(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu đặc tính sinh học và phân tử của chủng virus nhược độc kty prrs 04 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMN NÔNG NGHIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMP VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM HÀ VĂN THỊNH NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINHU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINHC TÍNH SINH HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAMC VÀ SINH HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS NHƯỢC CỦA CHỦNG VIRUS NHƯỢCA CHỦA CHỦNG VIRUS NHƯỢCNG VIRUS NHƯỢCC ĐỘC KTY - PRRS - 04 GÂY HỘI CHỨNG RỐIC KTY - PRRS - 04 GÂY HỘC KTY - PRRS - 04 GÂY HỘI CHỨNG RỐII CHỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINHNG RỐII LOẠN HƠ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢNN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢNP VÀ SINH SẢN Ở LỢNN Ở LỢN LỢCN Chuyên ngành: Thú y Mã số:: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học:i hướng dẫn khoa học:ng dẫn khoa học:n khoa học:c: PGS.TS Nguyễn Thị Lann Thị Lan Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các kết quả, số liệu nêu luận văn hoàn toàn trung thực chưa bảo vệ học vị khác Tơi cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Hà Văn Thịnh i LỜI CẢM ƠN Quá trình học tập rèn luyện mái trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp tơi hịa thiện nhân cách trình độ chun mơn Tơi nhận quan tâm, dạy dỗ tận tình Thầy, Cô giáo đặc biệt Thầy, Cô giáo công tác Khoa Thú y Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cao học chuyên ngành Thạc sỹ thú y cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc đến Thầy, Cô giáo – người tận tình dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình tơi học tập Trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam suốt q trình tơi thực khóa luận Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô PGS TS Nguyễn Thị Lan, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Hà Nội, cô tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian thực khóa luận Đồng thời tơi xin bày tỏ biết ơn đến Thầy, Cô môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, anh chị phịng Thí nghiệm trọng điểm CNSH – khoa Thú Y (B213 – B214) nơi thực đề tài, tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài tốt Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người ln động viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Hà Văn Thịnh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn .ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract .x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài: 1.2 Mục tiêu đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn 2.1.1 Tình hình dịch PRRS giới 2.1.2 Tình hình dịch PRRS Việt Nam 2.1.3 Những nghiên cứu dịch PRRS nước 2.1.4 Những nghiên cứu dịch PRRS Việt Nam 2.2 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRSV) 2.2.1 Hình thái, cấu tạo 2.2.2 Phân loại virus PRRS 11 2.2.3 Khả gây bệnh virus PRRS 11 2.2.4 Sức đề kháng virus PRRS 11 2.2.5 Đặc tính ni cấy virus PRRS 12 2.3 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản 13 2.3.1 Đặc điểm chung 13 2.3.2 Động vật cảm nhiễm 13 2.3.3 Chất chứa mầm bệnh 13 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh phương thức truyền lây 14 2.3.5 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc PRRS 16 2.3.6 Bệnh tích lợn mắc PRRS 17 iii 2.3.7 Các phương pháp chẩn đoán PRRS .18 2.3.8 Biện pháp phòng trị bệnh 20 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 22 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .22 3.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu 22 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23 3.1.4 Thời gian nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.2.1 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc -145 .23 3.2.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc -145 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 môi trường tế bào Marc - 145 23 3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID 50 .25 3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng virus PRRS qua đời cấy chuyển 25 3.3.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số hệ gen virus PRRS 25 3.3.5 Phương pháp giải trình tự Gen .28 3.3.6 Phương pháp đọc kết 30 Phần Kết thảo luận .31 4.1 Kết nghiên cứu chủng virus PRRS nghiên cứu 31 4.1.1 Kết lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu .31 4.1.2 Kiểm tra khả tạp nhiễm với loại virus khác .34 4.2 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng virus kty PRRS - 04 34 4.2.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào qua đời cấy chuyển 34 4.2.2 Kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển .38 4.3 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 04 41 4.3.1 Kết tách chiết RNA tổng số chủng virus KTY – PRRS - 04 41 iv 4.3.2 Kết giải trình tự đoạn ORF5 chủng virus KTY - PRRS - 04 .42 4.3.3 Kết nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua đời cấy chuyển .45 4.3.4 Kết nghiên cứu so sánh trình tự axit amin virus KTY - PRRS - 04 qua đời cấy chuyển 48 4.3.5 Kết xây dựng sinh học phân tử 51 Phần Kết luận kiến nghị 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị .53 Tài liệu tham khảo .55 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Aa : acid amin BED : Blue Ear disease CNSH : Công nghệ sinh học CPE : Cyto Pathogenic Effect Cs : Cộng DMEM : Dulbecco s Modified Eagle Medium ELISA : Enzyme Immunosortbent Linking Assay EVA : Equine virus FCS : Fetal Calf Serum IFA : Indirect Immunofluoresence Assay kDa : Kilodalton LDHV : Lactate Dehydlogenase – elevating virus MK : Monkey kidney cell MSD : Mistery Swine Disease OIE : Tổ chức thú y giới ORF : Open reading frame (khung đọc mở) PAM : Pulmnary alveolar macrophage PEARS : Porcine Endemic abortion and Respiratory syndrome PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RNA : Ribonucleic acid SHFV L1 , : Simian hemorrhaghic fever virus : Lần vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Protein cấu trúc PRRSV 10 Bảng 2.2 Sức đề kháng virus với điều kiện ngoại cảnh 12 Bảng 3.1 Thành phần thể tích cho phản ứng RT-PCR 27 Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR 27 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT-PCR .27 Bảng 4.1 Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập .31 Bảng 4.2 Kết chẩn đoán RT-PCR lợn nghi mắc PRRS .33 Bảng 4.3 Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu 34 Bảng 4.4 Kết xác định có mặt virus PRRS, CSF, FMD, PED TGE 34 Bảng 4.5 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào chủng virus KTY - PRRS - 04 qua đời 35 Bảng 4.6 Hiệu giá chủng virus KTY – PRRS – 04 thời điểm thu hoạch 38 Bảng 4.7 Hiệu giá chủng virus KTY - PRRS – 04 qua đời cấy chuyển 40 Bảng 4.8 Sai khác vị trí nucleotide đời chủng PRRS nghiên cứu 47 Bảng 4.9 So sánh tương đồng nucleotide virus KTY - PRRS – 04 đời cấy chuyển 47 Bảng 4.10 Sai khác vị trí axit amin đời chủng KTY - PRRS - 04 50 Bảng 4.11 So sánh tương đồng axit amin virus PRRS – 04 đời cấy chuyển vii 50 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất PRRS giới Hình 2.2 Cấu trúc hạt PRRS virus Hình 2.3 Cấu trúc gen PRRS virus .9 Hình 2.4: Bộ gen virus PRRS 10 Hình 2.5 Virus PRRS xâm nhập phá hủy tế bào đại thực bào .14 Hình 4.1 Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus 36 Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 gây nhiễm 36 Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 gây nhiễm 37 Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 60 gây nhiễm 37 Hình 4.5 Bệnh tích tế bào sau 72 gây gây nhiễm 37 Hình 4.6 Đường cong sinh trưởng virus KTY – PRRS - 04 39 Hình 4.7 Log10 hiệu giá chủng virus KTY - PRRS – 04 qua đời cấy chuyển 40 Hình 4.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 42 Hình 4.9 Kết phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 43 Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 chủng KTY-PRRS-04 đời cấy chuyển thứ 10 44 Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide chủng KYT-PRRS-04 đời cấy chuyển 46 Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin chủng KTY-PRRS-04 đời cấy chuyển 49 Hình 4.13 Cây sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 52 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hà Văn Thịnh Tên luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đề tài nhằm mục đích đánh giá ổn định số đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus cường độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn, qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 Phương pháp nghiên cứu Bằng phương pháp nghiên cứu: nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 môi trường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinh trưởng virus PRRS qua đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số hệ gen virus PRRS; RT-PCR; phương pháp giải trình tự Gen Kết kết luận Đặc tính sinh học chủng virus KTY - PRRS - 04: Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus nghiên cứu có tính ổn định cao qua đời cấy chuyển môi trường Marc-145 Chủng virus PRRS có hiệu giá cao ổn định, có khả phát triển nhân lên tốt môi trường tế bào Marc-145 Hiệu giá virus thu cao thời điểm 72 sau gây nhiễm Đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY - PRRS - 04: Xác định trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus sau đời cấy chuyển liên tục Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 chủng virus KTY - PRRS - 04 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin protein kháng nguyên GP5 Trình tự nucleotide axit amin đoạn gen ORF5 chủng nghiên cứu qua đời cấy chuyển môi trường tế bào Marc-145 tương đối ổn định, mức độ tương đồng nucleotide từ 98,15% đến 100%; axit amin từ 96,88% đến 100% ix