến khi tạo sắc tố màu hồng đến đỏ trên bề mặt thạch Chủng giống trên đĩa thạch được bảo quản ở nhiệt độ -4 ÷ -6 o C và cấy chuyển hàng tháng.
3.1.2 Hóa chất và môi trường
Bảng 3.1 Danh sách các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu.
Tên hóa chất Mã code Xuất xứ
Chất chuẩn β-caroten 7235-40-7 Macklin, Trung Quốc
Ethanol 64-17-5 Xilong, Trung Quốc n-Hexan 110-54-3 Xilong, Trung Quốc
Petrolium ether 8023-23-4 Xilong, Trung Quốc
Lactic acid 79-33-4 Xilong, Trung Quốc
Acetic acid 64-19-7 Xilong, Trung Quốc
Citric acid monohydrate 5949-29-1 Xilong, Trung Quốc
Yeast Extract 8013-01-2 Angelyeast, Trung Quốc
Bảng 3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy sử dụng trong nghiên cứu.
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Bảng 3.3 Danh sách các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Máy tiệt trùng 62L APL, Nhật Bản
Tủ cấy vô trùng BSC Esco, Singapore Máy ly tâm Z366 Hermle, Đức Máy sấy thăng hoa DC401 Yamato, Nhật bản
Tủ lắc ổn nhiệt ISS-3075R Jeio Tech, Hàn Quốc
Bể siêu âm S100H Elma, Đức Cân kĩ thuật LS 2200C Precisa, Thụy Sĩ Cân phân tích LS 220A Precisa, Thụy Sĩ
Tủ đông -40 độ Arctiko, Đan Mạch
Tủ lạnh Toshiba, Nhật Bản
Máy UV-Vis UH-3500 Hitachi, Nhật Bản
Dụng cụ: Ống nghiệm, ống falcon, bình định mức, pipet, micropipet, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, ống đong, cốc thủy tinh…
Phương pháp nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu được thực hiện trong bài bao gồm các phương pháp vi sinh để lưu chủng, nuôi tăng sinh và sinh tổng hợp β-caroten từ chủng nấm men;
21 các phương pháp hóa lý để thu nhận sinh khối nấm men, trích ly β-caroten và các phương pháp tính toán hàm lượng β-caroten bằng đường chuẩn, phân tích sự khác biệt có nghĩa giữa các mẫu Quy trình thực hiện các phương pháp được trình bày ở hình 3.1 dưới đây
Hình 3.1 Quy trình thực hiện các phương pháp nghiên cứu
3.2.1.1 Nuôi cấy và giữ chủng nấm men trên môi trường thạch.
Chuẩn bị môi trường SDA như đã mô tả ở mục 3.1.2 được hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút sau đó để nguội đến 55-60 o C trước khi đổ đĩa thạch Đĩa petri và các dụng cụ cần thiết được tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút và sấy khô trước khi sử dụng Các đĩa thạch được để ít nhất 24g giờ trước khi sử dụng để loại trừ các đĩa nhiễm và đảm bảo mặt thạch, mặt nắp đĩa khô hoàn toàn.
Dùng que cấy, lấy khuẩn lạc nấm men từ đĩa thạch cũ cấy ria trên đĩa thạch mới Ủ đĩa thạch ở 30 o C trong 3 ngày, sau đó bảo quản ở 4 o C để sử dụng.
Hình 3.2 Khuẩn lạc nấm men R mucilaginosa cấy trên đĩa thạch SDA
3.2.1.2 Nuôi tăng sinh tế bào nấm men.
Dùng que cấy vòng, lấy 1 vòng khuẩn lạc từ đĩa thạch chuyển vào môi trường YPD2 đã chuẩn bị phía trên Nuôi lắc ở 30 o C , 125 vòng/phút trong 24 giờ.
Hình 3.3 Môi trường tăng sinh YPD2 trong tủ lắc ổn nhiệt
3.2.1.3 Nuôi cấy nấm men sinh tổng hợp β-caroten.
Dùng micropipet chuyển dịch nuôi cấy nấm men sau 24 giờ trong YPD2 sang bình tam giác 250mL chứa 100mL môi trường YPD10 sao cho OD 660nm ban đầu = 0.1 Nấm men sau khi nuôi cấy tăng sinh trong môi trường YPD2 được nuôi cấy nấm men cho sinh tổng hợp β-caroten ở 30 o C, chế độ lắc 125 vòng/phút trong 5 ngày.
