Bài tiểu luận phân tích khối phổ

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỈ THUẬT MÔI TRƯỜNG  oOo  Đề tài: PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ BÀI TIỂU LUẬN TỔ Mơn: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI Giảng viên hướng dẫn: Hồ Thị Tiến ểu Ti ận lu nh ki tế ới m TP HCM, Tháng 12 năm 2015 ất nh BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỈ THUẬT MÔI TRƯỜNG  oOo  hufi Đề tài: PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ BÀI TIỂU LUẬN NHĨM Mơn: KỶ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI Giảng viên hướng dẫn: Hồ Thị Tiến Nhóm sinh viên thực Nguyễn Văn Thanh Tồn Huỳnh Ngọc Quang Nguyễn Thanh Duy Huỳnh Thanh Hải 3008140299 3008140018 3008140188 3008140339 ểu Ti ận lu nh ki tế ới m TP.HCM, Tháng 12 năm 2015 ất nh LỜI CẢM ƠN Chúng xin trân thành cảm ơn Hồ Thị Tiến tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian học tập.Một lần nhóm chúng tơi xin trân thành cảm ơn cô Mặc dù tiểu luận hồn thành khó tránh sai sót.Mong nhận đóng góp ý kiến thầy bạn để tiểu luận hoàn thiện Từ đó,chúng tơi có thêm nhiều kinh nghiệm để thực tiều luận đồ án sau nghề nghiệp tương lai Sau xin chúc cô Hồ Thị Tiến tồn thể thầy Khoa thật dồi sức khỏe, niềm vui để tiếp tục thực sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho hệ mai sau Trân trọng cảm ơn! NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN ểu Ti ận lu nh ki tế ới m ất nh i LỜI CAM ĐOAN Chúng xin cam đoan: Bài tiểu luận thành viên nhóm chung tay làm việc,có phân công rõ ràng công thành viên nhóm Đồng thời, khơng chép tiểu luận Các nội dung báo cáo tham khảo kỉ lưỡng trước đưa vào tiều luận.Chúng chịu hồn tồn trách nhiệm trước Khoa cam đoan TP.HCM, ngày tháng 12 năm 2015 NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN ểu Ti ận lu nh ki tế ới m ất nh ii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT EI Electron Impact (va chạm electron) CI Chemical Ionization (Ion hóa hóa học) ESI Electrospray Ionization (ion hóa tia lửa điện) TSI Thermospray Ionization (ion hóa nhiệt) APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionzation (ion hóa hóa học áp suất khí quyển) FAB tử) Fast- Atom Bombardment (bắn phá nhanh nguyên FIB Fast- Ion Bombardment (bắn phá nhanh ion) MALDI giải hấp laser) Matrix- Assisted Laser Desorption Ionization (ion TOF Time- Of Flight analyser (bộ phân tích thời gian bay) ICR Ion Cyclotron Resonance Analyser (bộ phân tích cộng hưởng ion cylotron) ểu Ti ận lu nh ki tế ới m ất nh iii DANH MỤC CÁC BẢNG Số thứ tự Tên bảng Trang Bảng 3.1: Đồng vị bền số nguyên tố Bảng 3.2: Kết khảo sát lượng đồng vị Bảng 3.3: Thành phần hoá học tinh dầu từ gỗ Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) phân bố Tây Côn Lĩnh Bảng 3.4: Dư lượng kháng sinh quinolone (ng.g-1) mẫu thịt gà, thịt heo, tôm, cá diêu hồng 11 12 ểu Ti ận lu nh ki tế ới m ất nh iv 13 15- 16 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH Số thứ tự Tên hình Trang Hình 1.1: Máy khối phổ 2 Hình 2.1: Sơ đồ khối máy khối phổ Hình 2.2 : Giao diện ESI máy khối phổ sơ đồ tạo ion dương bằng ng̀n ESI Hình 2.3: Giao diện APCI cột HPLC vả máy khối phổ Hình 2.4: Sơ đồ mơ tả hoạt động hệ thống MALDI Hình 2.5: Biểu đồ lựa chọn