(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển vi củ sâm ngọc linh (panaxvietnamensis ha et grushv ) từ nuôi cấy phôi soma

1 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .5 DANH MỤC BẢNG .6 DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Mục đích đề tài .10 Cơ sở khoa học tính thực tiễn đề tài 10 3.1 Cơ sở khoa học 10 3.2 Tính thực tiễn 10 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu đề tài 11 4.1 Đối tƣợng nghiên cứu 11 4.2 Phạm vi nghiên cứu đề tài .11 CHƢƠNG TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 12 1.1 SƠ LƢỢC VỀ CHI PANAX 12 1.1.1 Phân bố loài thuộc chi Panax 12 1.1.2 Phân loại 13 1.1.3 Đặc điểm thực vật .16 1.1.4 Thành phần hóa học 16 1.1.5 Tác dụng 17 1.1.6 Các dạng chế biến từ sâm 18 1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM NGỌC LINH 20 1.2.1 Phân loại khoa học 20 1.2.2 Đặc điểm hình thái 20 1.2.3 Đặc điểm sinh trƣởng phát triển sâm Ngọc Linh 21 1.2.4 Đặc điểm phân bố .22 1.2.5 Đặc tính dƣợc liệu 22 1.2.6 Công dụng 23 1.2.7 Giá trị kinh tế 24 1.2.8 Một số nghiên cứu sâm Ngọc Linh nƣớc 24 1.2.9 Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy 27 1.2.10 Điều kiện nuôi cấy 31 1.2.11 Các yếu tố khác ảnh hƣởng đến nuôi cấy in vitro .33 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 38 2.1.1 Thời gian .38 2.1.2 Địa điểm 38 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 38 2.2.2 Điều kiện nuôi cấy 38 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 39 2.2.4 Môi trƣờng hóa chất 39 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .39 2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng hóa chất ni cấy giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ ni cấy phôi soma 39 2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ ni cấy phơi soma 39 2.4 PHƢƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 40 2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng hóa chất ni cấy giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma 40 2.4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện ni cấy giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma 43 2.5 PHƢƠNG PHÁP LẤY SỐ LIỆU 47 2.6 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 47 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA HĨA CHẤT NI CẤY TRONG GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VI CỦ SÂM NGỌC LINH TỪ NUÔI CẤY PHÔI SOMA 48 3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng Myo-inositol lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh .48 3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng adenine sulphate lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 51 3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng L-tyrosine lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh .54 3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng casein hydrolysate lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 57 3.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng peptone lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh .61 3.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng cao nấm men lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh .64 3.2 NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NI CẤY TRONG GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VI CỦ SÂM NGỌC LINH TỪ NUÔI CẤY PHÔI SOMA 66 3.2.1 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 66 3.2.2 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện thống khí lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 69 3.2.3 Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nhiệt độ lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 72 3.2.4 Bài toán tối ƣu 75 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 4.1 KẾT LUẬN 77 4.2 KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BA 6-benzyladenine CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật GA3 Acid gibberellic G-Rb1 Ginsenoside-Rb1 G-Rg1 Ginsenoside-Rg1 G-Rg2 Ginsenoside-Rg2 G-Rd Ginsenoside-Rd HPLC High performance liquid chromatography IBA Indole- 3-butyric LED Light-Emmitting Diode MS Môi trƣờng Murashige Skoog NAA α-Naphtaleneacetic acid OA Olean OCT Ocotillol saponin PPD Protopanaxadiol PPT Protopanaxatriol SH Môi trƣờng Schenk Hildebrandt YE Yeast extract DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Panax giới [2] 12 Bảng 1.2: Bảng hệ thống phân loại loài thuộc chi Panax Châu Á giới [2] 14 Bảng 1.3: Một số vi lƣợng thông dụng 30 Bảng 1.4: Các vitamin thƣờng dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật 31 Bảng 2.1: Các mức khoảng biến thiên thí nghiệm .45 Bảng 2.2: Bảng bố trí ma trận nghệm thức thực nghiệm 46 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng myo-inositol lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh .48 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng adenine sulphate lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh 52 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng L-tyrosine lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh .55 Bảng 3.4 : Ảnh hƣởng casein hydrolysate lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh 58 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng peptone lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh 61 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng cao nấm men lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh .64 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên hình thành vi củ từ mẫu phơi soma sâm Ngọc Linh 67 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng điều kiện thống khí lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh 69 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng điều kiện nhiệt độ lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh 72 Bảng 3.10: Bố trí ma trận thí nghiệm thực nghiệm 75 Bảng 3.11: Bảng mức độ ảnh hƣởng điều kiện ni cấy lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh .76 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hồng sâm (trái) Hắc sâm (phải) [5] 18 Hình 1.2: Các sản phẩm phong phú từ sâm thị trƣờng [5] 19 Hình 1.3: Sâm Ngọc Linh [9] 20 Hình 2.1: Phôi soma sâm Ngọc Linh nuối cấy in vitro 38 Hình 3.1: Ảnh hƣởng myo-inositol lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 49 Hình 3.2: Ảnh hƣởng adenine sulphate lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh .53 Hình 3.3: Ảnh hƣởng L-tyrosine lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 56 Hình 3.4: Ảnh hƣởng casein hydrolysate lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 59 Hình 3.5: Ảnh hƣởng peptone lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh .62 Hình 3.6: Ảnh hƣởng cao nấm men lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh .65 Hình 3.7: Ảnh hƣởng ánh sáng lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 67 Hình 3.8: Ảnh hƣởng điều kiện thống khí lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 70 Hình 3.9: Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 73 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Sâm Ngọc Linh có tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Từ sâm Ngọc Linh chiết đƣợc 50 hợp chất, xác định cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc biết (thƣờng thấy sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) 24 saponin dammarane có cấu trúc khơng bắt gặp lồi sâm khác giới [1] Với mục đích bảo tồn phát triển nguồn gen quý quốc gia đồng thời phát triển vùng trồng để cung cấp nguyên liệu cho ngành dƣợc, từ lâu công tác tạo nguồn giống sâm Ngọc Linh đƣợc đề cập đến với hai hình thức chủ yếu nhân giống từ hạt tạo giống từ đầu mầm (thân rễ ngầm) nhƣng kết đạt đƣợc hạn chế số lƣợng hạt giống chất lƣợng ngày khai thác mức sâm cho hạt, công nghệ vi nhân giống chƣa đáp ứng đƣợc chất lƣợng giống canh tác đồng ruộng (tỷ lệ giống chết chậm phát triển, khơng tạo củ hồn chỉnh trồng ngồi đồng ruộng) Do đó, cần phải cải tiến cơng nghệ vi nhân giống sâm Ngọc Linh yêu cầu cấp thiết cần giải Việc ứng dụng phƣơng pháp phát sinh phôi soma sâm Ngọc Linh hứa hẹn mang lại nhiều ƣu điểm tạo số lƣợng lớn có chất lƣợng tốt thời gian ngắn, tỷ lệ sống sót ngồi vƣờn ƣơm cao phát triển từ phơi vơ tính theo đƣờng tƣơng tự nhƣ phơi hữu tính Tuy nhiên kết nghiên cứu gần phát sinh phôi soma sâm Ngọc Linh nhiều hạn chế hiệu hình thành vi củ (micro - rhizome) từ phôi, giai đoạn quan trọng để tăng tỷ lệ hình thành giống hồn chỉnh đơn vị nuôi cấy Các kết nghiên cứu trình sinh lý giai đoạn hình thành giai đoạn phát triển vi củ (micro - rhizome) sâm Ngọc Linh từ ni cấy phơi soma ứng dụng sản xuất sinh khối sâm điều kiện Plant factory (canh tác nhà) 10 Với sở lý trên, đề tài: “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến phát triển vi củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) từ nuôi cấy phôi soma” cần đƣợc tiến hành nghiên cứu Mục đích đề tài Nghiên cứu tìm loại nồng độ chất hữu nhƣ điều kiện ni cấy in vitro thích hợp cho giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma Cơ sở khoa học tính thực tiễn đề tài 3.1 Cơ sở khoa học Sâm Ngọc Linh loài sâm có hàm lƣợng saponin khung dammaran cao (khồng 12 - 15%) lƣợng saponin nhiều so vói loài khác cùa chi Panax giới [2] Với đặc điểm đó, sâm Ngọc Linh khơng lồi sâm q mà cịn có nhiều nghiên cứu nhân giống công dụng sâm Ngọc Linh Việt Nam giới Theo nghiên cứu dƣợc lý lâm sàng sâm Ngọc Linh cho kết tốt: bệnh nhân ăn ngon, ngủ ngon, cải thiện thị lực, hoạt động trí tuệ, thể lực sức đề kháng, cải thiện trƣờng hợp suy nhƣợc thần kinh, nâng cao huyết áp ngƣời bị huyết áp thấp Hiện nay, với nhu cầu gia tăng từ ngành dƣợc phẩm thảo dƣợc sâm Ngọc Linh đƣợc khai thác mức nên lâm vào tình trạng bị đe dọa tuyệt chủng cao Nhân giống sâm Ngọc Linh cịn gặp nhiều khó khăn Nhân giống hữu tính theo cách thơng thƣờng (gieo hạt) khơng cho kết cao hạt gieo nằm đất sau thời gian dài nảy mầm, hạt thƣờng bị lồi động vật, trùng gặm nhấm ăn…, tỷ lệ nảy mầm từ hạt thấp (chỉ đạt khoảng 30 - 40%) [3] Do việc ni cấy tạo in vitro góp phần tăng sức sống cây, nâng cao tỷ lệ sống sót đƣa vƣờn ƣơm bƣớc mới, góp phần bảo tồn phát triển lồi dƣợc liệu q 3.2 Tính thực tiễn Xác định đƣợc loại nồng độ chất hữu nhƣ điều kiện nuôi