(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Trọng Bằng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Trọng Bằng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Huỳnh Hoàng Như Khánh Hà Nội – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn TS Huỳnh Hoàng Như Khánh tham khảo thêm tài liệu cơng bố trước có nguồn gốc rõ ràng Kết nghiên cứu thực tài trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu phân lập sàng lọc chủng vi sinh vật biển có khả sinh tổng hợp bacteriocin nhằm ứng dụng nuôi trồng thủy hải sản”, mã số: VAST 02.05/20-21 Các số liệu nêu luận văn kết làm việc suốt trình thực nghiệm Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021 Tác giả luận văn Lê Trọng Bằng LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Hoàng Như Khánh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình hồn thành luận văn, tơi xin chân thành cảm ơn TS Châu Minh Khánh - Phịng Cơng nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang, người giúp tơi hồn thành tốt phần thực nghiệm mình, tơi xin chân thành cám ơn TS Huỳnh Hoàng Như Khánh – Chủ nhiệm đề tài VAST 02.05/20-21 cho phép sử dụng nội dung cơng trình nghiên cứu vào mục đích nghiên cứu, viết bảo vệ luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đào Tấn Học ThS Lê Thị Thu Thảo, Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam hỗ trợ định danh mẫu tôm cá biển sử dụng làm nguồn phân lập vi sinh vật biển luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ, Phịng Đào tạo, Khoa Cơng nghệ Sinh học Quý Thầy Cô giáo dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi giúp thực luận văn hoàn thành thủ tục cần thiết Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang anh, chị phịng Cơng nghệ sinh học biển giúp đỡ tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến lãnh đạo trường THPT Nguyễn Chí Thanh, Sở Giáo dục Đạo tạo Khánh Hịa ln quan tâm, động viên giúp đỡ suốt trình học tập hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021 Tác giả luận văn Lê Trọng Bằng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AHPND Bac+ BLIS GDP LPMA NTTS PCR PTN rRNA TCBS TSA TSB VK VKB VSV VSVCT Thông tin đầy đủ Acute HepatoPancreatic Necrosis Disease (Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính) Vi khuẩn biển biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio spp Bacteriocin-like inhitory subtance (Hợp chất có đặc điểm giống bacteriocin) Gross Domestic Product (Tổng sản phẩm quốc nội) Lab-Prepared Marine Agar (Môi trường thạch biển chuẩn bị phịng thí nghiệm) Nuôi trồng thủy sản Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen) Phịng thí nghiệm Ribosome Ribonucleic Acid Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose Agar Tryptic Soy Agar Tryptic Soy Broth Vi khuẩn Vi khuẩn biển Vi sinh vật Vi sinh vật thị DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự khác vi khuẩn Gram dương Gram âm .10 Bảng 1.2 Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản 13 Bảng 1.3 Tác động kinh tế – xã hội tác động khác bệnh liên quan đến Vibrio ngành nuôi trồng thủy sản 15 Bảng 1.4 Một số bacteriocin vi khuẩn Gram âm 19 Bảng 1.5 Một số bacteriocin vi khuẩn Gram dương .20 Bảng 1.6 Một số khác biệt bacteriocin kháng sinh .22 Bảng 1.7 Độ bền nhiệt, pH enzyme thủy phân số bacteriocin sinh tổng hợp vi khuẩn lactic .24 Bảng 1.8 Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển .25 Bảng 2.1 Danh sách chủng thị sử dụng thí nghiệm sàng lọc hoạt tính 36 Bảng 3.1 Thông tin số lượng chủng VKB phân lập tương ứng với mẫu môi trường .46 Bảng 3.2 Kết sàng lọc chủng cho hoạt tính đối kháng Vibrio spp .47 Bảng 3.3 Tổng hợp hình thái khuẩn lạc 30 chủng biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio spp ghi nhận môi trường thạch Mueller Hinton 51 Bảng 3.4 Kết xác định phổ kháng khuẩn 30 chủng vi khuẩn biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio spp xác định phương pháp cấy dọc 54 Bảng 3.5 Tổng hợp khả kháng khuẩn 30 chủng vi khuẩn biển biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio spp xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch 57 Bảng 3.6 Hoạt tính đối kháng V parahaemolyticus 15 chủng