(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn từ chủng cường độc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMN NÔNG NGHIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMP VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM ĐỖ THỊ LIÊN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘCU TẠO CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘCO CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘCNG VIRUS NHƯỢC ĐỘCC ĐỘCC GÂY HỘCI CHỨU TẠO CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘCNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢNI LOẠO CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘCN HÔ HẤP VÀ SINH SẢNP VÀ SINH SẢNN Ở LỢN TỪ CHỦNG CƯỜNG ĐỘC LỢC ĐỘCN TỪ CHỦNG CƯỜNG ĐỘC CHỦNG VIRUS NHƯỢC ĐỘCNG CƯỜNG ĐỘCNG ĐỘCC Chuyên ngành: Thú y Mã số:: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học:i hướng dẫn khoa học:ng dẫn khoa học:n khoa học:c: PGS.TS Bùi Trần Anh Đàon Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Liên i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập hồn thành luận văn nhận nhiều quan tâm giúp đỡ quý báu quý thầy cô, anh chị bạn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa thú y, thầy cô giáo Học Viện Nông Nghiệp Việt nam chia sẻ tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trường Nhân dịp hoàn thành luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc tới Thầy, Cô giáo Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Trần Anh Đào môn Bệnh Lý, Khoa Thú y – Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Đồng thời bày tỏ biết ơn đến Thầy, Cô môn Bệnh Lý, khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, anh chị phịng thí nghiệm trung tâm tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp tốt Xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Liên ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích nghiên cứu .2 Phần Tổng quan tài liệu .3 2.1 Lịch sử tình hình dịch bệnh PRRS lợn .3 2.1.1 Tình hình dịch PRRS giới .3 2.1.2 Tình hình dịch PRRS Việt Nam 2.2 Hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản (PRRS) 2.2.1 Căn bệnh 2.2.2 Đặc điểm dịch tễ học 13 2.2.3 Triệu chứng 16 2.2.4 Bệnh tích 18 2.2.5 Chẩn đoán .19 2.2.6 Biện pháp phòng điều trị .21 2.3 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào nghiên cứu virus học 23 2.3.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 23 2.3.2 Điều kiện nuôi cấy .24 2.3.3 Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào 25 2.3.4 Khả tiếp truyền virus PRRS dòng tế bào MARC-145 25 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 27 3.1 Địa điểm nghiên cứu 27 3.2 Thời gian nghiên cứu 27 3.3 Vật liệu nghiên cứu 27 iii 3.3.1 Nguyên liệu 27 3.3.2 Động vật thí nghiệm 27 3.3.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 27 3.4 Nội dung nghiên cứu 27 3.5 Phương pháp nghiên cứu 28 3.5.1 Phương pháp tiếp truyền virus tế bào MARC-145 .28 3.5.2 Giám định virus PRRS phương pháp RT-PCR 31 3.5.3 Bố trí thí nghiệm 35 3.5.4 Xác định hàm lượng kháng thể có máu 37 3.5.5 Phương pháp khám lâm sàng .38 3.5.6 Phương pháp đo tiêu huyết học 38 3.5.7 Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể .38 3.5.8 Phương pháp làm tiêu bệnh lý 39 3.5.9 Phương pháp xử lý số liệu 40 Phần Kết thảo luận 41 4.1 Kết đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-08 qua đời cấy chuyển .41 4.1.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào CPE chủng virus cường độc KTY-PRRS-08 qua đời cấy chuyển .41 4.1.2 Kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển .43 4.1.3 Kết xác định đường cong nhân lên môi trường tế bào 44 4.2 Kết đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-08 qua đời cấy chuyển .47 4.2.1 Kết so sánh tương đồng nucleotide gen ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu đời cấy chuyển khác .47 4.2.2 Kết giải trình tự amino acid 52 4.3 Kết tính kháng nguyên chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường marc-145 đời 90 56 4.4 Kết nghiên cứu độc lực chủng virus KTY-PRRS-08 cấy chuyển môi trường marc-145 đời 90 58 4.4.1 Kết theo dõi thân nhiệt lợn trước sau gây nhiễm virus 58 4.4.2 Kết theo dõi tần số hô hấp lợn trước sau gây nhiễm virus 60 iv 4.4.3 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus 62 4.4.4 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus 62 4.4.5 Kết biến đổi bệnh lý đại thể lợn thí nghiệm 64 4.4.6 Kết biến đổi bệnh lý vi thể lợn thí nghiệm .65 Phần Kết luận kiến nghị .66 5.1 Kết luận 66 5.2 Kiến nghị 67 Tài liệu tham khảo 68 Phụ lục 73 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng việt Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DPI Day Post Inoculated DWP Deep-well-plate ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay H.E Hematoxylin & Eosin IPMA Immuno – Peroxidase Monolayer Assay LDHV Lactic dehydrogennase virus NXB Nhà xuất OIE Tổ chức thú y giới PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome RNA Virus RT – PCR Ribonucleic Acid TPB Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction TCID50 Tryptose Phosphate Broth TMB Tissue Culture Infective fifty percent Dose 3,3’,5,5’-Tetrammethylbenzidine vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Protein cấu trúc PRRSV Bảng 2.2 Sức đề kháng PRRSV 12 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT-PCR 31 Bảng 3.2 Các bước thực phản ứng RT-PCR 32 Bảng 3.3 Bảng bố trí thí ngiệm 36 Bảng 4.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào (CPE) mơi trường tế bào MARC-145 42 Bảng 4.2 Kết giám định bệnh tích tế bào RT-PCR 42 Bảng 4.3 Kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển 43 Bảng 4.4 Vị trí sai khác nucleotide chủng KTY-PRRS-08 sau đời cấy chuyển khác tế bào MARC-145 50 Bảng 4.5 So sánh tương đồng nucleotide đoạn gene ORF5 chủng KTY-PRRS08 đời cấy chuyển .51 Bảng 4.6 Vị trí sai khác amino acid chủng KTY-PRRS-08 đời cấy chuyển tế bào MARC-145 .54 Bảng 4.7 So sánh tương đồng amino acid đoạn gene ORF5 chủng KTYPRRS-08 đời cấy chuyển 55 Bảng 4.8 Kết xét nghiệm kháng thể kháng PRRSV lợn trước gây nhiễm chủng virus KTY-PRRS-08 .56 Bảng 4.9 Kết xét nghiệm kháng thể sau gây nhiễm chủng virus KTYPRRS-08 cấy chuyển môi trường MARC-145 đời 90 57 Bảng 4.10 Kết theo dõi thân nhiệt lợn trước sau gây nhiễm virus .59 Bảng 4.11 Kết theo dõi tần số hô hấp lợn trước sau gây nhiễm virus 61 Bảng 4.12 Kết theo dõi triệu chứng lợn sau gây nhiễm virus .62 Bảng 4.13 Kết theo dõi số tiêu huyết học lợn sau gây nhiễm virus 63 Bảng 4.14 Bệnh tích đại thể số khí quan lợn thí nghiệm 64 Bảng 4.15 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn thí nghiệm 65 Bảng 4.16 Bệnh tích vi thể số khí quan lợn lơ đối chứng 65 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ tình hình dịch bệnh PRRS độc lực cao châu Á từ năm 2006 đến năm 2010 Hình 2.2 Hình thái virus PRRS Hình 2.3 Cấu trúc gen PRRSV Hình 2.4 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào .14 Hình 4.1 Đường biểu diễn nhân lên phát triển chủng virus KTYPRRS-08-P#10 44 Hình 4.2 Đường biểu diễn nhân lên phát triển chủng virus KTYPRRS-08-P#30 45 Hình 4.3 Đường biểu diễn nhân lên phát triển chủng virus KTYPRRS-08-P#90 45 Hình 4.4 So sánh trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus KTYPRRS-08 qua đời cấy chuyển 49 Hình 4.5 So sánh trình tự amino acid gene ORF5 chủng virus KTYPRRS-08 qua đời cấy chuyển 53 Hình 4.6 Biểu đồ diễn biến hàm lượng kháng thể kháng chủng virus KTYPRRS-08-P#90 máu lợn thí nghiệm viii 58 TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thị Liên Tên Luận văn: Nghiên cứu tạo chủng virus nhược độc gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn từ chủng cường Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tạo chủng virus nhược độc gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn từ chủng cường độc phân lập Việt Nam phục vụ cơng tác chế tạo vacxin phịng Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tiếp truyền virus tế bào MARC-145, phương pháp chiết tách ARN, phương pháp RT-PCR phương pháp giải trình tự gen, phương pháp đọc kết giải trình tự gen, phương pháp ELISA, phương pháp khám lâm sàng, phương pháp đo tiêu huyết học, phương pháp xử lý số liệu Kết kết luận Đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển Chủng KTY-PRRS-08 bắt đầu gây bệnh tích tế bào vào thời điểm 12 bệnh tích đạt 100% vào thời điểm 60 sau gây nhiễm đời tiếp truyền đời tiếp truyền thứ 30 Từ đời tiếp truyền 40 đến 90, thời điểm bắt đầu xuất bệnh tích tế bào sớm thời điểm bệnh tích đạt 100% rút ngắn xuống cịn 48 Chủng virus KTY-PRRS-08 có hiệu giá tương đối cao, ổn định qua đời cấy chuyển, hiệu giá virus cao xác định đời 50 với giá trị 8,12 ± 0,87 x 10 Quy luật nhân lên chủng virus KTY-PRRS-08 có thay đổi đời từ đời 30 Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-08 sau 90 đời cấy chuyển Đã xác định trình tự nucleotide đoạn ORF5 chủng KTY-PRRS-08 đời cấy chuyển Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 chủng virus KTYPRRS-08 có kích thước 603bp mã hố cho 200 amino acid protein kháng nguyên GP5 Trình tự nucleotide axit amin đoạn gen ORF5 chủng nghiên cứu qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 tương đối ổn định, ix