Hình 3.4 Môi trường nuôi cấy YPD10 sau 5 ngày
3.2.2 Phương pháp trích ly β-caroten từ sinh khối nấm men.caroten từ sinh khối nấm men
3.2.2.1 Phương pháp thu nhận sinh khối vi sinh vật.
Ly tâm phần môi trường lên men sau 5 ngày trong bình tam giác ở 5000 vòng/phút trong 10 phút bằng ống falcon 50 mL để thu phần sinh khối nấm men Rửa lại với nước cất 4 lần để loại bỏ môi trường dư Thêm 5mL nước cất, vortex, để tủ -40 o C ít nhất 24 giờ trước khi sấy thăng hoa thu tế bào khô.
Hình 3.5 Sinh khối khô nấm men R mucilaginosa sau khi sấy thăng hoa
3.2.2.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các loại acid trích ly thu β- caroten từ nấm men.
Cân 0.1 gam sinh khối khô nấm men vào ống falcon 15 mL bằng cân phân tích, cho vào các ống 1.5 mL các loại acid citric, lactic và acetic nồng độ 3M Lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó cho vào bể siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 30 o C Ly tâm ống falcon đã siêu âm 3500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ acid, thêm 5 mL dung môi vào các ống falcon chứa sinh khối đã bị phá vỡ bằng acid và sóng siêu âm để trích ly β-caroten, sau đó lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong
10 phút Sau cùng ly tâm ở 3500 vòng trong 10 phút để thu phần dung môi chứa β- caroten.
Bảng 3.4 Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các loại acid trích ly thu β-caroten từ nấm men
Tỉ lệ sinh Tỉ lệ sinh Thời gian
Loại acid khối/acid Dung môi siêu âm acid (M) môi
3.2.2.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid trích ly, thu β- caroten từ nấm men.
Cân 0.1 gam sinh khối khô nấm men vào ống falcon 15 mL bằng cân phân tích, cho vào các ống 1.5 mL acid citric với các nồng độ 1.5M, 2M, 2.5M, 3M, 3.5M Lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó cho vào bể siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 30 o C Ly tâm ống falcon đã siêu âm 3500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ acid, thêm 5 mL dung môi vào các ống falcon chứa sinh khối đã bị phá vỡ bằng acid và sóng siêu âm để trích ly β-caroten, sau đó lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/ phút trong 10 phút Sau cùng ly tâm ở 3500 vòng trong 10 phút để thu phần dung môi chứa β-caroten.
Bảng 3.5 Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid trích ly, thu β-caroten từ nấm men
Tỉ lệ sinh Tỉ lệ sinh Thời gian
Loại acid khối/acid Dung môi siêu âm acid (M) môi
3.2.2.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ sinh khối khô/acid đến quá trình trích ly, thu β-caroten từ nấm men.
Cân 0.1 gam sinh khối khô nấm men vào ống falcon 15 mL bằng cân phân tích, cho vào các ống acid citric nồng độ 3M với các tỉ lệ 1/10, 1/15, 1/20, 1/25 g/mL tương ứng với 1 mL, 1.5 mL, 2 mL, 2.5 mL acid citric cho 0.1 gam sinh khối khô Lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó cho vào bể siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 30 o C Ly tâm ống falcon đã siêu âm 3500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ acid, thêm 5 mL dung môi vào các ống falcon chứa sinh khối đã bị phá vỡ bằng acid và sóng siêu âm để trích ly β-caroten, sau đó lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 10 phút Sau cùng ly tâm ở 3500 vòng trong 10 phút để thu phần dung môi chứa β-caroten.
Bảng 3.6 Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ sinh khối khô/acid đến quá trình trích ly, thu β-caroten từ nấm men.caroten từ nấm men.
Tỉ lệ sinh Tỉ lệ sinh Thời gian
Loại acid khối/acid Dung môi siêu âm acid (M) môi
3.2.2.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi đến quá trình trích ly, thu β-caroten từ nấm men.
Cân 0.1 gam sinh khối khô nấm men vào ống falcon 15 mL bằng cân phân tích, cho vào các ống 1.5 mL acid citric nồng độ 3M Lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó cho vào bể siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 30 o C Ly tâm ống falcon đã siêu âm 3500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ acid, thêm 5 mL các dung môi aceton, ethanol, hexan và petrolium ether vào các ống falcon chứa sinh khối đã bị phá vỡ bằng acid và sóng siêu âm để trích ly β-caroten, sau đó lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/ phút trong 10 phút, ly tâm ở 3500 vòng trong 10 phút để thu phần dung môi chứa β- caroten.