vi khuẩn biển sau ủ với proteinase E .61 Bảng 3.7 Sự biến động mật độ tế bào hoạt tính đối kháng với vi sinh vật thị chủng Bacillus spp 2002NTBD1 theo thời gian 68 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 So sánh sản lượng ni trồng thủy sản đánh bắt cá toàn cầu giai đoạn từ 1950 – 2017 11 Hình 1.2 Số lượng ấn phẩm khoa học 20 năm qua liên quan đến từ khóa “marine bacteria” “antimicrobial activity” phân phối theo mười quốc gia hàng đầu 17 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động bacteriocin 21 Hình 2.1 Quy trình phân lập vi khuẩn biển từ ruột tôm, ruột cá, bọt biển rong .39 Hình 2.2 Hình ảnh số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển 40 Hình 2.3 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 44 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn biển làm .45 Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng VKB chủng Vibrio spp xác định phương pháp cấy dọc 50 Hình 3.3 Hình thái số đại diện bac+ môi trường Mueller Hinton agar .53 Hình 3.4 Phổ kháng khuẩn VKB chủng VSVCT xác định phương pháp cấy dọc 56 Hình 3.5 Khả sinh chất kháng khuẩn canh trường phương pháp khuếch tán đĩa thạch .59 Hình 3.6 Ảnh hưởng enzyme lên hoạt tính kháng Vibrio spp dịch lên men chủng 2002NTBD1 .62 Hình 3.7 Cây phân loại thể mối liên quan chủng có hoạt tính mạnh lồi có trình tự gen 16S rRNA tương đồng 63 Hình 3.8 Khảo sát độ bền nhiệt hợp chất kháng Vibrio spp sinh chủng vi khuẩn biển .67 Hình 3.9 Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật thị dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp 2002NTBD1 thời điểm sinh trưởng khác 69 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn 1.1.2 Tác động vi khuẩn 10 1.1.3 Vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản 11 1.1.4 Vi khuẩn biển – nguồn cung cấp hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học 16 1.2 TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 17 1.2.1 Định nghĩa bacteriocin 17 1.2.2 Phân loại bacteriocin 18 1.2.3 Cơ chế hoạt động bacteriocin 20 1.2.4 Điểm khác biệt kháng sinh bacteriocin 22 1.2.5 Đặc tính bacteriocin 23 1.2.6 Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển 25 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN 27 1.3.1 Các nghiên cứu giới 27 1.3.2 Các nghiên cứu nước 29 1.4 TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN 30 1.4.1 Ứng dụng bacteriocin bảo quản thực phẩm 30 1.4.2 Ứng dụng bacteriocin bảo vệ sức khỏe động vật cạn người 31 1.4.3 Ứng dụng bacteriocin nuôi trồng thủy sản 31 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 33 2.2 NGUYÊN LIỆU 33 2.2.1 Vật liệu thí nghiệm 33 2.2.2 Môi trường nuôi cấy 33 2.2.3 Chủng vi sinh vật thị .36 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.3.1 Phương pháp thu mẫu phân lập vi khuẩn biển 37 2.3.2 Phương pháp khảo sát khả đối kháng với Vibrio spp chủng vi khuẩn biển phân lập .40 2.3.3 Xác định phổ kháng khuẩn chủng vi khuẩn biển tuyển chọn 41 2.3.4 Xác định khả sinh chất kháng khuẩn môi trường lỏng 41 2.3.5 Xác định chất hợp chất kháng khuẩn 42 2.3.6 Phân tích trình tự nucleotide gen mã hóa 16S rRNA .42 2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính hợp chất kháng khuẩn .43 2.3.8 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh chất kháng khuẩn vi khuẩn biển 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 PHÂN LẬP VI KHUẨN BIỂN 45 3.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG BIỂU HIỆN HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO SPP 47 3.3 PHỔ KHÁNG KHUẨN VI KHUẨN TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH DINH DƯỠNG 53 3.4 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG DỊCH MÔI TRƯỜNG LỎNG 57 3.5 XÁC ĐỊNH BẢN CHẤT CỦA HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN 60 3.6 PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA GEN MÃ HĨA 16S RRNA 63 3.7 ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA CÁC HỢP CHẤT KHÁNG VIBRIO SPP 66 3.8 ẢNH HƯỞNG THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN BIỂN 67 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1 KẾT LUẬN 70 4.2 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC