Công nghệ nuôi cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội ở thực vật

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 16990019317521000000 NGUYỄN MINH LÝ CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TIỂU BÀO TỬ TẠO THỂ ĐƠN BỘI Ở THỰC VẬT NHÀ XUẤT BẢN THÔNG TIN & TRUYỀN THÔNG Hà Nội – 2023 NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP MỤC LỤC Lời mở đầu�� vii Chương GIỚI THIỆU VỀ THỂ ĐƠN BỘI Ở THỰC VẬT�� 1.1 Thể đơn bội thực vật ứng dụng��2 1.2 Phương pháp tạo thể đơn bội��6 Chương CƠ CHẾ PHÁT SINH PHÔI TỪ TIỂU BÀO TỬ NI CẤY IN VITRO��21 2.1 Sự hình thành hạt phấn�� 22 2.2 Phát sinh phôi đơn bội từ tiểu bào tử�� 24 Chương QUY TRÌNH NI CẤY TIỂU BÀO TỬ��29 3.1 Quy trình ni cấy tiểu bào tử tách rời �� 30 3.2 Quy trình ni cấy bao phấn �� 40 3.3 So sánh kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử tách rời nuôi cấy bao phấn�� 42 Chương YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY TIỂU BÀO TỬ ��47 4.1 Kiểu gen mẹ �� 48 4.2 Đặc điểm sinh lý mẹ�� 49 ©2023. Cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật iii 4.3 Giai đoạn phát triển tiểu bào tử�� 50 4.4 Yếu tố kích ứng�� 51 Chương NHÂN ĐƠI BỘ NHIỄM SẮC THỂ TẠO CÂY ĐƠN BỘI KÉP ��63 5.1 Nhân đôi NST tự phát�� 64 5.2 Nhân đôi NST nhân tạo�� 68 Chương PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÂY ĐƠN BỘI KÉP��75 6.1 Chỉ thị hình thái�� 76 6.2 Đếm số lượng nhiễm sắc thể�� 79 6.3 Phân tích dòng chảy tế bào �� 81 6.4 Chỉ thị phân tử �� 83 iv ©2023. Cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật Danh mục hình Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 1.7 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 5.1 Hình 6.1 Hình 6.2 Mục lục Sơ đồ tạo dòng thực vật (Teingtham, 2017) ��4 Con đường phát sinh đơn bội đơn bội kép từ giao tử đực ��7 Con đường phát sinh đơn bội đơn bội kép từ giao tử cái��7 Sơ đồ phân loại phương pháp tạo thể đơn bội ��8 Phương pháp “Bulbosum” tạo thể đơn bội ��9 Sử dụng dòng cảm ứng CENH3 tạo đơn bội ��11 Sơ đồ quy trình ni cấy nỗn tạo đơn bội thực vật ��14 Quá trình phát sinh tiểu bào tử (Simpson, 2019) ��22 Hạt phấn hai nhân hạt phấn ba nhân (Simpson, 2019).��23 Giai đoạn phát triển tiểu bào tử ��23 Các giai đoạn phát sinh phôi từ tiểu bào tử cải dầu (Brassica napus) (Soriano et al., 2013) ��26 Sự hoàn thiện phôi phát sinh từ tiểu bào tử cải dầu (Brassica napus) (Seguí‐Simarro Nuez, 2008) ��26 Sơ đồ bước kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử tạo đơn bội/ đơn bội kép.��31 Hình thái nụ hoa (A’-G’) bao phấn (A’’-G’’) tương ứng với giai đoạn phát triển chiếm ưu tiểu bào tử (A-G) ca (Parra-Vega, et al., 2013) ��34 Sơ đồ mô tả bước kỹ thuật nuôi cấy bao phấn.��41 Phân loại phương pháp nhân đôi NST nhân tạo (Segui-Simarro, 2021)69 Số lượng NST kỳ sau I tế bào sinh giao tử đực (A, C, E, G) số lượng lục lạp tế bào khí khổng (B, D, F, H) họ Cải (Brassica) có mức độ bội thể khác (Monakhos, et al., 2014) ��77 Biểu đồ cường độ huỳnh quang để xác định mức độ bội thể Gerbera hybrida (Li et al., 2020) ��82 v Danh mục bảng Bảng 5.1 Tỉ lệ (%) mức độ bội thể tái sinh kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử (Ahmadi & Ebrahimzadeh, 2020)��65 Bảng 5.2 Một số ví dụ cảm ứng nhân đơi NST in vivo áp dụng nghiên cứu đơn bội khác (Segui-Simarro, 2021)��70 Bảng 5.3 Phương pháp nhân đôi NST in vitro công bố loài thực vật (Segui-Simarro, 2021)��71 Bảng 6.1 Số lượng lục lạp