Bảng 3.7 Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi đến quá trình trích ly β-caroten từ nấm men
Tỉ lệ sinh Tỉ lệ sinh Thời gian
Loại acid khối/acid Dung môi siêu âm acid (M) môi
3.2.2.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ sinh khối khô/dung môi đến quá trình trích ly, thu β-caroten từ nấm men.
Cân 0.1 gam sinh khối khô nấm men vào ống falcon 15 mL bằng cân phân tích, cho vào các ống 1.5 mL acid citric nồng độ 3M Lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó cho vào bể siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 30 o C Ly tâm ống falcon đã siêu âm 3500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ acid, thêm dung môi aceton vào các ống falcon chứa sinh khối đã bị phá vỡ bằng acid và sóng siêu âm để trích ly β- caroten với các tỉ lệ 1/40, 1/50, 1/60, 1/70 g/mL tương ứng với 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL acetoncho 0.1 gam sinh khối khô Sau đó lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 10 phút, sau cùng ly tâm ở 3500 vòng trong 10 phút để thu phần dung môi chứa β- caroten.
Bảng 3.8 Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ sinh khối khô/dung môi đến quá trình trích ly, thu β-caroten từ nấm men.caroten từ nấm men
Tỉ lệ sinh Tỉ lệ sinh Thời gian
Loại acid khối/acid Dung môi siêu âm acid (M) môi
3.2.2.7 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian siêu âm đến quá trình trích ly, thu β-caroten từ nấm men.
Cân 0.1 gam sinh khối khô nấm men vào ống falcon 15 mL bằng cân phân tích, cho vào các ống 1.5 mL acid citric nồng độ 3M Lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó cho vào bể siêu âm lần lượt trong 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút ở nhiệt độ 30 o C Ly tâm ống falcon đã siêu âm 3500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ acid, thêm 5 mL dung môi aceton vào các ống falcon chứa sinh khối đã bị phá vỡ bằng acid và sóng siêu âm để trích ly β-caroten, sau đó lắc đều bằng máy vortex ở
1000 vòng/phút trong 10 phút Sau cùng ly tâm ở 3500 vòng trong 10 phút để thu phần
Bảng 3.9 Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian siêu âm đến quá trình trích ly, thu β-caroten từ nấm men
Tỉ lệ sinh Tỉ lệ sinh Thời gian
Loại acid khối/acid Dung môi siêu âm acid (M) môi
3.2.2.8 Phương pháp khảo sát hiệu suất trích ly β-caroten lần hai từ nấm men.
Cân 0.1 gam sinh khối khô nấm men vào ống falcon 15 mL bằng cân phân tích, cho vào các ống 1.5 mL acid citric nồng độ 3M Lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó cho vào bể siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 30 o C Ly tâm ống falcon đã siêu âm 3500 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ acid, thêm 5 mL dung môi aceton vào các ống falcon chứa sinh khối đã bị phá vỡ bằng acid và sóng siêu âm để trích ly β- caroten, sau đó lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 10 phút, ly tâm ở 3500 vòng trong 10 phút để thu phần dung môi chứa β-caroten.
Cho thêm 5 mL dung môi aceton vào ống falon tiến hành trích ly lần 2, sau đó lắc đều bằng máy vortex ở 1000 vòng/phút trong 10 phút, ly tâm ở 3500 vòng trong 10 phút để thu phần dung môi chứa β-caroten trích ly lần 2.
Bảng 3.10 Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát hiệu suất trích ly, thu β-caroten lần hai từ nấm men
Tỉ lệ sinh Tỉ lệ sinh Thời gian
Nồng độ Dung khối/dung Số lần
Loại acid khối/acid siêu âm acid (M) môi môi trích ly
(g/mL) acid citric 3 1/15 Aceton 1/50 30 1 acid citric 3 1/15 Aceton 1/50 30 2
3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng β-caroten từ sinh khối nấm men.caroten
3.2.3.1 Phương pháp định lượng β-caroten bằng đường chuẩn:
Kết quả xây dựng đường chuẩn
4.1.1 Kết quả lựa chọn bước sóng đạt cực đại hấp thụ
Kết quả kết quả khảo sát độ hấp thụ quang tại các bước sóng trong khoảng 400-650 nm được thể hiện ở hình 4.1 bên dưới:
Hình 4.1 Biểu đồ độ hấp thụ quang của mẫu dung môi trích ly trong khoảng 400-650nm
Kết quả cho thấy mẫu dung môi trích ly thu được đạt cực đại hấp thụ tại bước sóng
488 nm Kết quả trên là phù hợp với lý thuyết về quang phổ hấp phụ của carotenoid. Bước sóng cực đại thu được là nằm trong vùng khả kiến Và kết quả gần với 3 giá trị bước sóng cực đại của β-caroten trong dung môi Hexan (Abs, λ max : 425;450;477 nm). Kết quả trên có sự khác biệt do việc lựa chọn dụng môi khác nhau (trong thí nghiệm này sử dụng dung môi Aceton) có thể làm chuyển dịch bước sóng cực đại so với kết quả của những nghiên cứu trước Trong nghiên cứu của Pham, K.D và cộng sự năm 2020, bước sóng hấp thụ cực đại của β-caroten với dung môi aceton là 488 nm.
