Chương IV : Phân tích tiêu vi sinh vật 4.1 Chuẩn bị mẫu phân tích vi sinh 4.1.1 Phương pháp lấy mẫu 4.1.2 Vận chuyển bảo quản mẫu 4.1.3 Xử lý mẫu phân tích 4.2 Các phương pháp kiểm định vi sinh vật thực phẩm 4.2.1 Các phương pháp truyền thống 4.2.2 Các phương pháp xác định nhanh tự động hóa 1 Pha lỗng mẫu • Các dung dịch pha lỗng • Tại không dùng nước cất? Một số dung dịch pha lỗng đặc biệt • Dung dịch Natri citrat (dùng cho phomat, phomat chế biến, sữa sấy màng) – Na3C6H5O7.2H2O 20 g/L • Dung dịch dikali hidro phosphat 20g/L – pH7,5: caseinat, phomat, phomat chế biến, váng sữa chua – pH8,5: casein axit, casein lactic Một số phương pháp định lượng vi sinh vật Đếm trực tiếp tế bào buồng đếm hồng cầu Phương pháp đếm số xác suất lớn (MPN) Nguyên tắc: • Vi sinh vật nuôi cấy môi trường lỏng có khả thể đặc tính lên men (đục, đổi màu, sinh khí, mùi…) • Pha lỗng mẫu liên bội số 10 kết âm tính • Mỗi độ pha lỗng cần nuôi cấy ống lặp lại điều kiện thích hợp • Kiểm tra vi sinh vật có phát triển hay khơng, tính số ống có kq (+) • Xử lý số liệu theo bảng Mac Grady, từ tính số lượng VSV Phương pháp MPN Chuẩn bị pha loãng mẫu Cấy mẫu vào ống nghiệm chứa mơi trường (mỗi độ pha lỗng ống) Ni cấy nhiệt độ thích hợp Đọc kết quả, xác định số đặc trưng, tra bảng Mc Grady, tính kết Phương pháp MPN Chọn số đặc trưng 10 Tính số tế bào 11 Phương pháp đếm khuẩn lạc 12 Phương pháp đếm khuẩn lạc 13 • Đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu) gì? 14 15 Tính số lượng vi sinh vật • Quan sát đếm số lượng khuẩn lạc mọc đĩa (30-300) • Tính tổng số VSV theo cơng thức : • • • • • ΣC - tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa n1 - số đĩa đếm nồng độ pha loãng thứ n2 - số đĩa đếm nồng độ pha loãng thứ f1 - Hệ số pha loãng đĩa đếm thứ v - thể tích mẫu cấy vào hộp petri 16 Báo cáo kết • Theo TCVN 6264:1997: – Giữ lại đĩa có số khuẩn lạc từ 10-300 – Tính số khuẩn lạc theo cơng thức – Nếu tất 10 khuẩn lạc? – Nếu tất nhiều 300 khuẩn lạc? – Đơn vị N? 17 • Giả sử độ pha lỗng 10-3 đếmđược 168 215 khuẩn lạc; độ pha loãng 10-4 đếm 14 25 khuẩnlạc → tính số cfu ml mẫu ban đầu? • 1,92 x 10^5 cfu/ml • Giả sử độ pha lỗng 10-1 hút thiếu 0,1 ml → tính chênh lệch kết quả? • 1% 18 Định lượng tổng số vi sinh vật • Tổng số VSV = VSV tồn phát triển môi trường dinh dưỡng chung, 300C, 24 - 72 • Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, ưa ấm có SPTP để đánh giá mức độ nhiễm tạp, tinh trạng vệ sinh, điều kiện bảo quản dự đoán khả hư hỏng ẩn phẩm Phương pháp chuẩn : kỹ thuật đếm khuẩn lạc Nguyên tắc: - Nuôi cấy mơi trường thạch dinh dưỡng, 3010C, hiếu khí, 48–72 - Đếm tất số khuẩn lạc mọc ➔ số lượng tế bào sống có mẫu phân tích 19 19 VSV tổng số Quy trinh ph©n tÝch VSV tổng số Chuẩn bị pha lo·ng mẫu TGA (Trypton Glucoza Agar) •Ni cấy / mơi trng thch (30oC, 24-72 h) Quan sát đm khun