tế bào khí khổng số lồi thực vật (Ahmadi & Ebrahimzadeh, 2020)��77 vi ©2023. Công nghệ nuôi cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật LỜI MỞ ĐẦU T hể đơn bội ứng dụng nhiều lĩnh vực nghiên cứu thực tiễn khác Đặc biệt, công nghệ tạo thể đơn bội thực vật có ý nghĩa vô quan trọng công tác chọn tạo giống trồng Công nghệ cho phép tạo dòng đơn bội kép mang tất locus trạng thái đồng hợp tử thời gian ngắn, từ cho phép giảm chi phí q trình nghiên cứu sản xuất hạt giống lai F1 Thể đơn bội hình thành từ giao tử phát triển theo đường bào tử thể tác động yếu tố kích ứng khác Cho đến nay, có nhiều phương pháp quy trình tạo thể đơn bội nghiên cứu, xây dựng ứng dụng thực tế sản xuất đơn bội/đơn bội kép với số lượng lớn Trong đó, ni cấy tiểu bào tử phương pháp ưu tiên phát triển với suất tạo đơn bội/ đơn bội kép cao Cuốn sách tham khảo viết với mục tiêu giới thiệu công nghệ nuôi cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật cho nhà nghiên cứu, học viên sinh viên lĩnh vực chọn tạo giống trồng Sách gồm chương với nội dung chủ yếu: • Giới thiệu thể đơn bội thực vật (Chương 1); • Cơ chế phát sinh phôi từ tiểu bào tử nuôi cấy in vitro (Chương 2); ©2023. Cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật vii • Quy trình ni cấy tiểu bào tử (Chương 3); • Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu nuôi cấy tiểu bào tử (Chương 4); • Nhân đơi nhiễm sắc thể tạo đơn bội kép (Chương 5); • Phương pháp xác định đơn bội kép (Chương 6) Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên thuộc Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng hỗ trợ tơi q trình hoàn thành sách Đây sách lần xuất chủ đề này, q trình biên soạn khơng tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp từ Quý vị độc giả để sách hoàn thiện lần xuất sau Trân trọng cảm ơn! Tác giả viii ©2023. Cơng nghệ nuôi cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật Chương HƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH P CÂY ĐƠN BỘI KÉP 6.1 Chỉ thị hình thái��76 6.2 Đếm số lượng nhiễm sắc thể��79 6.3 Phân tích dòng chảy tế bào��81 6.4 Chỉ thị phân tử ��83 Tóm tắt T rong cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử, tái sinh có mức độ bội thể khác bao gồm đơn bội, lưỡng bội, đa bội Vì vậy, việc xác định số lượng NST thu bước quan trọng quy trình giúp đánh giá hiệu khả ứng dụng quy trình thực tế Hiện phương pháp xác định số lượng NST chia thành hai loại: trực tiếp thông qua đếm số lượng NST, phân tích dịng chảy tế bào gián tiếp thơng qua thị hình thái Ngồi ra, quy trình ni cấy tiểu bào tử (đặc biệt ni cấy bao phấn), tái sinh từ tế bào soma (2n), đó, việc phân biệt có nguồn gốc từ tế bào soma (cây lưỡng bội) từ tiểu bào tử (đơn bội kép) có ý nghĩa vơ quan trọng Để đạt mục đích ngồi đặc điểm hình thái (chỉ thị hình thái) thị hóa sinh sử dụng Tuy nhiên, với độ tin cậy cao, kỹ thuật thực đơn giản thị phân tử (chỉ thị DNA) sử dụng phổ biến ©2023. Cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật 75 6.1 Chỉ thị hình thái Chỉ thị hình thái đặc điểm hình thái hỗ trợ việc gián tiếp xác định mức độ bội thể Thơng thường đặc điểm hình thái sử dụng chiều cao cây, kích thước lá, kích thước hoa, sức sống khả hữu thụ cây, số lượng sức sống hạt phấn, số lượng lục lạp tế bào khí khổng, kích thước tế bào khí khổng, kích thước tế bào Giữa có mức độ bội thể khác có khác biệt đặc điểm kiểu hình Cây đơn bội có sức sống giảm, kích thước