Vậy đối với dung môi aceton, chọn bước sóng hấp thụ cực đại của β-caroten là 488 nm cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn β-caroten từ sinh khối nấm men.caroten Để xác nhận hàm lượng các mẫu dung môi trích ly, đường chuẩn β-caroten được
31 xây dựng như đã trình bày ở mục 3.2.3.1 Kết quả đo độ hấp thụ quang của dãy chất chuẩn β-caroten tại bước sóng hấp thu cực đại 488 nm được thể hiện trong bảng 4.1 và hình 4.2 dưới đây:
Bảng 4.1 Kết quả đo độ hấp thụ quang của dãy chuẩn β-caroten
Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn β-caroten
Từ đồ thị trên ta có được phương trình đường chuẩn y = 0.1089x - 0.0069 và R² 0.996 Với R² > 99%, kết quả trên cho thấy các giá trị đo được có độ tin cậy cao Nên phương trình đường chuẩn y = 0.1089x - 0.0069 được sử dụng cho việc định lượng β- caroten trong nghiên cứu này.
4.2 Ảnh hưởng của các acid đến hàm lượng β-CAROTENcaroten trích ly từ chủng nấm men
R mucilaginosa Để khảo sát ảnh hưởng của quá trình phá vỡ tế bào bằng acid hữu cơ đến khả năng trích ly β-caroten của nấm men, 3 loại acid được sử dụng là acid citric, acid acetic và acid lactic Sau khi bổ sung các acid, các bước thí nghiệm để thu β-caroten được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.2.2.2, mẫu không sử dụng acid là mẫu đối chứng Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-caroten có màu từ vàng nhạt đến
32 vàng đậm tùy vào hàm lượng β-caroten được trình bày ở hình 4.3, tổng lượng β-caroten thu được với các loại acid khác nhau được trình bày như hình 4.4 dưới đây.
Hình 4.3 β-caroten thu được sau khi phá vỡ tế bào bằng các loại acid khác nhau
Hình 4.4 Ảnh hưởng của các acid đến hàm lượng β-caroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Kết quả hình 4.4 cho thấy mẫu sử dụng acid citric cho hàm lượng β-caroten cao hơn gấp ba lần khi so với mẫu đối chứng không sử dụng acid (60.055 ›g/g so với 20.064 ›g/ g) 2 loại acid còn lại cũng cho hàm lượng β-caroten cao hơn mẫu đối chứng nhưng không đạt hiệu quả như acid citric, hàm lượng β-caroten đạt 46.465 ›g/g đối với mẫu sử dụng acid lactic và 30.579 ›g/g đối với mẫu sử dụng acid acetic.
Từ sự khác biệt giữa các kết quả thu được, có thể kết luận quá trình phá vỡ tế bào bằng acid hữu cơ có ảnh hưởng đến khả năng trích ly β-caroten của nấm men và hiệu quả của các acid cao hay thấp phụ thuộc trên tính acid của các acid, loại acid có tính acid cao hơn sẽ cho hiệu quả phá vỡ tế bào nấm men và khả năng trích ly β-caroten cao hơn, và ngược lại Tính acid của một acid có thể đo và so sánh bằng giá trị hằng số phân ly acid pKa, hằng số phân ly acid càng thấp thì mức độ liên kết giữa proton và phân tử acid càng mạnh, nên tính acid càng cao acid citric có tính acid cao nhất với hằng số pKa là 3.15 ở nhóm carboxyl đầu tiên và 4.77 ở nhóm carboxyl thứ hai, acid lactic có tính acid thấp hơn với hằng số pKa là 3.86 và acid lactic có tính acid thấp nhất với hằng số pKa là 4.76 Trong các loại acid hữu cơ thường gặp trong thực phẩm, acid citric cũng là acid có hằng số pKa thấp nhất.
