Đang tải... (xem toàn văn)
LỜI CẢM ƠN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÃ HỮU DŨNG “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GEN RPL16 Ở MỘT SỐ MẪU GIỐNG NGHỆ (CURCUNA LONGA L ) CÓ HÀM LƢỢNG CURCUMINOIDS KHÁC[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÃ HỮU DŨNG “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GEN RPL16 Ở MỘT SỐ MẪU GIỐNG NGHỆ (CURCUNA LONGA L.) CÓ HÀM LƢỢNG CURCUMINOIDS KHÁC NHAU” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Thái Nguyên, năm 2015 n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÃ HỮU DŨNG “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GEN RPL16 Ở MỘT SỐ MẪU GIỐNG NGHỆ (CURCUNA LONGA L.) CÓ HÀM LƢỢNG CURCUMINOIDS KHÁC NHAU” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Lớp Khóa học Giáo viên hƣớng dẫn : Chính quy : Cơng nghệ sinh học : CNSH - CNTP : K43 - CNSH : 2011 - 2015 : TS Nguyễn Văn Khiêm TS Nguyễn Văn Duy Thái Nguyên, năm 2015 n i LỜI CẢM ƠN Được trí ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm thời gian thực tập tốt nghiệp em thực đề tài “Nghiên cứu phân lập, giải trình tự phân tích gen rpl16 số mẫu giống nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lƣợng curcuminoids khác nhau” Qua em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy TS Nguyễn Văn Khiêm TS Nguyễn Văn Duy ln tận tình hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực đề tài Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học suốt thời gian thực tập Em xin chân thành cảm ơn anh, chị Bộ môn giống Công nghệ sinh học Ban giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Trồng Chế biến thuốc Hà Nội - Viện Dược Liệu giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt thời gian thực nghiên cứu làm khóa luận Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ln ủng hộ, động viên để em có tự tin học tập nghiên cứu khoa học Em xin trân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Lã Hữu Dũng n ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Danh sách mẫu nghệ, nguồn gốc ký hiệu 13 Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi rpl16 19 Bảng 3.3 Thành phản ứng PCR 19 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt 19 Bảng 4.1 Sự phụ thuộc giá trị mật độ quang vào nồng độ curcumin 22 Bảng 4.2: Kết phân tích hàm lượng Curcumin tổng số mẫu 23 Bảng 4.3: Hàm lượng DNA tổng số mẫu củ nghệ 25 Bảng 4.4 Kích thước khác biệt trình tự gene rpl16 mẫu giống nghệ 34 n iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: hình thái thân, (A); hoa (B) củ (C) Hình 2.2: Cơng thức hóa học số chất nghệ Hình 2.3: Quá trình hình thành di khối u tác động curcumin Hình 4.1: Phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng curcumin 22 Hình 4.2: Điện di DNA tổng số số mẫu nghệ 24 Hình 4.3: Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ mẫu nghệ 25 Hình 4.4 kết pha lỗng DNA tổng số 18 mẫu nghệ 26 Hình 4.5: Điện di sản phẩm PCR gene rpl16 27 Hình 4.6: Sản phẩm PCR sau tinh 28 Hình 4.8 Trình tự gen rpl16 mẫu giống nghệ N9 (A) N18 (B) máy đọc trình tự 36 n iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µg Micro gram µl Micro litre µM Micro Mole Bp base pair (cặp bazơ) CS cộng DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates Kb Kilobase mM Mili Mole Na2EDTA Ethylene diamine tetra acetate sodium NST Nhiễm sắc thể OD Optical density PCR polymerase chain reaction RNA ribonucleic acid TE Tris EDTA n v MỤC LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài .2 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học: .3 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên nước .4 2.1.1 Nguồn gốc, phân bố đặc điểm thực vật học sinh thái nghệ vàng 2.1.2 Thành phần hóa học củ nghệ vàng 2.1.3 Tác dụng sinh học củ nghệ vàng 2.1.4 Một số nghiên cứu nước nghệ hoạt chất curcumin 2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 2.2.1 Nguồn gốc, phân bố nghệ vàng 2.2.2 Thành phần hóa học nghệ vàng 2.2.3 Tác dụng sinh học nghệ vàng .8 2.2.4 Một số nghiên cứu nước 11 Hiện có nhiều cơng trình nghiên cứu nghệ vàng hoạt chất giới 11 PHẦN ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 