(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nhân nhanh in vitro cây hoa hồng pháp (rose gallica l )

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.

Thời gian nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

- Giống hoa hồng Pháp (Rosa gallica L.) thu thập tại Sapa tỉnh Lào Cai.

- Chế phẩm nano được cung cấp bởi bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khử trùng mẫu

Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc- đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử hỗn hợp nano bạc- đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp

Nội dung 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp. Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp

Nội dung 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA và nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp

Nội dung 4: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng

BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp

Nội dung 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro hoa hồng Pháp Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp

2 in vitro hoa hồng Pháp.

Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần, số mẫu thí nghiệm cho mỗi công thức là 20

Sử dụng môi trường MS có bổ sung 6,5g agar/l, 30g sucrose/l, pH=5,8, các chất điều tiết sinh trưởng và nano bạc Môi trường trước khi sử dụng để nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121 o C, 1atm trong 20 phút 3.5.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu

Tỉ lệ mẫu sạch (%) = (Tổng số mẫu sạch/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100.

Tỉ lệ mẫu sống sạch (%) = (Tổng số mẫu sống sạch/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100

Tỉ lệ số mô bật chồi (%) = (Tổng số mô bật chồi/Tổng số mẫu thí nghiệm)

Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100

Tỉ lệ mẫu tạo callus (%) = (Tổng số mẫu tạo callus/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100

Hệ số nhân chồi = Số chồi nhân lên/Tổng số mẫu ban đầu

Tỉ lệ chồi ra rễ (%) = (Tổng chồi ra rễ/Tổng số mẫu in vitro)*100 Chiều dài trung bình của chồi (cm) = Tổng chiều dài của chồi/Số chồi.

Số lá/chồi = tổng số lá của chồi/Số chồi

Chiều dài trung bình của rễ (cm) = Tổng chiều dài của rễ/Số rễ

3.5.3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu

Trước khi tiến hành thực hiện thí nghiệm nghiên cứu khả năng khử trùng mẫu của nồng độ và thời gian xử lý hỗn hợp nano Chúng tôi thực hiện các bước sau:

B1 Rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy cho sạch bụi đất

B2 Đưa mẫu vào phòng nuôi và rửa lại bằng nước cất vô trùng thêm 2-3 lần nữa

B3 Cho mẫu vào box cấy, đổ ngập cồn 70 o trong 1 phút

B5 Rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần cho sạch cồn

Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp

Khử trùng mẫu với các công thức khác nhau:

- CT1: javen thương mại 5% lắc mẫu trong vòng 5 phút (đối chứng)

- CT2: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 100 ppm

(CT2, CT3,CT4, CT5 thực hiện trong 1 giờ, cú 15 phút lắc một lần)

Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần nuôi cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần tiên tiếp, mỗi công thức thí nghiệm 20 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống

Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp

Sử dụng nồng độ hỗn hợp nano tốt nhất ở thí nghiệm 1.1 và xử lý ở 5 thời gian khác nhau là (30, 45, 60, 75, 90 phút) tương ứng với 5 công thức. Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần nuôi cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần liên tiếp, mỗi công thức thí nghiệm 20 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống

3.5.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp Đoạn thân mang mắt ngủ sau khi được khử trùng ở nồng độ và thời gian hỗn hợp nano bạc -đồng thích hợp nhất ở thí nghiệm (3.5.3.1.) được dùng để tái sinh chồi

Chất điều tiết sinh trưởng BA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với 5 công thức tương ứng như sau:

CT1: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA.

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu

Mẫu được đánh giá sau 2, 3,4 tuần trên môi trường nuôi cấy

Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi

Sau khi xử lý số liệu thu được sẽ tìm được công thức với nồng độ

BA thích hợp nhất (M1) cho sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ

Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp

Sau khi tìm được môi trường có nồng độ BA thích hợp nhất cho bật chồi hoa hồng Pháp là M1, chúng tôi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc được bổ sung vào môi trường M1 đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ với các nồng độ nano bạc tương ứng như sau:

Mẫu được đánh giá sau 2, 3, 4 tuần trên môi trường nuôi cấy

Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi

3.5.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA và nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp Để nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng hình thành mô sẹo của mẫu lá cây hoa hồng in vitro, lá mầm in vitro có kích thước khoảng 0,5 cm-1,5 cm được cắt bỏ răng cưa và tạo vết thương được đưa vào môi trường tạo callus được bố trí với 5 nồng độ IBA khác nhau tương ứng 5 CT như sau:

CT1: MS + 30g/l sucrose + 0,0 mg/l IBA

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu tạo callus

Sau khi có kết quả, chúng tôi tìm ra công thức phù hợp nhất (M2) cho quá trình tạo mô sẹo từ lá in vitro

Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp

Sau khi tìm được môi trường bổ sung BA phù hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp là M2, chúng tôi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào môi trường M2 đến quá trình tạo mô sẹo với các nồng độ nano như sau:

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ tạo callus

3.5.3.4 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng

BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp

Chồi được bật ra từ mắt ngủ có chiều dài khoảng 1,5 - 2,0 cm, số lá là 3–4 lá được cắt ra và nuôi trong môi trường tái sinh chồi in vitro có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:

CT1: MS + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA

Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá mẫu sau 2, 3, 4, 5, 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy để xác định các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi

Sau khi xử lý số liệu, chúng tôi tìm được ra công thức thích hợp nhất (M3) cho quá trình tái sinh chồi in vitro

Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp

Sau khi tìm được môi trường bổ sung BA thích hợp nhất cho quá trình nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp là M3, em tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào môi trường M3 đến quá trình nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp với các nồng độ nano như sau:

Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá mẫu sau 2, 3, 4, 5, 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy để xác định các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi

3.5.3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp

Chồi bật ra từ mắt ngủ được chuyển sang môi trường nhân nhanh, sau 6 tuần cắt các chồi chuyển sang nuôi trong môi trường ra rễ có bổ sung -NAA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:

CT1: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 0mg/l -NAA

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu theo dõi sự phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/chồi.Sau khi xử lý kết quả thu được sẽ tìm được môi trường có nồng độ -NAA thích hợp nhất (M4) cho sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp.

Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp

Tiêu đề	Nghiên Cứu Sử Dụng Chế Phẩm Nano Trong Nhân Nhanh In Vitro Cây Hoa Hồng Pháp (Rosa Gallica L.)
Tác giả	Dương Thị Mến
Người hướng dẫn	TS. Đồng Huy Giới
Trường học	Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	88
Dung lượng	2,11 MB