Vậy chọn acid citric cho quy trình trích ly của nghiên cứu tiếp theo.
4.3 Ảnh hưởng của nồng độ acid đến hàm lượng β-CAROTENcaroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid hữu cơ đến khả năng trích ly β-caroten của nấm men, 5 nồng độ acid được sử dụng là 1.5M, 2M, 2.5M, 3M và 3.5M Sau khi bổ sung acid ở các nồng độ, các bước thí nghiệm để thu β-caroten được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.2.2.3 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β- caroten có màu từ vàng nhạt đến vàng đậm tùy vào hàm lượng β-caroten được trình bày ởhình 4.5, tổng lượng β-caroten thu được với các nồng độ acid khác nhau được trình bày như hình 4.6 dưới đây.
Hình 4.5 β-caroten thu được sau khi phá vỡ tế bào trong các nồng độ acid khác nhau
Hình 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ acid đến hàm lượng β-caroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Kết quả hình 4.6 cho thấy hàm lượng β-caroten thu được tăng dần và đạt tối đa ở mẫu có nồng độ 3M với 60.005 ›g/g Khi tiếp tục tăng nồng độ acid lên 3.5M, hàm lượng β-caroten không có sự khác biệt với 59.412 ›g/g Việc bổ sung acid phá vỡ tế bào nấm men bằng cách tăng tính acid của môi trường Và tính acid của môi trường phụ thuộc vào nồng độ acid của môi trường, càng tăng nồng độ acid thì tính acid của môi trường càng tăng, hiệu quả phá vỡ tế bào càng cao Khi nồng độ acid đạt 3M, tính acid của môi trường đạt nhưỡng giới hạn nên hàm lượng β-caroten thu được không có sự khác biệt khi nồng độ lên 3.5M và có xu hướng giảm nếu tiếp tục nồng độ acid lên quá cao, do sự phân hủy của các sắc tố trong môi trường acid (Gunerken và cộng sự, 2015).
Vậy chọn nồng độ acid 3M sử dụng cho quy trình trích ly của nghiên cứu tiếp theo.
4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/acid đến hàm lượng β-CAROTENcaroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa Để khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ sinh khối khô/acid đến khả năng trích ly β-caroten của nấm men, 4 mức tỉ lệ được sử dụng là 1/10 g/mL, 1/15 g/mL, 1/20 g/mL, 1/25 g/mL. Sau khi bổ sung acid ở các tỉ lệ, các bước thí nghiệm để thu β-caroten được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.2.2.4 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-caroten có màu từ vàng nhạt đến vàng đậm tùy vào hàm lượng β-caroten được trình bày ở hình 4.7, tổng lượng β-caroten thu được với các tỉ lệ sinh khối khô/acid khác nhau
35 được trình bày như hình 4.8 dưới đây.
Hình 4.7 β-caroten thu được sau khi phá vỡ tế bào trong các tỉ lệ sinh khối khô/acid khác nhau
Hình 4.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/acid đến hàm lượng β-caroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Kết quả hình 4.8 cho thấy khi tỉ lệ sinh khối khô/acid tăng, hàm lượng β-caroten thu được tăng với 49.908 ›g/g ở tỉ lệ 1/10 g/mL và 60.005 ›g/g ở tỉ lệ 1/15 g/mL Do tỉ lệ sinh khối khô/acid càng tăng thì lượng acid trong môi trường càng tăng, dẫn đến hiệu quả phá vỡ tế bào và khả năng trích ly β-caroten càng cao Lượng acid có trong môi trường ở tỉ lệ 1/10 g/mL là 0.3 mol acid citric và ở tỉ lệ 1/15 g/mL là 0.45 mol acid citric.
Khi tiếp tục tăng tỉ lệ acid lên 1/20 và 1/25 thì hàm lượng β-caroten có xu hướng
36 giảm với 46.097 ›g/g ở tỉ lệ 1/20 g/mL và 39.899 ›g/g ở tỉ lệ 1/25 g/mL Lý do là vì thể tích tăng làm cho mật độ tế bào trên thể tích môi trường giảm, khả năng va đập giữa các tế bào trong quá trình siêu âm giảm xuống, dẫn đến sự phá vỡ tế bào của quá trình siêu âm không đạt hiệu quả, hàm lượng β-caroten thu được giảm xuống đáng kể Từ đó có thể kết luận tỉ lệ sinh khối khô/acid không những ảnh hưởng đến quá trình phá vỡ tế bào mà còn có sự ảnh hưởng nhất định đến các yếu tố khác liên quan đến quá trình trích ly β-caroten Cần xác định tỉ lệ tối ưu để đạt hiệu quả cao và ảnh hưởng đến các yếu tố khác.