hoa nhỏ với mức độ thối hóa khác từ rụng sớm nụ hoa, hình dạng bất thường, bao phấn phát triển khơng bình thường, thối hóa nhụy bao phấn hạt phấn có sức sống khả thụ phấn yếu giao tử tạo khơng có cân di truyền Những điều làm cho đơn bội thường bất thụ (Höfer et al., 2008) Trong đó, đơn bội kép đặc trưng phát triển hoa phấn hoa bình thường Tuy nhiên, đặc điểm có độ tin cậy thấp thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trường sống Khả sống hạt phấn đánh giá thơng qua nhuộm aceto-carmine, tatrazolium fluorescein diacetate (Shekari, 2016; Ascari et al., 2018) Những hạt phấn chết khơng có khả thụ phấn có hình dạng biến đổi, nhuộm màu hồn tồn khơng nhuộm màu khơng có tế bào chất Ngược lại, hạt phấn sống có khả thụ phấn có hình dạng bình thường, tế bào chất nhuộm màu rõ ràng Ở Physalis peruviana L đơn bội kép tạo bao phấn nụ hoa, đơn bội có bao phấn (Garcia-Arias et al., 2018) Trong nhiều nghiên cứu số lượng lục lạp tế bào khí khổng lớp biểu bì mặt thị đáng tin cậy để xác định mức độ bội thể thực vật (Hình 6.1) (Monakhos et al., 2014) Các mẫu cố định dung dịch Canoy (3 ethanol : acetic acid) nhuộm dung dịch KI AgNO3 quan sát kính hiển vi Để đảm bảo độ tin cậy, cần đếm tối thiểu 25 khí 76 ©2023. Cơng nghệ nuôi cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật HÌNH 6.1 Số lượng NST kỳ sau I tế bào sinh giao tử đực (A, C, E, G) số lượng lục lạp tế bào khí khổng (B, D, F, H) họ Cải (Brassica) có mức độ bội thể khác (Monakhos, et al., 2014) Bảng 6.1 Số lượng lục lạp tế bào khí khổng số lồi thực vật (Ahmadi & Ebrahimzadeh, 2020) Loài Anthurium andreanum L Số lượng lục lạp Số lượng lục lạp Tỉ lệ đơn bội đơn bội kép (DH) DH/đơn bội 17,3 30,4 1,8 12,8-14,4 19,5-20,9 1,6-2,0 Brassica oleracea L 6,9-7,6 12,3-13,8 1,6-2,0 Brassica rapa L 4,9-6,2 8,4-11,3 1,7-1,8 7-14 15-24 2,0-2,1 8,9-9,6 15,8-17,4 1,7-1,9 12,0 24,0 2,0 Physalis peruviana L 4,0-8,0 7,0-10,0 1,2-1,7 Solanum tebersum L 12,6-13,1 16,0-22,0 1,2-1,8 Brassica napus L Capsicum annuum L Chrysanthemum Chương Phương pháp xác định đơn bội kép 77 khổng kiểm tra tối thiểu từ ba đến năm Sau so sánh số lượng lục lạp với lưỡng bội đối chứng Tuy nhiên, cần lưu ý số lượng lục lạp thể đơn bội khơng thiết phải nửa so với thể lưỡng bội Tỉ lệ đơn bội lưỡng bội số lượng lục lạp khí khổng thay đổi tùy thuộc vào lồi kiểu gen Vì vậy, để áp dụng đặc điểm cần thiết phải xây dựng mối liên hệ giới hạn số lượng lục lạp tế bào khí khổng mức độ bội thể lồi, chí kiểu gen Ở bắp cải, số lượng lục lạp tế bào khí khổng khác biệt lớn giống có thời gian sinh trưởng khác (Monakhos, et al., 2014) Bên cạnh số lượng lục lạp, kích thước chiều dài tế bào khí khổng có liên quan đến mức độ bội thể (Molenaar et al., 2019; Watts, 2023) Tương tự số lượng lục lạp, kích thước tế bào đơn bội không thiết phải nửa kích thước tế bào lưỡng bội Ví dụ, lưu ly tế bào khí khổng đơn bội có chiều dài trung bình 19,8 μm 16,2 μm chiều rộng, tế bào khí khổng lưỡng bội có kích thước 26,2 μm 17,5 μm (Abdollahi et al., 2021) Ở dưa hấu, tế bào đơn bội có chiều dài từ 17 đến 18 μm đường kính 10–12 μm, thể lưỡng bội 23 đến 24 μm 18 μm (Sari & Solmaz, 2021) Một số đặc điểm khác số lượng sức sống hạt phấn, số lượng nhân tế bào mơ tả có liên quan đến mức độ bội thể thực vật Tuy nhiên, chúng có độ tin cậy thấp, phụ thuộc vào điều kiện sống, khó phân biệt thể đơn bội đa bội Ngoài ra, đặc điểm hạt phấn cần nhiều thời gian để đánh giá đặc điểm