Nghiên cứu thành phần hóa ho sát học và k h ả ạ t tính s inh h ọ c

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học lồi Thơng đá (Lycopodium clavatum L.) Việt Nam NGUYỄN THÀNH NAM Nam.NT20202930M@sis.hust.edu.vn Chuyên ngành: Hóa học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Thông Viện: Kỹ thuật hóa học Hà Nội, 2023 Chữ ký GVHD CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: Nguyễn Thành Nam Đề tài luận văn: Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học lồi Thơng đá (Lycopodium clavatum L.) Việt Nam Chuyên ngành: Hóa học Mã số HV: 20202930M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 28/04/2023 với nội dung sau: Bổ sung mục tiêu nội dung nghiên cứu phần mở đầu Bổ sung chữ viết tắt vào bảng danh mục từ viết tắt Bổ sung thêm mục: “Hóa chất, dụng cụ nghiên cứu” Chương II Phần nội dung sửa lại lỗi tả hành văn theo yêu cầu bổ sung sửa chữa 02 giảng viên Phản biện Thống lại cách viết tài liệu tham khảo, sửa lỗi tả bổ sung số trang, tập, tên báo với tài liệu thiếu Ngày 04 tháng 05 năm 2023 Giảng viên hướng dẫn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Tác giả luận văn ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học lồi Thơng đá (Lycopodium clavatum L.) Việt Nam Giảng viên hướng dẫn Nguyễn Văn Thông i LỜI CẢM ƠN Phần thực nghiệm luận văn hồn thành Phịng thí nghiệm Hóa hữu – Phịng 421-C1 thuộc mơn Hóa hữu cơ, Viện Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách khoa Hà Nội Viện Hóa sinh biển, VAST Em xin cảm ơn tới thầy mơn Hóa hữu Ban lãnh đạo viện Kỹ thuật Hóa học cán Phịng Dược liệu biển - Viện Hóa sinh biển, VAST tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến giảng viên TS.DS Nguyễn Văn Thông – người hướng dẫn em với nhiều thời gian, tình cảm tâm huyết từ em cịn sinh viên trường để em hoàn thành Đồ án tốt nghiệp luận văn thạc sỹ Em xin gửi lời cảm ơn đến bạn sinh viên phòng 421-C1 hỗ trợ em nhiệt tình q trình thực nghiệm trường TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SỸ Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học lồi Thơng đá (Lycopodium clavatum L.) Việt Nam Tác giả luận văn: Nguyễn Thành Nam SHHV: 20202930M Chuyên ngành: Hóa học Lớp: CH2020B Người hướng dẫn: TS.DS Nguyễn Văn Thơng Đơn vị: Bộ mơn Hóa hữu cơ, Viện Kỹ thuật hóa học, Đại học Bách khoa Hà Nội Lý chọn đề tài Các nghiên cứu đại giới lồi Thơng đá (Lycopodium clavatum L.) nhiều loài chi nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc hoạt tính sinh học hợp chất cho thấy kết khả quan tiềm ứng dụng dược phẩm Vì vậy, để làm phong phú tìm hiểu khác biệt thành phần cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học hợp chất Thông đá nước ta so với nước khác em xin chọn đề tài: ‘'Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học lồi Thơng đá (Lycopodium clavatum L.) Việt Nam’’ ii Mục đích nghiên cứu luận văn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu 2.1 Mục đích nghiên cứu Phân lập hợp chất từ dịch chiết Thông đá phương pháp sắc ký kết hợp Xác định cấu trúc hợp chất phân lập phương pháp phổ đại Cuối thử hoạt tính sinh học ức chế sản sinh nitric oxide (NO) gây độc tế bào ung thư hợp chất Từ kết thử nghiệm định hướng phát triển ứng dụng cho hợp chất 2.