Vậy chọn lỉ lệ sinh khối khô/acid là 1/15 g/mL sử dụng cho quy trình trích ly của nghiên cứu tiếp theo.
4.5 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng β-CAROTENcaroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa Để khảo sát khả năng tách chiết β-caroten từ nấm men của các dung môi, 4 loại dung môi được lựa chọn là aceton, ethanol, hexan và petrolium ether Sau khi ly tâm loại bỏ acid, các dung môi được thêm vào với tỷ lệ 1g sinh khối khô: 50 mL dung môi. Các bước thí nghiệm thu β-caroten được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.2.2.3 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-caroten có màu từ vàng nhạt đến vàng đậm tùy vào hàm lượng β-caroten được trình bày ở hình 4.9, tổng lượng β-caroten thu được với các tỉ lệ sinh khối khô/acid khác nhau được trình bày như hình 4.10 dưới đây.
Hình 4.9 β-caroten thu được sau khi phá vỡ tế bào trong các dung môi khác nhau
Hình 4.10 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng β-caroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Kết quả hình 4.4 cho thấy hàm lượng β-caroten thu được bằng dung môi aceton là 60.055 ›g/g cao hơn gấp đôi so với dung môi ethanol là 30.533 ›g/g Trong khi hàm lượng β-caroten khi sử dụng dung môi hexan và petrolium ether là khá thấp lần lượt là 5.464 ›g/g và 5.234 ›g/g.
Các lý thuyết về độ hòa tan của carotenoid cho thấy, carotenoid tan trong các chất béo và trong các dung môi như như aceton, ethanol, diethylether, và cloroform β- caroten thuộc nhóm caroten tan tốt trong các dung môi không phân cực như hexan Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm của nhóm nghiên cứu cho thấy khả năng trích ly β-caroten của hexan thấp hơn so với aceton Hiện nay, chưa có nghiên cứu so sánh khả năng trích ly β-caroten từ nấm men bằng 4 dung môi được sử dụng kể trên Các nghiên cứu về việc trích ly nhóm caroten bằng dung môi hexan được thực hiện chủ yếu trên đối tượng thực vật như Inci Çinar (2005) sử dụng dung môi hexan để tách chiết carotenoid từ vỏ cam, cà chua và cà rốt Butnariu (2016) đã nghiên cứu và kết luận hexan là dung môi tốt nhất để tách chiết nhóm caroten ở thực vật. Đối với các đối tượng vi sinh vật, đặc biệt là nấm men các nghiên cứu hiện nay đều sử dụng dung môi aceton Trong nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết tách carotenoid từ Rhodobacter sphaeroides của Zhenxin Gu và cộng sự (2007) cũng sử dụng dung môi aceton để thực hiện quy trình trích ly carotenoid Nghiên cứu của Šovljanski và cộng sự (2022) cho thấy đối với chủng Rhodotorula mucilaginosa hàm lượng carotenoid thu
38 được tối đa khi sử dụng dung môi trích ly là aceton.
Như vậy, kết quả thí nghiệm trên của nhóm nghiên cứu phù hợp với những các phương pháp trích ly carotenoid từ vi sinh vật hiện nay Từ kết quả thí nghiệm trên, aceton được lựa chọn làm dung môi trích ly cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/dung môi đến hàm lượng β-caroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
từ chủng nấm men R mucilaginosa Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/dung môi đến hiệu quả tách chiết β-caroten từ nấm men của các dung môi từ nấm men Tiến hành khảo sát các tỷ lệ sinh khối khô/dung môi lần lượt là 1/40, 1/50, 1/60 đến 1/70 g/ml Các bước thí nghiệm thu β-caroten được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.2.2.5 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-caroten có màu từ vành nhạt đến vàng đậm tùy vào hàm lượng β-caroten được trình bày ở hình 4.11, tổng lượng β-caroten thu được ở các tỉ lệ sinh khối khô/dung môi khác nhau được trình bày trong hình 4.12 dưới đây.