khác Thông qua đánh giá thị hình thái xác định thể đơn bội, đơn bội kép, đa bội Bên cạnh đó, số trường hợp phân biệt đơn bội kép lưỡng bội thu q trình ni cấy bao phấn Mặc dù loại thị có chi phí thực thấp, thao tác đơn giản thay đổi phụ thuộc vào 78 ©2023. Cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật điều kiện phát triển (nhiệt độ, ánh sáng, chế độ tưới, dinh dưỡng…) Điều làm giảm độ tin cậy kết thu 6.2 Đếm số lượng nhiễm sắc thể Đếm số lượng NST phương pháp trực tiếp xác sử dụng rộng rãi từ lâu để xác định mức độ bội thể thực vật (Ribeiro et al., 2018) Trong phương pháp cần tiến hành thực tiêu NST kỳ phân chia tế bào với kích thước, số lượng đặc trưng rõ ràng Ở tế bào nguyên phân, số lượng NST rõ ràng kỳ số trường hợp kỳ sau Đối với giảm phân kỳ kỳ sau I II Nguồn mẫu tối ưu để đếm số lượng NST mô phân sinh đỉnh rễ chồi cho nguyên phân tế bào sinh giao tử đực cho giảm phân bao phấn bầu nhụy (Ochatt et al., 2018) Hiện nay, có 02 phương pháp để đếm số lượng tế bào phương pháp Squashing (ép) Spreading (duỗi thẳng) Phương pháp Squashing có quy trình đơn giản tương đối dễ thực Tuy nhiên, đa số áp dụng lồi thực vật có NST kích thước lớn số lượng Quy trình Squashing bao gồm bước sau: • Bước 1: Thu mẫu với tế bào kỳ kỳ sau chu kỳ phân chia tế bào Thời gian thu mẫu cần tối ưu cho loài thực vật • Bước 2: Tiền xử lý mẫu chất ức chế phân bào để tăng số lượng tế bào phân bào kỳ giữa, tăng khả cuộn xoắn phân tách NST Một số chất thường sử dụng 8-Hydroxyquinoline, Colchicine, α-Bromonaphthalene, Paradichlorobenzene • Bước 3: Cố định mẫu hỗn hợp chất acetic acid, ethanol, chloroform, propionic acid theo tỷ lệ khác để dừng toàn hoạt động tế bào thời điểm cố định Chương Phương pháp xác định đơn bội kép 79 mà giữ nguyên cấu trúc Thời gian cố định mẫu kéo dài tới 24 Dựa thành phần chất hỗn hợp cố định chia thành loại sau: dung dịch Carnoy’1 (1 acetic acid: ethanol); dung dịch Carnoy’2 (1 acetic acid: chloroform: ethanol); dung dịch Propionic Acid Alcohol (1 propionic acid: ethanol) • Bước 4: Rửa mẫu khỏi hóa chất cố định thủy phân 1N HCl nhuộm loại thuốc nhuộm khác Nếu chất lượng tiêu tốt thu NST (khơng cịn dấu vết tế bào chất) phân biệt vùng nhiễm sắc dị nhiễm sắc Một số loại thuốc nhuộm sử dụng Aceto-Carmine (1-4%); Feulgen (fucshin, 1N HCl, potassium metabisulfite (K2S2O5), than hoạt tính); AlcoholicHydrochloric Acid – Carmine (carmine, HCl, ethanol 95%); Lacto-Propionic-Orcein (orcein, lactic acid, propionic acid); Carbol fuchin (fuchsin, phenol, aceic acid formalin); Giemsa • Bước 5: Quan sát tiêu kính hiển vi đếm số lượng NST Trong số thuốc nhuộm trên, aceto-carmine sử dụng phổ biến tính chất đơn giản, độc hại Tuy nhiên tiêu chuẩn bị theo phương pháp thường tiêu tạm thời, không bảo quản được thời gian dài Để chuyển thành tiêu vĩnh viễn cần thực thêm số bước khác để loại bỏ lammelle khỏi tiêu bản, phân hóa màu, khử nước, làm mẫu và dán mẫu Bên cạnh tiêu khơng thể sử dụng tiếp theo cho số kỹ thuật nghiên cứu chun sâu FISH, GISH Chính vậy, để khắc phục nhược điểm phương pháp Spreading xây dựng Quy trình thực tiêu NST theo phương pháp Spreading bao gồm bước 1, 2, tương tự phương pháp Squashing Nhưng bước tiến hành thủy phân thành màng tế bào dung dịch enzyme (cellulase, pectinase…) 37ºC Thành phần, thời gian nồng độ enzyme dùng để xử lý mẫu phụ thuộc 80 ©2023. Cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật vào đối tượng nghiên cứu