kiểu tạo ion Hình 2.6: Bộ phân tích từ hội tụ đơn Hình 2.7: Bộ phân tích tứ cực đơn Hình 2.8: Sơ đồ bẫy ion Hình 2.9: Bộ phân tích tứ cực chập ba Hình 2.10: Sơ độ phân tích thời gian bay TOF Hình 2.11: Sơ đồ bẫy Penning trình tạo tín hiệu Hình 3.1: Sự thay đổi cấu dạng cảm ứng với cAMP Epac2 xác định DXMS Hình 3.2: Đường hồi qui quinolone 3 10 11 12 13 14 ểu Ti ận lu nh ki tế ới m ất nh v 6 7 9 10 10 14 15 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN .ii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH .v LỜI MỞ ĐẦU I GIỚI THIỆU .2 1.1 Tổng quan 1.2 Nguyên lý khối phổ .3 II MÁY KHỐI PHỔ 2.1 Tổng quan máy khối phổ .3 2.2 Nguyên lí làm việc máy khối phổ 2.3 Chi tiết phận máy khối phổ 2.3.1 Bộ nạp mẫu: Có thể phân thành hai nhóm chính: .4 2.3.1.1 Nạp mẫu trực tiếp 2.3.1.2 Nạp mẫu gián tiếp 2.3.2 Bộ nguồn ion .4 2.3.2.1 Va chạm electron (EI) 2.3.2.2 Ion hóa hóa học (CI) 2.3.2.3 Nguồn ion phun sương khử solvat 2.3.2.4 Nguồn ion hóa giải hấp 2.3.3 Bộ phân tích khối Bộ phận tích từ 2.3.3.2 Bộ phân tích tứ cực .8 2.3.3.4 Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (ICR) 10 lu Detector .11 ận 2.3.4 Bộ phân tích thời gian bay (TOF) .10 ểu 2.3.3.3 Ti 2.3.3.1 Nhân electron 11 2.3.4.2 Nhân quang 11 nh ki 2.3.4.1 III ỨNG DỤNG 11 tế 3.1 Xác định đồng vị .11 3.1.1 Cơ sở lí thuyết 11 ới m 3.1.2 Ví dụ minh họa 12 3.2 Định tính 12 ất nh 3.2.1 Cơ sở lí thuyết 12 3.2.2 Ví dụ minh họa 12 3.3 Xác định công thức cấu tạo 14 3.3.1 Cơ sở lí thuyết 14 3.3.2 Ví dụ minh họa 14 3.4 Định lượng 15 3.4.1 Cơ sở lí thuyết 15 3.4.2 Ví dụ minh họa 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 17 ểu Ti ận lu nh ki tế ới m ất nh PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ LỜI MỞ ĐẦU Trong phát triển xã hội ngày nay, tất cơng việc giới hóa đại hóa phù hợp với xã hội ngày văn minh Các nghành khoa học cần phải đổi đại nghành khoa học nghiên cứu Nghành Công Nghệ Sinh Học số Là ngành khoa học nghiên cứu với kỉ thuật công nghệ cao đáp ứng nhu cầu đặt Nghành, cần kỉ thuật, phương tiện để đáp ứng nhu cầu Đây lí mà mơn “Kỷ thuật phân tích sinh hóa đại “ xem môn sở nghành cung cấp cho người học cách nhìn tổng quan phương pháp, trang thiết bị phục vụ cho việc nghiên cứu môn học sau Trên sở kiến thức học mơn học: nhóm giao thực đề tài “Phân tích khối phổ” với mục đích tìm hiểu thêm đề nâng cao kiến thức học cho thân bạn Mặc dù cố gắng kiến thức cịn hạn hẹp thời gian thực khơng nhiều nên đề tài chúng tơi cịn nhiều hạn chế sai sót Đề tài nhóm chia làm phần sau: Phần I: Giới thiệu: Tìm hiểu tổng quan ngun lí làm việc máy khối phổ Phần II: Máy khối phổ: Trình bày sơ nét phận thức hoạt động máy:     Bộ nạp mẫu Bộ nguồn ion Bộ phân tích khối Detector ểu Ti Phần III: Ứng dụng: Trình bày cách khái quát ứng dụng kỷ thuật đồng thời đưa ví dụ cụ thể nhà khoa học trước thực ận lu Chúng mong góp ý Hồ Thị Tiến, thầy cô khoa bạn để luận hoàn thiện ngày tốt nh ki NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN tế ới m nh Page | Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường ất PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.1: Sơ đồ khối máy khối phổ Các phận trình bày chi tiết phần sau II.2 Nguyên lí làm việc máy khối phổ Ban đầu, mẫu