Hình 4.11 β-caroten thu được sau khi phá vỡ tế bào trong các tỉ lệ sinh khối khô/dung môi khác nhau
Hình 4.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/dung môi đến hàm lượng β-caroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Kết quả thu được từ hình 4.10 cho thấy, tỷ lệ sinh khối khô/dung môi có ảnh hưởng đế quá trình trích ly β-caroten từ nấm men Khi tỷ lệ dung môi thấp thì khả năng hòa tan β-caroten vào dung môi thấp dẫn đến hàm lượng β-caroten thu được thấp hơn Tuy nhiên ở các tỷ lệ sinh khối khô/dung môi 1/50, 1/60 và 1/70, hàm lượng β-caroten thu được không có sự khác biệt quá lớn Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/dung môi (g/ml) thể hiện qua hàm lượng β-caroten thu được ở các tỷ lệ 1/40, 1/50, 1/60 và 1/70 lần lượt là 51.717 ›g/g, 60.055 ›g/g, 59.890 ›g/g, 60.422 ›g/g Ở các tỷ lệ 1/50, 1/60 và 1/70 không có sự sai khác nhiều về mặt ý nghĩa thống kê (Phụ lục 2 và 7).
Vậy để lượng dung môi sử dụng ít nhât, từ đó giúp tiết kiệm chi phí, đồng thời giảm hạn chế tối đa tác hại đối với môi trường, chúng tôi chọn tỷ lệ sinh khối khô/dung môi là 1/50 cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.7 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng β-CAROTENcaroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu quả tách chiết β-caroten từ nấm men, thí nghiệm khảo sát khả năng phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm trong dãy thời gian 0 đến 50 phút Các bước thí nghiệm thu β-caroten được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.2.2.6 Các mẫu dung môi sau khi trích ly β-caroten có màu từ vành nhạt đến vàng đậm tùy vào hàm lượng β-caroten được trình bày ở hình 4.13, tổng lượng β-caroten thu được ở các mốc thời gian siêu âm khác nhau được trình bày trong hình 4.14 dưới đây.
Hình 4.13 Các mẫu dung môi sau trích ly trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng β-caroten
Hình 4.14 β-caroten thu được sau khi phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm
Từ hình 4.14 trên cho thấy, việc sử dụng sóng siêu âm hổ trợ rất lớn cho quá trình trích ly β-caroten từ nấm men Thời gian sử dụng sóng siêu âm cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả trích ly β-caroten Trong khoảng 10 phút đầu tiên siêu âm hàm lượng β-caroten thu được 30.164 ›g/g, không có sự khác biệt quá lớn so với mẫu không sử dụng sóng siêu âm 28.834 ›g/g Hàm lượng β-caroten tăng nhanh từ sau phút thứ 10 và được đạt tối đa sau 30 phút siêu âm, với hàm lượng thu được là 60.055 ›g/g Khi thời gian xử lý siêu âm kéo dài hơn 30 phút thì hàm lượng β-caroten thu được giảm đi, ở 40 phút và 50 phút lượng β-caroten thu được lần lượt là 40.771 ›g/g và 37.006 (›g/g).
Theo Ye và cộng sự (2011), sóng siêu âm hiệu quả quá trình phá vỡ tế bào nhờ vào khả năng tạo ra một dòng chảy hỗn loạn bên trong chất lỏng Trong quá trình này, các hạt trong chất lỏng va chạm với nhau với tốc độ cao Tương tư, nghiên cứu của (Liu và cộng sự, 2022) về sóng siêu âm cũng chỉ ra những tác động đối lưu được tạo ra bởi sự sản sinh và phá hủy liên tục các bọt bong bóng, làm gia tăng thêm sự dao động của dịch lỏng gây ra bởi quá trình truyền của sóng siêu âm Như vậy, sóng siêu âm có vai trò quan trọng trong việc phá vỡ tế bào, tạo điều kiện cho các dung môi xâm nhập hòa tan β-caroten Cũng trong nghiên cứu của Ye và cộng sự, 2011, thời gian siêu âm cũng là một thông số ảnh hưởng đến năng suất trích ly vì có khả năng sinh nhiệt hoặc tạo ra các gốc tự do trong dung môi. Ởthí nghiệm trên, nhiệt độ của mẫu trong quá trình siêu âm được kiểm soát ở nhiệt độ phòng Như vậy hàm lượng β-caroten giảm dần khi ta thực hiện siêu âm kéo dài hơn
30 phút, nguyên nhân có thể là do: Trong quá trình siêu âm, dung môi có khả năng tạo ra các gốc tự do Nếu điều này xảy ra, các cấu trúc β-caroten sẽ bị phá hủy theo hai cách khác nhau: thứ nhất, các liên kết đôi trong carotenoid sẽ được cung cấp oxy để tạo ra C=O, và thứ hai, các chuỗi phân tử β-caroten sẽ bị phá vỡ hoặc polyme hóa.