Mẫu sau ủ dung dịch enzyme nghiền nhỏ dung dịch acetic acid 45-60% đưa lên lam kính Sau NST định hình tiêu ethanol 96% sấy khô Tiêu nhuộm dung dịch Giemsa 1-4% thuốc nhuộm huỳnh quang DAPI quan sát kính hiển vi Đếm NST thực nhiều loài thực vật khác nhau, nhiên, việc xác định thể bội thể cách đếm NST có số hạn chế yêu cầu thời gian thực dài, đòi hỏi kỹ thực cao, cần tối ưu thời điểm thu mẫu cho loài, kiểu gen NST tương đối khó quan sát, đặc biệt loại trồng có NST nhỏ (Takahira et al., 2011) 6.3 Phân tích dịng chảy tế bào Phương pháp phân tích dịng chảy tế bào lần sử dụng vào năm 1986 Sree Ramulu Dijkhuis để xác định mức độ ổn định số lượng NST khoai tây nhân giống in vitro Cho đến nay, phương pháp áp dụng rộng rãi để xác định mức độ bội thể thực vật, đặc biệt xác định đơn bội kép tạo từ công nghệ nuôi cấy tiểu bào tử in vitro Xác định mức độ bội thể thực vật phương pháp dòng chảy tế bào (Flow cytometry) liên quan đến việc nhuộm nhân tế bào thuốc nhuộm huỳnh quang có khả liên kết với phân tử DNA Các tế bào nhuộm phát tia laser phân tích kết dựa giá trị C để phân biệt tế bào với hàm lượng DNA khác (Hình 6.2)(Bohanec, 2003; Dolezel & Bartos, 2005) Quy trình thực kỹ thuật dịng chảy tế bào gồm bước sau (Seguí-Simarro, 2021): • Tách nhân tế bào: Ở thực vật, tế bào thường có kích thước lớn, đa hình thường gây tín hiệu lỗi sử dụng thiết bị đo dịng chảy tế bào Vì nhân tế bào có kích thước nhỏ hình dạng tách (Cousin et al., 2009; Ochatt Chương Phương pháp xác định đơn bội kép 81 HÌNH 6.2 Biểu đồ cường độ huỳnh quang để xác định mức độ bội thể Gerbera hybrida (Li et al., 2020) A- đơn bội (n), B- đơn bội kép (2n), C- khảm (n + 2n) et al., 2011) Nhân tế bào giải phóng từ mẫu thực vật (lá, thân non, chồi, hoa, rễ ) dung dịch đệm đặc hiệu kết hợp với nghiền lắc với hạt thủy tinh (Ahmadi & Ebrahimzadeh, 2020) • Tinh nhân tế bào: Trong dung dịch tách thu chứa mảnh vỡ tế bào với kích thước lớn, bào quan, chất phenol, enzyme khác Vì vậy, tinh nhân tế bào bước cần thiết để đảm bảo tính xác kết Để loại bỏ mảnh vỡ tế bào, bào quan có kích thước lớn, tiến hành lọc dung dịch thu sau nhuộm màng lọc có kích thước lỗ màng 20-100 μm Để loại bỏ tạp chất khác với kích thước nhỏ kích thước nhân bổ sung thêm β-mercaptoethanol, PVP, proteinase K, ribonuclease • Nhuộm nhân tế bào: Hai loại thuốc nhuộm phổ biến DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole), propidium iodide (PI) Trong đó, DAPI (1,5 µg/ml) đặc hiệu cho nucleotide AT loại thuốc nhuộm sử dụng phổ biến để xác định mức độ bội thể phương pháp phân tích dịng chảy tế bào PI (50 µg/mL) ưu tiên để xác định kích thước hệ gen khơng đặc trưng cho cặp nucleotide cụ thể 82 ©2023. Cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật • Phân tích mẫu thiết bị đếm dịng chảy tế bào Kết phân tích xử lý số phần mềm chuyên dụng ví dụ CFlow® Plus software Phương pháp đếm tế bào dịng chảy có số ưu điểm rõ rệt với phương pháp khác như, tính xác cao tương tự phương pháp đếm NST kỳ giữa, yêu cầu số lượng mẫu đầu vào thấp, thời gian thực ngắn hơn, tốn cơng hơn, cho phép đo mức độ bội thể giai đoạn phát triển sớm phát sinh từ nuôi cấy tiểu bào tử, cho phép phát thể khảm tái sinh với số lượng NST không tế bào mô liền kề (Bohanec, 2003; Molenaar et al., 2019) Ngồi ra, phương pháp tối ưu hóa cho nhiều loài thực vật khác nhau, cho nhiều nguồn mẫu vật (lá, thân non, hoa, chồi, hạt phấn, rễ), mẫu khơ, tươi, bảo quản