13 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 14 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 14 3.3 Nội dung nghiên cứu 14 n vi 3.4 Hóa chất thiết bị 14 3.4.1 Hóa chất 14 3.4.2 Thiết bị 15 3.5 Phương pháp nghiên cứu 15 3.5.1 Phương pháp phân tích hàm lượng curcuminoids 15 3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số .17 3.5.3 Phương pháp phân lập gen rpl16 lục lạp phương pháp PCR tinh sản phẩm PCR 18 Sử dụng Kít GeneAll® ExpinTM theo mô tả hãng GeneAll, Hàn Quốc 20 3.5.4 Phương pháp giải trình tự, xác đinh thị phân tử DNA nhận biết giống nghệ có hàm lượng curcumin cao 21 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Xác định hàm lượng curcumin củ nghệ .22 4.1.1 Xây dựng đồ thị chuẩn xác định hàm lượng curcuminoids .22 4.1.2 Kết xác định hàm lượng curcumin mẫu nghệ 23 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số, phân lập, giải trình tự phân tích gen rpl16 24 4.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số 24 4.2.2 Kết phân lập, tinh sạch, giải trình tự phân tích gen rpl16 27 4.3 Kết thị phân tử DNA đặc trưng mẫu giống nhệ .36 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 n Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây nghệ vàng biết đến loại thuốc quý biết đến với loại gia vị thiếu ẩm thực Châu Á Trong cơng thức nấu ăn bên ngồi Nam Á, nghệ sử dụng làm chất tạo mầu, sử dụng đồ uống đóng hộp đồ nướng sản phẩm sữa kem, bánh ngọt, bánh quy,…Đây loại bột quan trọng hầu hết bột cà ri thương mại Hầu hết loại nghệ sử dụng dạng bột củ, số nơi sử dụng Mặc dù thường sử dụng dạng bột khô, nghệ sử dụng dạng tươi Nhìn chung nghệ sử dụng rộng rãi làm gia vị ẩm Châu Á Từ xa xưa, nghệ vàng xem thứ thuốc q cơng dụng mà mang lại Nhân dân ta thường dùng để khử trùng, làm mờ sẹo làm lành vết thương Theo Đông y củ nghệ vàng có vị cay, đắng, tính bình có tác dụng hành khí, hoạt huyết, làm tan máu, tan ứ giảm đau chủ trị bệnh trướng đầy, bế kinh, bệnh sau đẻ, chấn thương, ung thũng Bên cạnh đó, nghệ cịn giúp giảm cân, lưu thơng lọc máu, giúp thể chống lại vi khuẩn kí sinh ruột Weir et al (2007) [32], khám phá khả kìm hãm tế bào ung thư nghệ vàng Trong nhiều nghiên cứu cho thấy hợp chất curcumin dẫn xuất Desmethoxycurcumin Bisdesmethoxycurcumin thành phần quan trọng thành phần tạo nên khả chữa bệnh nghệ Curcumin có loạt hiệu ứng sinh học bao gồm: chống viêm, chống oxy hóa (Shukla et al 2008)[28], hóa trị liệu, kháng sinh, kháng virus hoạt động virus n Một số nghiên cứu nghệ cho thấy Trong tự nhiên curcuminoids phân bố khác củ nghệ Hàm lượng phụ thuộc vào giống, loài, giai đoạn sinh trưởng phát triển yếu tố ảnh hưởng đến mơi trường, khí hậu, thổ nhưỡng Chọn lọc các thể có suất chất lượng cao để nhân nhanh phát triển giống phục vụ sản xuất điều mong muốn người trồng nghệ Về chất di truyền hàm lượng curcuminnoids củ nghệ liên quan đến gen quy định Các gen nằm NST nhân (như gen CURS1, CURS2, CURS3) gen nằm quan tử lục lạp Để xác định cá thể cho hàm lượng curcuminoids cao theo phương pháp thông thường thời gian, tăng chi phí, khơng xác phụ thuộc vào môi trường thời gian thu mẫu củ Chỉ thị phân tử DNA đoạn DNA thuộc gen hay đoạn gen nằm nhân hay lục lạp liên quan đến tổng hợp trao đổi chất tế bào Chỉ thị phân tử DNA đặc trưng cho giống nghệ có hàm lượng curcuminoids cao có tác dụng chẩn đốn xác nhanh cho hàm lượng curcuminoids cao kiểu gen quy định không phụ thuộc vào môi trường thời gian thu mẫu Chỉ thị phân tử DNA có xác tin cậy cao thơng tin di truyền không phụ thuộc vào tuổi, điều kiện sinh lý môi trường (Kalpana et al 2004)[14] Chỉ thị phân tử DNA đặc trưng cho giống nghệ có hàm lượng curcumin cao có tác dụng chẩn đốn xác nhanh cho hàm lượng curcumin cao.Do đó, phạm vi luận văn tiến hành: “Nghiên cứu phân lập, giải trình tự phân tích gen rpl16 số mẫu giống nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lƣợng curcuminoids khác nhau” 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu Nghiên cứu phân lập, giải trình tự phân tích gen rpl16 số mẫu giống nghệ (Curcuna longa L.) có hàm lượng curcumin tổng số khác thu thập Việt Nam n