Như vậy, thời gian siêu âm 30 phút được lựa chọn sử dụng cho quy trình trích ly của nghiên cứu tiếp theo.
4.8 Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hàm lượng β-CAROTENcaroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Tiến hành thực hiện trích ly lần 2 đối với mẫu có các điều kiện thí nghiệm tối ưu ở được nêu ở các thí nghiệm trên Mẫu sử dụng dung môi aceton tỷ lệ 1g sinh khối khô:50 ml, bằng acid citric có nồng độ 3M với tỉ lệ 1g sinh khối khô:15 mL acid, thời gian siêu âm 30 phút Các bước thí nghiệm thu β-caroten được tiến hành như đã trình bày trong phần phương pháp mục 3.2.2.7 Các mẫu dung môi của hai lần trích ly được thể hiện ở hình 4.15, tổng lượng β-caroten thu được ở các lần trích ly được trình bày ở hình 4.16 đồ dưới đây.
Hình 4.15 β-caroten thu được sau khi phá vỡ tế bào trong 2 lần
Hình 4.16 Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hàm lượng β-caroten trích ly từ chủng nấm men R mucilaginosa
Kết quả nghiên cứu cho thấy sau lần trích ly thứ 2, hàm lượng β-caroten thu được chỉ đạt 5.464 ›g/g, khoảng 9.1% so với lần trích ly thứ nhất Tổng hàm lượng β- caroten thu được sau cả 2 lần trích ly là 65.591 ›g/g So sánh với nghiên cứu của Perrier và cộng sự, nghiên cứu thành phần acid béo và carotenoid của các chủng Rhodotorula cho thấy, tổng hàm lượng β-caroten có trong chủng nấm men R mucilaginosa là 75 ›g/ g sinh khối khô Dựa vào kết quả này, có thể kết luận các điều kiện trích ly β-caroten trong các thí nghiệm trên đạt được hiệu suất khá cao.
Tuy nhiên, với tỷ lệ β-caroten thu được ở lần trích ly thứ 2 không đạt mức trên 10%, chúng tôi nhận thấy rằng việc tiến hành lần trích ly thứ 2 không còn cần thiết Quy trình trích ly chỉ cần thực hiện 1 lần sẽ đem lại hiệu quả kinh tế tốt nhất trong việc thu hồi β-caroten từ nấm men.
Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hàm lượng β-caroten trích ly từ chủng nấm
Trên cơ sở kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: Đã tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly β-caroten từ chủng nấm men Rhodotorula mucilaginosa và xác định các điều kiện trích ly tối ưu:
-Khảo sát ảnh hưởng của acid xác định acid citric.
-Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid xác định nồng độ 3M.
-Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/acid xác định tỉ lệ 1/15 g/mL.
-Khảo sát ảnh hưởng của các dung moi khác nhau xác định dung môi aceton.
-Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/dung môi xác định tỉ lệ 1/50 g/mL.
-Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ly tâm xác định thời gian 30 phút.
-Khảo sát hiệu suất trích ly lần 2 không đạt hiệu quả.
Kết quả cho thấy quá trình trích ly β-caroten từ Rhodotorula mucilaginosa thu được đạt 60.055 ± 3.929 ›g/g sinh khối khô ở điều kiện tối ưu.
Hợp chất β-caroten thu được ở dạng hòa tan trong dung môi aceton.
Như vậy, trích ly β-caroten từ chủng nấm men Rhodotorula mucilaginosa với các điều kiện trên là một quy trình khả thi, an toàn và ít tốn kém Các dung môi và acid được lựa chọn phù hợp với mục đích của nghiên cứu, lựa chọn các chất hữu cơ nhằm giảm rủi ro và và tác hại đến môi trường đồng thời đem lại hiệu quả trích ly cao.
Do tính ứng dụng cao và tiềm năng của hợp chất β-caroten, chúng tôi có một số kiến nghị sau:
-Tiến hành khảo sát ở một số acid hữu cơ khác để tìm ra loại acid có hiệu quả trích ly tốt.