lạnh Bên cạnh đó, phương pháp có hạn chế định, q trình tách nhân tế bào cịn tồn tạp chất ảnh hưởng đến liên kết nhân thuốc nhuộm, số chất tự phát huỳnh quang tồn dịch chiết, từ làm giảm tính xác kết thu Ngồi ra, chi phí thực phương pháp cao so với phương pháp khác 6.4 Chỉ thị phân tử Sau đánh giá mức độ bội thể tái sinh thu được, cần tiến hành phân biệt đơn bội kép phát sinh từ tiểu bào tử phát sinh từ tế bào soma (Murovec & Bohanec, 2012) Trong đa số trường hợp, việc phân biệt sử dụng quy trình ni cấy bao phấn Tuy nhiên, quy trình ni cấy tiểu bào tử tách rời, có xác xuất thấp tái sinh từ tế bào soma, trình tách tiểu bào tử khơng loại bỏ hồn tồn tế bào Để xác định nguồn gốc tái sinh từ tiểu bào tử hay từ tế bào soma, sử dụng thị hóa sinh, thị phân tử Tuy nhiên, thời gian gần nghiên cứu tập chung chủ yếu vào việc sử dụng thị phân tử (Fang et al., 2016) Chương Phương pháp xác định đơn bội kép 83 Nguyên tắc sử dụng thị phân tử dòng đơn bội kép đồng hợp tất locus, dịng phát sinh từ tế bào soma thành bao phấn mang nhiều locus trạng thái đồng hợp Các thị phân tử lựa chọn có khả phân biệt dòng tái sinh Các thị phân tử RAPD (randomly amplifed polymorphic DNA), SSR (simple sequence repeats), SRAP (sequencerelated amplifed polymorphism), ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) có khả ứng dụng cao phân biệt dòng đơn bội kép đồng hợp tử tính hiệu quả, đơn giản thực hiện, chi phí thấp (Ahmadi & Ebrahimzadeh, 2020) Chỉ thị RAPD với đoạn mồi có kích thước 10 nucleotide sử dụng để xác định thành công đơn bội kép nuôi cấy bao phấn Brassica oleracea L (Stipic & Campion 1997), Daucus carota L (Staniaszek & Habdas, 2006), Capsicum annuum L (Olszewska et al., 2017) Chỉ thị có tính đa hình cao, vậy, có khả phân biệt dễ dàng đơn bội kép Tuy nhiên, thị trội, nên không cho phép phân biệt cá thể đồng hợp tử trội dị hợp tử Cụ thể, dùng thị RAPD xác định đơn bội kép phát sinh từ loại allen Để tăng hiệu cần sử dụng nhiều thị RAPD khác Bên cạnh đó, tính ngẫu nhiên, mức độ ổn định lặp lại thấp gây hạn chế cho việc sử dụng thị (Robart & Wolfe, 2014) Hiện nay, thị SSR sử dụng tương đối phổ biến để định danh đơn bội kép nhiều loại trồng khác nhờ vào tính đặc hiệu ổn định cao, tính chất di truyền đồng trội, hàm lượng thông tin lớn (Vieira et al., 2016) Chỉ thị cho phép xác định đơn bội kép từ tất allen locus phân biệt đồng hợp tử dị hợp tử Để nhận diện tái sinh có nguồn gốc từ tiểu bào tử quy trình ni cấy bao phấn sử dụng thị SSR CNZ43 dừa (Perera et al., 2008), thị RM19660 lúa (Kulkarni et al., 2020), thị Csin 06 chè (Bajpai & Chaturvuedi, 2023) 84 ©2023. Cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật Tài liệu tham khảo Abdollahi, M.R., Eshaghi, Z.C., & Seguí-Simarro, J.M (2021) Haploid Plant Production in Borage (Borago officinalis L.) by Anther Culture Doubled Haploid Technology: Volume 3: Emerging Tools, Cucurbits, Trees, Other Species, 237-248.54 Doi: 10.1007/978-1-0716-1331-3_15 Ahmadi, B., & Ebrahimzadeh, H (2020) In vitro androgenesis: spontaneous vs artificial genome doubling and characterization of regenerants Plant Cell Reports, 39, 299–316 Doi: 10.1007/s00299-020-02509-z Ascari, L., Novara, C., Dusio, V., Oddi, L., Siniscalco C (2018) Quantitative methods in microscopy to assess pollen viability in different plant taxa Plant Reproduction, 33, 205–219 (2020) Doi: 10.1007/s00497-020-00398-6 Bajpai, R., Chaturvedi, R (2023) In vitro