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Tồn Thơng đá (Lycopodium clavatum L.) thu hái tháng năm 2018 huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai Phương pháp nghiên cứu - Mẫu nghiên cứu xử lý phương pháp ngâm chiết siêu âm chiết phân bố lỏng – lỏng - Phân lập hợp chất phương pháp sắc ký cột (CC) sử dụng chất hấp phụ khác (silica gel pha thuận, silica gel pha đảo), sắc ký lớp mỏng (TLC) - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp phổ 1D 2D-NMR, đồng thời kết hợp so sánh với liệu phổ cơng trình nghiên cứu công bố trước - Tất chất phân lập thử nghiệm hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) với phương pháp phản ứng thuốc thử Griess phân giải MTT khảo sát phổ UV-VIS Đồng thời tiến hành thử gây độc số dòng tế bào ung thư với hợp chất phân lập điều kiện in vitro theo phương pháp Monks Các nội dung đóng góp đề tài 4.1 Các nội dung - Xây dựng sơ đồ chiết cao từ Thông đá với dung môi methanol - Phân lập xác định cấu trúc hóa học chất từ dịch chiết methanol Thông đá - Thử nghiệm hoạt tính sinh học: ức chế sản sinh nitric oxide (NO) gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ Thơng đá iii 4.2 Đóng góp đề tài Phát 04 triterpenoid nguồn nguyên liệu Thông đá huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai, Việt Nam Thử nghiệm phát khả chống sản sinh nitric oxide tất hợp chất phân lập khả gây độc tế bào ung thư số hợp chất Kết luận Sau thời gian nghiên cứu thực nghiệm, đề tài thu số kết sau: - Thu 440 g cặn chiết methanol, từ chiết phân đoạn thu 108 g cặn chiết n-hexane, 126 g cặn chiết dichloromethane 36 g cặn chiết ethyl acetate từ 2,0 kg mẫu bột khô Thông đá - Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phân đoạn cặn chiết dichloromethane ethyl acetate Thông đá Tên gọi hợp chất là: 21-epi-serratenediol (LCL1), methyl lycernuate A (LCL2), 16-oxo-serratenediol (LCL3) tohogenol (LCL4) - Cả hợp chất phân lập được thử nghiệm hoạt tính gây độc số dịng tế bào ung thư người HeLa, Hep-G2, A549 cho thấy hợp chất 16-oxoserratendiol (LCL3) có khả ức chế dòng tế bào A549 với giá trị IC50 57,63±3,08 µM Đồng thời, thử nghiệm khả ức chế sản sinh NO cho thấy hợp chất có khả ức chế với % ức chế đạt 23,9-47,45% nồng độ 40 μM Học viên Nguyễn Thành Nam iv MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CHUNG ix CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thực vật 1.1.1 Thực vật họ Thạch tùng (Lycopodiaceae) 1.1.2 Thực vật chi Lycopodium 1.1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố địa lý chi Lycopodium 1.1.2.2 Công dụng chi Lycopodium 1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học chi Lycopodium 1.1.3 Thực vật Thông đá (Lycopodium clavatum L.) 16 1.1.3.1 Đặc điểm thực vật công dụng Thông đá 16 1.1.3.2 Tình hình phân bố, thu hái chế biến lồi Thơng đá 17 1.1.3.3 Tính vị, tác dụng cơng dụng Thơng đá 18 1.2 Tình hình nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học Thông đá 18 1.2.1 Các loại hợp chất phân lập từ Thông đá 18 1.2.1.1 Các alkaloid phân lập từ Thông đá 18 1.2.1.2 Các terpenoid phân lập từ Thông đá 19 1.2.1.3 Các flavonoid phân lập từ Thông đá 20 1.2.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất Thơng đá 21 1.2.2.1 Hoạt tính chống ung thư 21 1.2.2.2 Hoạt tính bảo vệ gan 21 1.2.2.3 Hoạt tính chống oxy hóa 22 1.2.2.4 Hoạt tính chống độc kháng vi sinh vật 22 1.2.2.5 Hoạt tính giảm đau 22 1.2.2.6 Hoạt tính kháng viêm 22 1.2.2.7 Hoạt tính tác động lên hệ thần kinh trung ương 23 1.2.2.8 Hoạt tính kích thích miễn dịch 23 1.2.2.9 Một số hoạt tính khác 23 v CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu chiết 25 2.2.2 Các phương pháp phân lập hợp chất 25 2.2.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 26 2.