lạc N (khuÈn l¹c/g, ml) = Trypton(pepton) g; Glucoza g; Cao nÊm men 2,5 g; Th¹ch 15 g; lit Số KL : 30-300 C (n + 0,1n ).f v 20 20 10 b.Thư nghiƯm ph©n giải ure Ngun tắc : ureaza NH3 + CO2 ➔ pH đổi mầu Urê Cách tiến hành : - Cấy vào mt có ure, 37oC 2-24 h, thị phenol đỏ -Quan sỏt : ã Mt không i mu (mu vng) khụng phân gii ure (-) (-) ãMt i mu (mầu tím) ➔ phân giải ure ➔ (+) Salmonella có phản øng (-) (+) 57 57 c.Thư nghiƯm ph©n giải LDC Nguyên tắc : Lysin LDC Cadaverin + CO2 ➔ pH mt Cách tiến hành : -Cấy vào mt có ure, 37oC 24 h- -Chỉ th Bromocresol tớm -Quan sỏt : ã Mt không i mầu (mầu vàng) ➔ (-) •Mt đổi mầu (mầu tím) ➔ (+) Salmonella có phản øng (+) 58 58 29 Lisin (+) Citrat (+) Mẫu nem chua 59 59 d.Phản ứng -Galactosidaza •+ Thử nghiệm -Galactosidaza (-): •Vi khuẩn lên men lactoza cần có enzym : -Galactosidaza permease mà hoạt tính xác định nhờ ONPG(0-nitrophenyl-Dgalactopyranoside) -Galactosidaza Lactose + ONPG 0-nitrophenol (mầu vàng) Salmonella có phản øng (-) 60 60 30 d.Phản ứng -Galactosidaza + Cách tiến hnh thử nghiệm -Galactosidaza : hoà vòng que cấy từ khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml dung dịch muối 0,85 % Thêm giọt toluen, lắc đặt ống nghiệm vào nồi cách thuỷ nhiệt độ 37oC vài phút Sau cho 0,25 ml dung dịch thử -Galactosidaza, lắc đặt lại ống nghiệm vào nồi cách thuỷ nhiệt độ 37oC 24 h Phản ứng dơng tính cho mầu vàng, thờng xuất sau 20 phút Salmonella có phản øng (-) 61 61 e Thư nghiƯm VP (Voges-Prouskauer) Salmonella (-) f Thử nghiệm sinh Indol Salmonella (-) 62 62 31 Salmonella spp • Mẫu nghiên cứu: – 10 mẫu nem chua Hà Nội • Phương pháp: ISO 6579:2002 (≡ TCVN 4829:2005) 63 63 ISO 6579 25 g mẫu Tăng sinh lần (không chọn lọc) 225ml nước peptone (24h) Tăng sinh lần (có chọn lọc) Kiểm tra khả di động Mueller Kauffmann (24h) MRSV (24-48h) Rambach (24h) XLT4 (24h) Các khuẩn lạc đặc trưng Thạch nghiêng Kligler (glucose, lactose, H2S, khí) Xét nghiệm hoá sinh (ure, lysine, simon citrate) Xác định serotype 64 64 32 Kết 25 g mẫu Tăng sinh lần (không chọn lọc) 225ml nước peptone (24h) Tăng sinh lần (có chọn lọc) Kiểm tra khả di động Mueller Kauffmann (24h) MRSV (24-48h) Rambach (24h) XLT4 (24h) Các khuẩn lạc đặc trưng Thạch nghiêng Kligler (glucose, lactose, H2S, khí) Xét nghiệm hố sinh (ure, lysine, simon citrate) Xác định serotype 65 65 Clostridium Cl.perfringens •Clostridium trực khuẩn, đứng riêng rẽ thành chuỗi, vi khuẩn Gram dương, yếm khí bắt buộc, bào tử hình trứng chịu nhiệt cao tới 75800C •Clostridium khử sulfit thành sulfua : SO32- + H+ + 6e → S2- + H2O •Clostridium perfringens bền với cycloserin 66 66 33 Môi trường xác định Clostridium Cl.perfringens Môi trường Winson Blair: Glucoza 20 g; pepton g; Cao nấm men 2,5 g; Cao thịt g; NaCl g; Thạch 20 g; H2O cho đủ 1000 ml, Na2SO3 20% NH4Fe(SO4)2 5% Môi trường thạch TSC (Trypton Sulfit Cycloserin): Trypton 15 g; cao nấm men g; Soyton g; Sắt ammonium xitrat g; Natri metabisulfat l g; thạch 20 g; H2O cho đủ 1000 ml Hoà tan chất hấp khử trùng nhiệt độ 1210C 15 phút, pH cuối = 7,6 nhiệt độ 25oC -Môi trường lỏng Thioglycollat +Resazurin natri: -Trypton 15 g; Cao nấm men g; L-cystin 0,5 g; Dextoza g; NaCl 2,5 g; Natri thioglycollat 0,5 g ; Dung dịch Resazurin natri pha (1:1000) ml; Thạch 0,75 g; H2O cho 1000 ml.67 67 VSV gây bệnh Nuôi cấy ống thạch Chuẩn bị mẫu (10-1 10-2) 25g mẫu + 225 ml dd trypton mi dd ®Ưm peptone ®un tan chảy mt Winson Blair + Na2SO3 NH4Fe(SO4) Cho mẫu, đun 75oC 10-15ã Chn KL nghi ng Nuôi cy (37/42oC, 24-72 h) Phép th khẳng định Tớnh lng Clostridium Clostridium perfringens 68 68 34 Xác định Clostridium perfringens da ci 69 69 Phép thử khẳng định •Xác định hình thái tính chất: •Chọn khuẩn lạc điển hình (mầu đen, trịn, lồi, bờ nhẵn) cấy vào ống nghiệm có chứa mơi trường lỏng Thioglycollat+ Resazurin natri Ni cấy 37oC, 24 h, hồn tồn yếm khí Sau 24 h thu canh trường •lấy mẫu quan sát hình dáng tế bào nhuộm Gram Clostridium : Trực khuẩn, G(+) 70 70 35 Phép thử khẳng định ãTh tớnh cht lờn men đường LactozaGelatin: •Từ canh trường nói trên, lấy vịng que cấy cho vào ống nghiệm có chứa mơi trường Lactoza-Gelatin • Ni cấy nhiệt độ 37oC 24 h •Quan sát khả lên men đường lactoza, sinh khí q trình lên men khả nng hoỏ lng gelatin A (+) : bị hoá lỏng B (-) : mt đông đặc 71 71 Phộp th khẳng định Clostridium perfringens dưa cải (+) Mẫu có C perfringens KC: Mẫu kiểm chứng Hình 3.9 Phép thử khẳng định Clostridium perfringens (+) KC 72 72 36 VSV gây bệnh Nuôi cấy đĩa thạch Chuẩn bị mẫu (10-1 vµ 10-2) (Xử lý mẫu 80oC, 15-20’) Cho 1ml mẫu vào đĩa th¹ch, đổ 10-15ml mt TSC (37/42oC, 24-48 h) dd ®Ưm peptone (Trypton Sulfit Cycloserin) Đổ lớp Ni bình kín (37/42oC, 24-48 h) Chọn KL nghi ng Phép th khẳng định đếm kl đen, tròn, lồi Tính lượng Clostridium Clostridium perfringens 73 73 Bacillus cereurs Nguyên tắc: Môi trờng chọn lọc Mannitol-Egg-Yolk-Polymyxin (MYP) có polymyxin chất đặc hiệu, cho khuẩn lạc mầu hồng điển hình Tiếp tục khẳng định dựa đặc tính sinh hoá 74 74 37 VSV gây bệnh Quy trinh phát Bacillus cereurs đếm khuẩn lạc Chun b pha lo·ng mẫu •Cấy mơi trường thạch chọn lọc (30oC, 24-48 h, MYP ➔ •Kl đỏ hồng, 2-3 mm, dẹt, bờ hình cưa Chän khuÈn lạc nghi ngờ Phép th khẳng định G (+) Glucoza phenol đỏ Nitrat nitrit VP (+) 75 75 VSV gây bƯnh Quy trinh ph¸t hiƯn Bacillus cereurs Chuẩn bị pha lo·ng mẫu MPN CÊy èng nghiÖm mt TSP (30oC, 48 h, èng ➔ Trypticase Soy Polymyxin §ôc, cã khÝ Cấy môi trường thạch chọn lọc (30oC, 24-48 h, MYP ➔ Chän KL nghi ngê PhÐp th khẳng định G (+) Glucoza phenol đỏ (+) Nitrat ➔nitrit (+) VP (+) 76 76 38 PhÐp thư kh¼ng định ãKh nng lờn men ng glucoza phenol : ãMụi trường có pH 7,4, mầu đỏ •Lên men ➔pH giảm ➔mầu vàng pH