production of doubled haploid plants in Camellia spp and assessment of homozygosity using microsatellite markers Journal of Biotechnology, 361, 89-98 Doi: 10.1016/j jbiotec.2022.11.019 Bohanec, B (2003) Ploidy determination using flow cytometry In: M Maluszynski, K J Kasha, B P Forster, & I Szarejko (Ed.), Doubled haploid production in crop plants (pp 397–403) The Netherlands: Springer Doi: 10.1007/978-94-017-1293-4_52 Cousin, A., Heel, K., Cowling, W.A., Nelson, M.N (2009) An efcient highthroughput fow cytometric method for estimating DNA ploidy level in plants Cytometry Part A, 75(12), 1015–1019 Dolezel, J., Bartos, J (2005) Plant DNA fow cytometry and estimation of nuclear genome size Annals of Botany, 95(1), 99–110 Doi: 10.1093/aob/mci005 Fang, J., Zhu, X., Wang, C., & Shangguan, L (2016) Applications of DNA technologies in agriculture Current Genomics, 17(4), 379–386 Doi: 10.21 74/1389202917666160331203224 Garcia-Arias, F., Sánchez-Betancourt, E., Núñez, V (2018) Fertility recovery of anther-derived haploid plants in Cape gooseberry (Physalis peruviana L.) Agronomía Colombiana, 36(3), 201–209 Doi: 10.15446/agron.colomb v36n3.73108 Höfer, M., Chrafe, C., Boudichevskaja, A., Lopez, A., Bueno, M.A., & Roen, D (2008) Characterization of plant material obtained by in vitro Chương Phương pháp xác định đơn bội kép 85 androgenesis and in situ parthenogenesis in apple Scientia Horticulturae, 117(3), 203–211 Doi: 10.1016/j.scienta.2008.02.020 Kulkarni, S.R., Ulaganathan, K., Sundaram, R.M., HariPrasad, A.S., Abdul Fiyaz, R & Balachandran, S.M (2020) Production of doubled haploids from rice hybrid KRH-2 through anther culture and their evaluation for agro-morphological traits Journal of Rice Research, 13, 33-50 Li, F., Cheng, Y., Zhao, X., Yu, R., Li, H., Wang, L., Li., S., Shan, Q (2020) Haploid induction via unpollinated ovule culture in Gerbera hybrida Scientific Reports, 10, 1702 Doi: 10.1038/s41598-020-58552-z Molenaar, W.S., de Oliveira Couto, E.G., Piepho, H., & Melchinger, A.E (2019) Early diagnosis of ploidy status in doubled haploid production of maize by stomata length and flow cytometry measurements Plant breeding, 138(3), 266-276 Doi: 10.1111/pbr.12694 Monakhos, S.G., Nguyen, M.L., Bezbozhnaya, A.V., Monakhos, G.F (2014) A relationship between ploidy lever and the number of chloroplasts in stomatal guard cells in diploid and amphidiploid Brassica species Doi: 10.15389/ agrobiology.2014.5.44eng Sel’skokhozyai stvennaya Biologiya [Agricultural Biology], 5, 44-54 Doi: 10.15389/AGROBIOLOGY.2014.5.44ENG Murovec, J., Bohanec, B (2012) Haploids and doubled haploids in plant breeding Plant breeding Rijeka, InTech, pp 87–106 Doi: DOI: 10.5772/29982 Ochatt, S.J., Patat-Ochatt, E.M., & Moessner, A (2011) Ploidy level determination within the context of in vitro breeding Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 104(3), 329–341 Doi: 10.1007/s11240-011-9918-6 Olszewska, D., Niklas-Nowak, A., & Nowaczyk, L (2017) Estimation of genetic divergence within androgenic regenerants of Capsicum annuum L ATZ1 × C frutescens L F1 plants using random amplified polymorphic DNA markers BioTechnologia, 98(3), 175–182 Doi: 10.5114/bta.2017.70795 Perera, P.I.P., Perera, L., Hocher V., Verdeil, J., Yakandawala, D.M.D., & Weerakoon, L.K (2008) Use of SSR markers to determine the anther derived homozygous lines in coconut Plant Cell Reports, 27, 