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học 26 2.2.4.1 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 26 2.2.4.2 Thử hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) 28 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM 32 3.1 Chiết mẫu thực vật phân lập hợp chất Thông đá 32 3.1.1 Sơ đồ ngâm chiết mẫu thực vật t 32 3.1.2 Sơ đồ phân lập hợp chất 32 3.2.2 Thông số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập từ lồi Thơng đá 34 3.2 Thử nghiệm hoạt tính sinh học 35 3.2.1 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 35 3.2.2 Thử hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide 35 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Nguyên liệu thực vật 36 4.2 Các hợp chất phân lập 36 4.2.1 Hợp chất LCL1: 21-epi-Serratenediol 36 4.2.2 Hợp chất LCL2: Methyl lycernuate A 39 4.2.3 Hợp chất LCL3: 16-oxo-Serratenediol 41 4.2.4 Hợp chất LCL4: Tohogenol 43 4.3 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học 45 4.3.1 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 45 4.3.2 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide 45 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ 48 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC PHỔ 56 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 So sánh giá trị δC để xác định cấu hình C-3 C-21 LCL1 37 Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR hợp chất LCL1 hợp chất tham khảo 38 Bảng 4.3 Số liệu phổ NMR hợp chất LCL2 hợp chất tham khảo 40 Bảng 4.4 Số liệu phổ NMR hợp chất LCL3 hợp chất tham khảo 42 Bảng 4.5 Số liệu phổ NMR hợp chất LCL4 hợp chất tham khảo 44 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây Thơng đất phi lao (trái) thông đất dẹt (phải) Hình 1.2 Bộ khung cấu trúc lớp lycopodine, lycodine fawcettimine Hình 1.3 Cấu tạo hợp chất 1-8 Hình 1.4 Cấu tạo hợp chất 9-15 Hinh 1.5 Cấu tạo hợp chất 16-19 10 Hình 1.6 Cấu tạo hợp chất 20 - 22 11 Hình 1.7 Cấu tạo hợp chất 23-28 12 Hình 1.8 Cấu trúc khung phlegmarine hợp chất 29-31 13 Hình 1.9 Cấu tạo hợp chất 32-34 14 Hình 1.10 Cấu tạo hợp chất 35-39 15 Hình 1.11 Cấu tạo hợp chất 40, 41 16 Hình 1.12 Cây Thơng đá ngồi tự nhiên với túi bào tử 17 Hình 1.13 Cấu tạo hợp chất 42-49 19 Hình 1.14 Cấu tạo hợp chất 50-53 19 Hình 1.15 Cấu tạo hợp chất 54-63 20 Hình 1.16 Cấu tạo hợp chất 64-66 20 Hình 1.16 Cấu tạo hợp chất 67-69 21 Hình 2.1 Mẫu thực vật Thông đá 24 Hình 2.2 Cơ chế phản ứng với thuốc thử Griess 29 Hình 2.3 Phương trình phản ứng phân giải MTT thành formazan 29 Hình 3.1 Sơ đồ ngâm chiết chiết phân đoạn Thông đá 32 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ Thông đá 33 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC LCL1 36 Hình 4.2 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC LCL2 39 Hình 4.3 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC LCL3 41 Hình 4.4 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC LCL4 43 viii Phổ HSQC hợp chất LCL1 60 Phổ HMBC hợp chất LCL1 61 Phụ lục Các phổ hợp chất LCL2 (Methyl lycernuate A) Phổ 1H-NMR hợp chất LCL2 20 19 25 10 HO H 3COC 24 O 11 12 26 13 14 23 62 27 18 28 15 17 16 21 O H 22 30 29 O Phổ 13 C-NMR hợp chất LCL2 63 Phổ HSQC hợp chất LCL2 64 Phổ HMBC hợp chất LCL2 65 Phụ lục Các phổ hợp chất LCL3 (16-oxoserratenediol) Phổ 1H-NMR hợp chất LCL3 20 19 12 HO 25 10 24 11 13 18 21 22 17 26 28 14 16 O 15 27 23 66 OH 30 29 Phổ 13 C-NMR hợp chất LCL3 67 Phổ HSQC hợp chất LCL3 68 Phổ HMBC hợp chất LCL3 69 Phụ lục Các phổ hợp chất LCL1 (Tohogenol) Phổ 1H-NMR hợp chất LCL4 20 19 12 HO 25 10 24 11 13 18 28 26 14 15 OH 27 23 70 21 22 17 16 OH 30 29 Phổ 13 C-NMR hợp chất LCL4 71 Phổ HSQC hợp chất LCL4 72 Phổ HMBC hợp chất LCL4 73 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA LUẬN VĂN Bài báo Bài báo: “Nghiên cứu cấu trúc số terpenoid từ lồi Thơng đá (Lycopodium clavatum L.) Việt Nam hoạt tính gây độc tế bào chúng” Các tác giả: Nguyễn Văn Thông, Nguyễn Thành Nam, Trần Thu Hương, Lê Thị Thùy Đăng Tạp chí Hóa học ứng dụng, duyệt đăng số 2(65)/2023, xuất tháng 06/2023 74