nạp vào máy dạng khí Sau mẫu chuyển đến nguồn ion để ion hóa thành ion trạng thái tích điện khác nhau, ion mẫu phân tách dựa khác biệt tỉ số giá trị m/z, detector ghi liệu phổ khối ion phân tách với trợ giúp phần mềm tin sinh học cho phép tìm kiếm sở liệu phân tích kết thu Máy khối phổ không đo khối lượng (m) mà chúng đo giá trị m/z (mass/charge ratio) Tùy thuộc vào loại nguồn phân tích khối mà máy khối phổ có cấu hình nguyên tắc hoạt động khác II.3 Chi tiết phận máy khối phổ ểu Ti II.3.1 Bộ nạp mẫu: Có thể phân thành hai nhóm chính: II.3.1.1 Nạp mẫu trực tiếp Mẫu đưa trực tiếp vào máy khơng cần thơng qua thiết bị phân tích khác Chẳng hạn, với mẫu lỏng ta đặt mẫu vào chén thạch anh bề mặt kim loại đưa vào buồng trung gian (áp suất giảm) trước đưa vào buồng chân không máy Ở phần mẫu tách nhờ màng bán thấm đưa thẳng vào buồng ion hóa Đơi người ta nhiệt phân mẫu, khí tạo đưa vào buồng ion hóa máy khối phổ dùng kết nối GC/MS (Gas Chromatography/ Mass Spectrometry) II.3.1.2 Nạp mẫu gián tiếp Ở nạp mẫu có đầu kết nối với thiết bị phân tích khác nối với máy quét phổ, chẳng hạn kiểu sau:  GC/ MS (Gas Chromatography/ Mass Spectrometry): Đầu cột mao quản hệ thống sắc kí khí (GC) nối trực tiếp với nguồn ion máy khối phổ  LC/MS (Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry): Khi chất phân tích khó bay dễ phân hủy nhiệt khơng thể phân tích GC, cần kết nối với hệ thống sắc kí lỏng (LC) Khó khăn phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha để ion hóa.(Sẽ trình bày cụ thể phần 2.3.2)  SFC/ MS ( Supercritical Fluid Chromatography/ Mass Spectrometry): Pha động CO2 siêu tới hạn chuyển thành pha khí trước vào buồng ion hóa  CE/ MS (Capillary Electrophoresie/ Mass Spectrometry): Các chất dung dịch rữa giải từ mao quản đưa vào buồng ion hóa Trong số trường hợp cần thêm dung môi để tăng tốc độ dòng Hạn chế kết nối thể tích mẫu nhỏ cần phải dùng dung dịch đệm dễ bay II.3.2 Bộ nguồn ion Đây phận ion hóa mẫu phân tử, nguyên tử sang trạng thái khí, thực tế có nhiều phương pháp ion hóa mẫu Dưới nhiều phương pháp cụ thể sau: ận lu nh ki tế ới m nh Page | Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Mơi Trường ất PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ II.3.2.1 Va chạm electron (EI) Trong buồn ion hóa electron (e) phát từ catot vonfram reni đốt nóng Chùm tia e bay phía anot với vận tốc lớn (có lượng khoảng 70 eV) va chạm với phân tử nguyên tử mẫu Một e công phân tử với lượng lớn loại e khác khỏi phân tử Q trình ion hóa mẫu phương pháp EI thường tao ion dịng điện đơn có e khơng cặp đơi Đó ion gốc, phân tử ban đầu mang điện tích gọi ion phân tử Q trình ion hóa phương pháp EI tạo catot anot: M + 1eM+ + 2eM + 1eMKí hiệu + cation gốc tạo thành Ưu điểm:  Làm việc với cation gốc cho nhiều thông tin Nhược điểm:  Tạo nhiều mảnh nhỏ  Ít chí khơng có ion phân tử nên khó biện giải phổ  Khơng thích hợp với chất phân cực dễ bị nhiệt phân hủy (phải hóa mẫu trước) II.3.2.2 Ion hóa hóa học (CI) Ion hóa hóa học kỉ thuật ion hóa “mềm” kỉ thuật va chạm electron Ở người ta dùng khí metan (CH 4), amoniac (NH3), va cham với chùm tia electron lượng cao để tạo ion gốc tự Ví dụ với khí metan: Đầu tiên va chạm electron ion hóa thuốc thử: Tiếp theo tạo ion thứ cấp: Cation CH5+ tiểu phân cho proton mạnh phản ứng với chất phân tích M mẫu: ểu Ti Ưu điểm:  Ít phân mảnh chất phân tích M Nhược điểm:  Tạo ion MH+ có khối lượng lớn đơn vị so với khối lượng phân tử tương đối chất phân tích II.3.2.3 Nguồn ion phun sương khử solvat Kỷ thuật tạo ion từ phân tử dung dịch, dung dịch mao quản kim loại (tốc dộ dao động từ 1- 10 ml/ phút) Người ta đặt điện trường đầu mao quản điện cực (≤ +4000 V) tạo giọt mịn hạt sương mang điện tích gia tốc đến điện cực ( ion hóa tia điện- ESI) Ưu điểm:  Ion hóa chất phân cực chất có khối lượng phân tử lớn (M ≤ 100000) ận lu nh ki tế ới m nh Page | Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Mơi Trường ất PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Nhược điểm:  Chỉ thực với mẫu lỏng Hình 2.2 : Giao diện ESI máy khối phổ sơ đồ tạo ion dương bằng ng̀n ESI Ngồi dùng tia ESI ta dùng số tia sau:  Ion hóa nhiệt (TSI): Tương tự kỉ thuật ESI nhiên mẫu phải qua mạo quản nhiệt độ kiểm sốt để tạo thành giọt mịn  Ion hóa học áp suất khí (APCI): Pha động chuyển thành cát giọt sương nhờ dòng Nito nhiệt (khoảng 500 oC), thường kết nối với HPLC/MS Hình 2.3 minh họa giao diện APCI cột HPLC vả máy khối phổ ểu Ti ận lu nh ki tế ới m Hình 2.3: Giao diện APCI cột HPLC vả máy khối phổ II.3.2.4 Nguồn ion hóa giải hấp nh Page | Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Mơi Trường ất PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Nguyên tắc kỷ thuật dựa trình phát thứ cấp: bắn phá mẫu dạng lỏng hay rắn chùm tia sơ cấp: electron, photon ion Gồm ba kỉ thuật thường gặp:  Bắn phá nhanh nguyên tử (FAB): Dùng agon hay xenon để bắn phá  Bắng phá nhanh ion (FIB): Dùng ion Cs+ để bắn phá  Ion dãy hấp laser (MALDI): Mẫu hòa tan dung mơi thích hợp ion hóa xung laser có bước sóng vùng UV-IR, thường dùng cho mẫu phân tử có khối lượng lớn (M > 100000) Hình 2.4: Sơ đồ mơ tả hoạt động hệ thống MALDI Hình cung cấp cho ta thơng tin lựa chọn kiểu nguồn ion hóa thích hợp với mẫu phân tích: ểu Ti ận lu Hình 2.5: Biểu đồ lựa chọn kiểu tạo ion ki II.3.3.Bộ phân tích khối nh Được coi tim máy khối phổ có nhiệm vụ tách ion có trị số m/z khác thành phần riêng biệt II.3.3.1 Bộ phận tích từ  Bộ hội tụ đơn: Mơ tả hình 2.6 tế ới m nh Page | Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Mơi Trường ất PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.6: Bộ phân tích từ hội tụ đơn Tỉ số khối lượng điện tích ion (m/z) xác định theo cơng thức: ểu Ti Trong đó: m: Khối lượng ion z: Điện tích ion B: Cường độ từ trường r: Bán kính chuyển động điện tích V: Gia tốc cường độ điện trường  Bộ hội tụ kép Gồm hai phần để tăng độ phân giải khối:  Bộ tách tĩnh điện  Bộ phân tích từ Nhờ cách quét ta nhận phổ khối có độ phân giải cao dao động khoảng từ 100000- 150000 Nhiều trường hợp cho tỉ số m/z xác đến dùng để xác định thành phần nguyên tố chất phân tích II.3.3.2 Bộ phân tích tứ cực  Bộ tứ cực đơn Bao gồm cực kim loại đặt song song sát nhau, có khoảng khơng cực ion bay qua (Hình 2.7) Có điện chiều tín hiệu xoay chiều cao tần áp vào cặp đối diện bốn cực ận lu nh ki tế ới m nh Page | Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Mơi Trường ất PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.7: Bộ phân tích tứ cực đơn  Bẫy ion tứ cực Hoạt động theo nguyên lí phân tích khối tứ cực đơn, khác điểm ion lưu giữ đưa dần khỏi bẫy.(Hình 2.8) ểu Ti lu Hình 2.8: Sơ đồ bẫy ion ận  Bộ tứ cực chập ba Gồm ba phận tứ cực nối tiếp Bộ Q Q3 làm nhiệm vụ phân tích, Q1 tách ion (một số ion chọn lọc), Q (áp suất cao) tạo phân ly va chạm làm ion bị phân mảnh chuyển đến Q để tách riêng sau đến detector.(Hình 2.9) nh ki tế ới m nh Page | Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Mơi Trường ất PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.9: Bộ phân tích tứ cực chập ba II.3.3.3 Bộ phân tích thời gian bay (TOF) Các ion khỏi buồng ion hóa gia tốc nhờ điện 10- 20 Kv bay qua ống phân tích ( khơng có điện từ trường) có chiều dài đến 2m Thời gian bay hết ống tỉ lệ với √ m ion z Chủ yếu dùng để phân tích chất có khối lượng phân tử lớn (khoảng vài ngàn đơn vị) Hình 2.10: Sơ độ phân tích thời gian bay TOF II.3.3.4 Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (ICR) Bộ phận dùng cho máy khối phổ kết hợp với chuyển đổi Fourier (FT- ICR) Các ion tạo buồng ion hóa qua hệ thống bơm đảm bảo độ chân không cao ( từ 10-10- 1011 mBar) vào bẫy ion (bẫy Penning) đặt từ trường B Các ion nằm bẫy bị kích thích điện trường xoay chiều tần số radio (RF) chúng chạm vào thành bẫy (cộng hưởng) Một dòng xoay chiều tạo ion chuyển động gần tới detector ghi lại theo thời gian chuyển thành tính hiệu ghi theo vận tốc góc ω c Sau chuyển phổ tốc độ thành phổ khối Phương trình mô tả quan hệ ω c m : ểu Ti ận lu nh ki tế ới m nh Page | 10 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Mơi Trường ất PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.11: Sơ đồ bẫy Penning trình tạo tín hiệu Kỷ thuật ICR- MS có độ nhạy cao độ phân giải đến 107 II.3.4 Detector II.3.4.1 Nhân electron Tác động ion lên bề mặt chất bán dẫn tạo electron, tiếp tục tăng tốc va chạm với bán dẫn khác tạo nhiều electron Các electron thu nhận số lượng chúng tỉ lệ với cường độ tín hiệu detector II.3.4.2 Nhân quang Các electron tạo cách va chạm tương tư phần nhân electron thay va chạm vào bề mặt bán dẫn va cham vào bề mặt phát quang để tạo hat photon Các hạt photon thu nhận số lượng chúng tỉ lệ với cường độ tín hiệu detector III ỨNG DỤNG 3.1 Xác định đồng vị 3.1.1 Cơ sở lí thuyết Các nguyên tử đồng vị nguyên tố có số điện tích hạt nhân khác số notron, nên khối lượng nguyên tử khác Có thể dùng kỉ thuật khối phổ để xác định đồng vị nguyên tố mẫu Bảng 3.1 cho biết khối lượng thành phần đồng vị bền số nguyên tố Bảng 3.1: Đồng vị bền số nguyên tố Khối lượng Thành phần xác thiên nhiên đồng vị (%) H 1,0078 99,985 D 2,0141 0,015 12 12,0000 98,893 C 13 13,0034 1,107 14 14,00031 99,634 N 15 15,0001 0,366 16 15,9949 99,529 O 17 16,9991 0,037 18 17,9992 0,204 35 34,9698 75,529 17 Cl 37 36,9659 24,471 79 78,9183 50,537 35 Br 81 80,9163 49,463 Trong thiên nhiên nguyên tố thường gồm hỗn hợp nhiều đồng vị, nên với ion phân tử tín hiệu ion M + cịn thu nhận tín hiệu ion phân tử khác có khối lượng (M- 1)+, (M +1)+, (M+2)+ tạo thành từ đồng vị Vì Số hiệu nguyên tử (Z) Kí hiệu nguyên tố Khối lượng đồng vị ểu Ti ận lu nh ki tế ới m nh Page | 11 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường ất