1697–1703 Doi: 10.1007/s00299-008-0592-z Ribeiro, C.B., Pereira, F.D.C., Filho, L.D.N., Braz, G.T., Ruy, M.C., Silva, M.B., Cenzi, G., Techio, V.H., & Souza, J.C.D (2018) Haploid identifcation using tropicalized haploid inducer progenies in maize Crop Breeding and Applied Biotechnology, 18(1), 16–23 Doi: 10.1590/1984-70332018v18n1a3 86 ©2023. Cơng nghệ ni cấy tiểu bào tử tạo thể đơn bội thực vật Robarts, D.W., & Wolfe, A.D (2014) Sequence-related amplifed polymorphism (SRAP) markers: a potential resource for studies in plant molecular biology Applications in Plant Sciences, 2(7), 1–13 Doi: 10.3732/apps.1400017 Sari, N., & Solmaz, I (2021) Doubled haploid production in watermelon Doubled Haploid Technology: Volume 3: Emerging Tools, Cucurbits, Trees, Other Species, 97-110 Doi: 10.1007/978-1-0716-1331-3_6 Segui-Simarro, J M (2021) Doubled Haploid Technology Volume 1: General Topics, Alliaceae, Cereals Humana New York, NY Doi: 10.1007/978-10716-1315-3 Sharma, S., Sarkar, D., & Pandey, S.K (2010) Phenotypic characterization and nuclear microsatellite analysis reveal genomic changes and rearrangements underlying androgenesis in tetraploid potatoes (Solanum tuberosum L.) Euphytica, 171(3), 313–326 Doi: 10.1007/s10681-009-9983-7 Shekari, A., Nazeri, V., & Shokrpour, M (2016) Pollen viability and storage life in Leonurus cardiaca L Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, (3), 101-104 Doi: 10.1016/j.jarmap.2016.02.004 Sree Ramulu, K., Dijkhuis, P (1986) Flow cytometric analysis of polysomaty and in vitro genetic inestability in potato PlantCell Reports, 5, 234–237 Doi: 10.1007/BF00269128 Staniaszek, M, & Habdas, H (2006) RAPD technique application for intraline evaluation of androgenic carrot plants Folia Horticulturae, 18(2), 87–97 Stipic, M., & Campion, B (1997) An improved protocol for androgenesis in caulifowers (Brassica oleracea var botrytis) Plant Breeding, 116(2), 153–157 Doi: 10.1111/j.1439-0523.1997.tb02170.x Takahira, J., Cousin, A., Nelson, M.N., & Cowling, W.A (2011) Improvement in efciency of microspore culture to produce doubled haploid canola (Brassica napus L.) by flow cytometry Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 104(1), 51–59 Doi: 10.1007/s11240-010-9803-8 Vieira, M.L.C., Santini, L., Diniz, A.L., de Freitas, M.C (2016) Microsatellite markers: what they mean and why they are so useful Genetics and Molecular Biology, 39(3), 312–328 Doi: 10.1590/1678-4685-GMB-2016-0027 Watts, A., Bondada, R & Maruthachalam, R (2023) Identification of Arabidopsis thaliana haploid plants by counting the chloroplast numbers in stomatal guard cells Plant Physiology Reports Doi: 10.1007/s40502022-00706-4 Chương Phương pháp xác định đơn bội kép 87 Không phần xuất phẩm phép chép hay phát hành hình thức phương tiện không phép Nhà xuất Thông tin Truyền thông Nhà xuất Nông nghiệp NHÀ XUẤT BẢN THÔNG TIN VÀ TRUYỀN THÔNG Chịu trách nhiệm xuất bản: Giám đốc – Tổng Biên tập: TRẦN CHÍ ĐẠT Biên tập sách điện tử: NGUYỄN TIẾN PHÁT – BÙI HỮU LỘ Biên tập nội dung: NGUYỄN TIẾN PHÁT – BÙI HỮU LỘ NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP Chịu trách nhiệm nội dung: Giám đốc – Tổng Biên tập: TS LÊ LÂN Biên tập nội dung: NGUYỄN THỊ DIỄM YẾN Thiết kế bìa: NGUYỄN KHÁNH HÀ Số xác nhận đăng ký xuất bản: 1365-2023/CXBIPH/1-43/TTTT Số Quyết định XB: 66/QĐ-NXBTTTT ngày 10/5/2023 ISBN: 978-604-80-7925-3 Nộp lưu chiểu quý II/2023 II/2023